Artigo de método

Perfil de expressão gênica de célula única usando FACS e qPCR com controles internos

DOI:

10.3791/55219

⸱

25 de fevereiro de 2017

 ,  , 
1Laboratory of Pathology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 2Experimental Transplantation and Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos um método para classificar células individuais de mamíferos e quantificar a expressão de até 96 genes-alvo de interesse em cada célula. Este método inclui o uso de padrões internos de qPCR para permitir a estimativa de contagens absolutas de transcritos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As medições de expressão gênica de populações em massa de células podem obscurecer a considerável variação transcriptômica de células individuais dentro dessas populações. As medições de expressão gênica de célula única podem ajudar a avaliar o papel do ruído na expressão gênica, identificar correlações na expressão de pares de genes e revelar subpopulações de células que respondem de maneira diferente a um estímulo. Aqui, descrevemos um procedimento para medir a expressão de até 96 genes em células únicas de mamíferos isoladas de uma população crescente em cultura de tecidos. As células são classificadas em tampão de lise por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), e as espécies de mRNA de interesse são transcritas e amplificadas reversamente. A expressão gênica é então medida usando uma máquina de PCR microfluídica em tempo real, que realiza até 96 ensaios de qPCR em até 96 amostras por vez. Também descrevemos a geração e o uso de padrões de amplificação de PCR para permitir a estimativa do número absoluto de cada transcrito. Em comparação com outros métodos de medição da expressão gênica em células individuais, essa abordagem permite a quantificação de transcritos mais distintos do que o RNA FISH a um custo menor do que o RNA-Seq.

Introdução

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As células individuais em uma população pode mostrar respostas muito diferentes a um estímulo uniforme fisiológico 1, 2, 3, 4. A variação genética de células numa população é um mecanismo para essa variedade de respostas, mas também existem vários factores não genéticos que podem aumentar a variabilidade das respostas, mesmo numa população clonal de células. Por exemplo, os níveis de proteínas individuais e outras moléculas de sinalização importantes pode variar numa base de célula-por-célula, dando origem a variações nos perfis de expressão de gene a jusante. Além disso, a activação do gene pode ocorrer em rajadas de curta duração de transcritos de 5, 6, que pode ser limitada a um número relativamente pequeno de transcritos por explosão 7, 8, 9. Talestocasticidade em activação do gene pode contribuir grandemente para a variabilidade na resposta biológica e pode proporcionar uma vantagem selectiva em microorganismos e 10 em células de mamífero 1, 2 respondendo a um estímulo fisiológico. Devido às duas fontes genéticos e não genéticos de variação, o perfil de qualquer célula em resposta a um estímulo a expressão do gene pode ser muito diferente da média do perfil de expressão do gene obtido a partir da medição da resposta grandes quantidades. Determinação da extensão à qual as células individuais mostram a variabilidade em resposta a um estímulo requer técnicas para o isolamento de células individuais, a medição dos níveis de expressão de transcritos de interesse, e a análise computacional de dados de expressão resultantes.

Existem várias abordagens para ensaiar a expressão do gene em células individuais, que cobrem uma vasta gama de custos, número de transcritos sondado, eprecisão da quantificação. Por exemplo, uma única célula de RNA-Seq oferece uma grande profundidade de cobertura de transcrição e a capacidade de quantificar milhares de transcritos distintos para os genes mais altamente expresso em células individuais; No entanto, o custo associado com tal profundidade de sequenciação pode ser proibitivo, embora os custos de continuar a diminuir. Por outro lado, uma única molécula de RNA hibridização fluorescente in situ (FISH smRNA) oferece uma quantificação precisa de transcrições, mesmo para baixo expressar genes a um custo razoável por gene de interesse; No entanto, apenas um pequeno número de genes alvo podem ser ensaiados numa dada célula por esta abordagem. Quantitativas ensaios baseados em PCR, descritos neste protocolo, fornecer um meio termo entre essas técnicas. Estes ensaios empregam um real-time PCR máquina microfluídico para quantificar até 96 transcrições de interesse em um momento em até 96 células. Enquanto cada um dos métodos acima mencionados tem custos de hardware requeridas, o custo de qualquer ensaio qPCR indivíduo é relativamentebaixo. Este protocolo é adaptado de um sugerido pelo fabricante de um real-time PCR máquina microfluídico (Protocolo ADP 41, Fluidigm). Para habilitar a estimativa do número absoluto de cada transcrito em uma abordagem baseada em PCR, nós expandimos o protocolo para fazer uso dos controles internos de amplicons do gene alvo preparados que podem ser usados ​​em vários experimentos.

Como um exemplo desta técnica, a quantificação da expressão de genes regulados por o supressor de tumor p53 em células MCF-7 de carcinoma da mama humano está descrito 11. As células são desafiadas com um agente químico que induz quebras de ADN de cadeia dupla. Estudos anteriores demonstraram que a resposta da p53 a ADN quebras de cadeia dupla apresenta uma grande quantidade de heterogeneidade em células individuais, quer em termos de níveis de p53 e 12 na activação de genes alvo distintas 11. Além disso, a p53 regula a expressão de mais de 100bem caracterizado genes alvo envolvidas em numerosas vias a jusante, incluindo a paragem do ciclo celular, a apoptose, senescência e 13, 14. Uma vez que a resposta mediada por p53 em cada célula é complexa e variável, a análise dos benefícios do sistema a partir de uma abordagem em que cerca de 100 genes alvo podem ser sondados simultaneamente em células individuais, tais como os descritos abaixo. Com ligeiras modificações (tais como métodos alternativos para o isolamento de uma única célula e de lise), o protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar uma ampla gama de tipos de células de mamíferos, transcrições e respostas celulares.

Com preparação prévia adequada, uma rodada de separação de células e medição expressão do gene pode ser realizada de acordo com este protocolo durante um período de três dias. O seguinte calendário é sugerido: com antecedência, selecione as transcrições de interesse, identificar e validar os pares de primers que amplificam o cDNA daqueles transcrIPTS, e preparar as normas e misturas de iniciadores que utilizam esses iniciadores. No dia 1, após o tratamento de células, e colheita classificar as células, realizar a transcrição reversa e a amplificação do alvo específico, e tratar as amostras com uma exonuclease para remover os iniciadores não incorporados. No dia 2, realizar o controle de qualidade sobre células classificadas usando qPCR. Finalmente, no dia 3, medir a expressão genética nas células classificadas usando microfluídico qPCR. A Figura 1 resume as etapas envolvidas.

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Protocolo

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1. Preparação Prévia

  1. Escolha até 96 genes de interesse cuja expressão será medido.
    NOTA: Pelo menos um destes genes deve ser um "gene housekeeping", tais como ACTB ou GAPDH, que é conhecido por ser expresso a um relativamente elevado nível constante e sob as condições utilizadas na experiência. Este gene irá ser utilizada para identificar poços ordenadas positivamente (passo 8.1) e amostras amplificadas (passo 10.1).
    NOTA: Para o exemplo experimento, bem caracterizado, alvos diretos de p53 com uma variedade de funções conhecidas 11, 14 e GAPDH como foram selecionados um controle de limpeza. Por favor ver a referência 11 para a lista completa dos genes alvo e sequências iniciadoras usadas neste estudo.
  2. Identificar pares de iniciadores potenciais específicos para os genes de interesse (por exemplo, usando a literatura científica ou de uma ferramenta de desenho de primers tais como Primer-BLAST) 15. Tem o primeré sintetizada e mantê-las numa concentração estoque de 100 mM em água livre de nuclease.
    NOTA: Estes primers deve ser 15-25 bases de comprimento; produzir um fragmento amplificado 90-130 pares de bases (pb) de comprimento; abranger uma junção de exões, se existir, para reduzir a possibilidade de amplificação de ADN genómico; têm temperaturas de fusão de 60 ± 1 ° C; e tem estrutura secundária mínima 16. Estes iniciadores serão utilizados para transcrição reversa privilegiada, amplificar ADNc a partir dos transcritos de interesse, e medir a expressão de genes no DNA qPCR ligação à base de corantes.
  3. Validar os primers.
    1. Em primeiro lugar, obter ADNc a partir das células de interesse. Colheita de ARN a partir das células utilizando um estojo de colheita de ARN de acordo com as instruções do fabricante ou métodos de biologia molecular padrão 17. Reverse-transcrever o ARN em ADNc utilizando um kit de transcrição reversa com hexâmeros aleatórios de acordo com as instruções do fabricante ou meto padrãods 17.
    2. Para cada par de iniciadores, configurar qPCR com corante de ligação a ADN mistura principal, iniciadores directos e inversos, e o ADNc a partir do passo anterior, seguindo as recomendações do fabricante da mistura mestre para as condições de reacção propostas. Executar estas reacções de uma máquina de PCR em tempo real, utilizando um protocolo de ciclos térmicos recomendado pelo fabricante mistura principal que inclui aquisição curva de fusão.
    3. Após a qPCR, executar as amostras de DNA amplificado num W 2% de gel de agarose / v e visualizar o DNA através de um corante intercalante de ADN, seguindo um protocolo padrão 17.
    4. Determinar a eficiência do par de iniciadores com a construção de uma curva padrão a partir de diluições em série de ADNc (fabricado no passo 1.3.1) de acordo com um protocolo padrão 16.
      NOTA: Um bom par iniciador irão gerar uma curva de fusão com uma única, pico bem definido e uma única banda na localização esperada sobre o gel 16, -se class = "xref"> 17 (Figura 2). Se a curva de fusão tem vários picos ou um "ombro", ou se o gel tem múltiplas bandas ou um esfregaço, os iniciadores são amplificar uma sequência fora do alvo. Redesenhar quaisquer iniciadores que têm sido observados para amplificar sequências fora do alvo e repetir os passos anteriores de validação, conforme necessário. Um bom par de iniciadores também terão uma eficiência de 90-110%, com R2 ≥0.985 para a curva padrão de 16; redesenhar quaisquer iniciadores para o qual a eficiência ou R2 queda fora destas gamas.
  4. Prepare os padrões de amplicons DNA purificado.
    1. Para cada par de primers validado:
      1. Amplificar a região de interesse a partir de ADNc, utilizando uma ADN polimerase de alta fidelidade de acordo com as recomendações do fabricante para a polimerase de concentração de iniciador e molde de ADN, condições de reacção e as condições dos ciclos de PCR, ou utilizando um protocolo de PCR convencional"xref"> 17.
      2. Executar o ADNc amplificado num W 2% de gel de agarose / v e visualizar a banda com um corante intercalante de ADN 17. EXCISE a banda que representa o fragmento amplificado utilizando uma lâmina de barbear limpo e colocar a peça de gel num tubo de microcentrífuga.
      3. Purifica-se o fragmento amplificado a partir do gel utilizando um procedimento padrão de extracção de gel, tal como uma extracção à base de agarase 17 ou um kit de extracção de gel de spin-coluna, de acordo com as instruções do fabricante.
      4. Medir a concentração do fragmento amplificado usando um kit de quantificação dsDNA à base de fluorescência de acordo com as instruções do fabricante. Dividir a concentração dsDNA medido pelo peso molecular conhecido do fragmento amplificado com base na sequência amplicão para obter o número de moléculas de amplicon por ul.
      5. Em um tubo de 2,0 mL de microcentrífuga de ligação baixa, adicionar 2 ul do fragmento amplificado purificada até um volume de tampão de suspensão de ADN de tal forma que a concentração final do amplificadorLicon é de 5 x 10 8 moléculas / ul.
    2. Quando todos os produtos de amplificação foram purificados, combinar 18 ul de cada fragmento amplificado purificada num tubo de 2,0 ml de ligação a partir de microcentrífuga. Adicionar tampão de suspensão de ADN para fazer um volume total de 1800 mL; Assim, a concentração de cada fragmento amplificado é de 5 x 10 6 moléculas / ul.
      NOTA: esta mistura, que contém produtos de amplificação de cDNA a partir de todos os genes de interesse em quantidades equimolares conhecidos, irá servir como um padrão em unicelular qPCR.
    3. Vortex este "5E6" padrão completamente, rotação durante 10 segundos a 2.000 xg, e dividir em 20 mL alíquotas em tubos de ligação baixa de PCR. Armazenar as alíquotas a -80 ° C.
  5. Preparar a mistura de amplificação do alvo específico (STA) primário (10x).
    1. Num tubo de 15 ml, combinar 25 ul de 100 uM de cada iniciador de estoque (até 192). Adicionar tampão de suspensão de ADN para fazer um volume total de 5000 ul.
      Note oconcentração de cada iniciador nesta mistura é de 500 nM. Cada placa de células classificadas usará 105,6 ul desta mistura de iniciadores para iniciar a transcrição reversa e amplificação do alvo específico. O volume de mistura de iniciadores dado aqui é o suficiente para fazer 45 placas para classificar. É aconselhável fazer um volume suficientemente grande de mistura de iniciador de modo que ele apenas necessita de ser feita uma vez; dimensionar os volumes conforme necessário.
    2. Misturar bem num vórtice, e dividem-se em 110 mL alíquotas, e armazenar as alíquotas a -20 ° C.
  6. Preparar misturas de ensaio, um para cada par de iniciadores, para uso em qPCR baseado em chip de microfluidos.
    1. Em cada poço de uma placa com 96 poços de PCR, combinar 3,0 ul de iniciador para a frente 100 uM para um dado gene, 3,0 ul de 100 uM iniciador inverso correspondente, 24,0 ul de tampão de suspensão de ADN e 30,0 ul de 2x reagente de ensaio de carregamento .
    2. Vortex esta placa, rotação durante 10 segundos a 500 xg, e armazenar a -20 ° C.
  7. Criar dois programas de ciclos térmicos: RTSTA (transcrição e a amplificação do alvo específico reversa; Tabela 1) e ExoI (exonuclease I tratamento; Tabela 2).

2. Tratamento

  1. Placa as células de mamífero em uma placa de cultura de tecido de tal forma que eles irão crescer até à confluência desejada no momento do tratamento, dependendo das condições do estudo experimental. Para o exemplo apresentado neste estudo, placa de 4 x 10 5 células MCF-7 p53-Vénus 18 por disco de 6 cm em meio RPMI com soro a 10% de bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina, e 250 ng / mL de anfotericina B. Incubar as células durante dois dias a 37 ° C com 5% de CO2 até atingirem 50% de confluência.
  2. Tratar as células para estabelecer a condição de interesse com base no estudo experimental. Para o exemplo apresentado neste estudo, incubar células p53-Vénus MCF-7 com 400 ng / ml neocarzinoestatina durante 3 horas, 8,5 horas, 14 horas ou 24 horas.

3. Tampão de Lise Preparação para a Seleção celular

NOTA: Fazendo uma única placa de lise leva cerca de 1 hora. É aconselhável fazer e tipo múltipla placas, como separação de células pode ser ineficiente e render muitos poços com nenhuma célula detectável.

  1. Limpe o banco, pipetas, suporte de tubos, suportes para pratos de PCR frias, e as luvas com uma solução de DNA de descontaminação em preparação para a PCR.
  2. Dilui-se o inibidor de RNase a 2,64 U / mL por adição de inibidor da ARNase para nuclease isenta de água em um tubo de 1,5 ml.
    NOTA: Este permite inibidor de RNase para ser adicionado ao tampão de lise sem pipetagem de volumes de sub-ul.
  3. Adicione tampão de lise para as células através da combinação dos componentes listados na Tabela 3.
  4. Transferir 92,4 mL do tampão de lise para as células para um tubo separado; este vai ser o tampão de lise para os padrões amplicon.
  5. usando loW de ligação a pontas de pipetas e tubos de microcentrífuga, preparar 200 ul e 500 ul de ADN de E. coli diluídos para 3,1 ug / uL e 6,2 pg / mL, respectivamente, com o tampão de suspensão de ADN.
  6. Adicionar 184.8 ul de / ul ADN de E. coli 3,1 pg E. ao tampão de lise para as células.
    NOTA: O ADN de E. coli portadora serve para alargar o âmbito de possibilidades de ligação não específica do iniciador e, assim, reduzir a probabilidade de que a dimerização iniciador irá levar a um produto de PCR.
  7. Prepare padrões.
    1. Rotular seis tubos de ligação baixa de microcentrífuga como 5e5, 5E4, ... 5e0.
    2. Adicionar 90 ul de tampão de suspensão de ADN para o tubo "5e5".
    3. Adicionar 90 ul de / ul de ADN de 6,2 pg coli E. a cada um dos outros cinco tubos. Mantenha todos os tubos em gelo.
      NOTA: A incorporação de ADN transportador para as normas torna a massa total de ADN nos poços de padrão comparáveis ​​aos que nos poços 1-celulares; isto reduz a probability que a concentração de normas será afectado pela ligação de ADN para tubos ou pontas de pipeta.
    4. Tomar uma aliquota do padrão "5E6" (5 x 10 6 moléculas / uL de cada fragmento amplificado, preparado no passo 1.4) de armazenagem. Vortex brevemente e girar rapidamente (5 seg a 500 xg) para assegurar que o líquido está no fundo do tubo.
    5. Usando uma ponta de ligação de baixo pipeta, adicionar 10 ul de padrão 5E6 ao tubo "5e5". Vortex brevemente, rotação (5 seg a 500 xg), e colocar o tubo de volta no gelo.
    6. Pipetar 10 ul do "5e5" tubo no "5E4" tubo. Vortex brevemente, rotação (5 seg a 500 xg), e colocar de volta no gelo.
    7. Repita essas diluições em série, com cada tubo 10 ul de receber o tubo anterior, até que todos os tubos têm uma diluição do padrão.
  8. Prepare uma fileira de 12 tubos de PCR com tampas. Distribuir 67 ul de tampão de lise "célula" a cada tubo. Tampe os tubos e girar rapidamente (5seg a 500 xg), se necessário.
  9. Utilizando uma pipeta de 12 canais, distribuir 9 ul de tampão de lise "célula" a partir da linha de tubos de PCR em cada cavidade das primeiras linhas 7 de uma placa de PCR (Figura 3).
  10. Distribuir 7 ul de tampão de lise "padrão" para cada uma das cavidades da última fila da placa (Figura 3).
  11. Usando pontas de pipetas de ligação baixa, adicionar 2 ul de padrão para cada poço da linha inferior de acordo com o mapa da placa (Figura 3).
    NOTA: 2 ul de 5 x 10 0 moléculas / valores ul padrão para 10 moléculas, etc.
  12. Adicionar 2 mL de / ul ADN de E. coli 3,1 pg E. nas cavidades 10 e de células de 100 células; adicionar 2 mL de / ul de ADN de 6,2 pg coli E. nas cavidades não-celulares.
    Nota: cada, 10-célula 1-célula e célula-100 tem também 6,2 pg de ADN de E. coli, de uma aproximação da massa de ADN genómico de uma única célula humana. Cada poço padrão e não-célula tem 12,4 pg of E. coli DNA, no valor de cerca de duas células humanas '.
  13. Selar a placa com um selo térmico estéril, centrifugação durante 5 seg a 500 xg, e armazenar a 4 ° C até as células estão prontas para classificação.

Setup Sorter 4. celular

  1. Programar o separador de células activado por fluorescência para classificar em uma placa de 96 cavidades de acordo com o mapa da placa (Figura 3); nenhuma célula devem ser classificados em poços H1-H8 ou H11-H12.
  2. Verifique se o classificador de células é bem voltado para a classificação em uma placa de PCR.
    1. Defina o ângulo do fluxo de tipo ao mínimo possível; Essa configuração aumenta a chance de que as células serão classificados no fundo dos poços, em vez de bater os lados.
    2. Para objectivo da máquina, vedar uma placa de PCR vazio e utilizar o fluxo de teste para "sort" gotas de PBS para a vedação da placa vazia, de acordo com as instruções da máquina 19; as gotículas deveria pousar em the a superfície da vedação numa posição acima do centro do poço. Para obter os melhores resultados, o objectivo verificar a todo o comprimento e largura da placa.
    3. Se as gotículas não pousar na posição correta, limpe-os para fora da superfície do selo, recalibrar o classificador de células de acordo com as instruções do fabricante da máquina, e repetir até que as gotas no fluxo tipo são depositados corretamente.

5. celular colheita e classificação

  1. Trypsinize as células como apropriados para a linha celular. Por exemplo, para as células MCF-7, aspirar o meio a partir das células, lavar as células com 1 ml de tripsina a 0,05%, e incuba-se as células com 2 ml de 0,05% de tripsina durante 5 min a 37 ° C e 5% de CO 2 .
  2. Adicionar 8 mL de meio de cultura de células para as células tratadas com tripsina e transferir todos os 10 mL de suspensão de células para um tubo de 15 ml. Centrifugar durante 4 minutos a 400 x g.
  3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em PBS + 2% FBS.
    NOTA: Um volume de ressuspensão menor concentra as células e facilita a separação de células; um volume de ressuspensão 500 ul funciona bem para uma disco de 6 cm de células a 50% de confluência.
  4. Transferir a suspensão de células para 5 ml de uma tubo de citometria de fluxo, de pipetagem através de um filtro de 40 um para remover aglomerados de células.
  5. Centrifuga-se o prato de tampão de lise a 400 xg durante 30 seg a 4 ° C antes da separação das células para assegurar que o líquido está no fundo dos poços.
  6. Inserir o tubo com a suspensão de células no separador de células. Abra o vedante na placa de tampão de lise e classificar cuidadosamente as células de interesse para a placa de acordo com o mapa da placa e seguindo as instruções do fabricante do classificador de células 19. Para garantir que as células individuais são classificadas com a pureza máxima, executar a máquina em modo "única célula" e usar citometria de fluxo padrão gating com base na dispersão frontal e lateral 19.
    NOTA: Noexemplo experimento, porta as células com base na p53-Venus fluorescência para isolar o mais brilhante de 15% das células individuais 11.
  7. Selar a placa com um novo selo estéril térmica e centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C. Coloque a placa no termociclador e executar o programa RTSTA (veja o passo 1.7).
    NOTA: Este realiza transcrição reversa no ARNm das células classificadas e amplifica-o cDNA das transcrições de interesse.

6. Tratamento com exonuclease

  1. Misture diluído exonuclease I, combinando os componentes indicados no Quadro 4. Prepare uma fileira de 12 tubos de PCR com tampas. Distribuir 30,5 ul de exonuclease I diluída em cada tubo. Tapar os tubos e girar rapidamente (5 seg a 500 xg) para assegurar que o líquido está no fundo do tubo.
  2. Quando o RTSTA estiver concluído, girar a placa de amostra para 5 seg a 500 x g. Utilizando uma pipeta de 12 canais, distribuir 3,6 ul de exonuclease diluídoI em cada poço da placa.
  3. Selar a placa com uma vedação térmica estéril e brevemente rotação (5 seg a 500 xg). Coloque a placa no termociclador e executar o programa ExoI (veja o passo 1.7).
    Nota: Esta etapa degrada quaisquer iniciadores remanescentes após a amplificação do alvo específico para que eles não vão interferir com o futuro PCR.

Diluição 7. Amostra

  1. Quando o tratamento com exonuclease for concluída, adicionar 32,4 mL de tampão TE a cada poço da placa de amostra; este é um ponto de paragem opcional, e as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C durante vários dias.

8. Organizar controlo de qualidade utilizando qPCR

Observação: Como separação de células não é perfeitamente eficaz, este passo é necessário identificar quais os alvéolos da placa ordenada efectivamente recebido uma célula. Essas amostras podem então ser utilizadas para análise posterior.

  1. Medir a expressão de gene de manutenção em cada amostra por qPCR.
  2. Preparar 900 ul de ADN de ligação de corante de qPCR Master Mix para 96 ​​reacções de acordo com os iniciadores de protocolo do fabricante utilizando a polimerase para um dos genes de manutenção seleccionadas no passo 1.1; as concentrações exactas de tampão de reacção, polimerase, iniciadores, etc, para esta reacção dependerão da polimerase específico a ser utilizado.
  3. Distribuir 9 ul de mistura principal para cada poço de uma placa de 96 poços de PCR. Adicionar 1 ml de amostra da placa de amostra para o correspondente poço da placa de PCR.
  4. Executar a placa em uma máquina PCR em tempo real utilizando um protocolo de ciclos térmicos sugerido pelo fabricante ou mestre mistura seguindo um protocolo padrão 20.
  • Analisar os dados qPCR 20; um exemplo de dados a partir de qPCR os passos de controlo de qualidade de classificação listadas abaixo é mostrado na Figura 4.
    1. Verifique se as medições dos poços sem células mostram um nível baixo (ao fundo)da expressão do gene ou nenhuma expressão em todos os.
    2. Verificar que as medições de poços 1-celulares claramente dividir em dois grupos: as amostras positivas com elevada expressão de genes e as amostras negativas com os níveis de base de expressão ou nenhuma expressão em todos os semelhantes, para os poços não-celulares.
      NOTA: As amostras com alta expressão de gene representam células classificadas reais; aqueles com expressão fundo devem ser excluídos da análise posterior.
    3. Verificar que as medições dos poços 10 e 100 células de célula reflectem uma maior expressão de genes do que nos poços 1-célula positiva, permitindo a possibilidade de que poderia causar triagem ineficiente esses poços ter menos células do que o desejado.
    4. Verificar que as medições a partir dos poços de padrão estão uniformemente distribuídas no espaço logarítmica (isto é, que os valores de C T estão uniformemente distribuídos).
  • Depois de identificar todas as amostras 1 de células positivas, fazer um mapa da placa "Sample Mixes" para mapear positiva 1-cell amostras para uma nova placa de 96 poços. Incluem oito poços para padrões neste mapa prato. Ver Figura 5, para um exemplo.

    • Medição Expressão 9. Gene Usando Microfluidic qPCR

    NOTA: Para cada passo nesta secção, pipeta apenas para o primeiro batente para minimizar a formação de bolhas nos reagentes.

    1. Abra uma linha de 8 tubos de PCR. Se houver várias placas de amostras, abrir uma segunda linha de 8 tubos de PCR e rotular os tubos 1-8. Esta linha será para pooling padrões de várias placas.
    2. Em um tubo de 1,5 mL, misturar 360 ul de ADN de ligação de corante de qPCR Master Mix com 36 ul de amostra de ADN de ligação de corante de carga de reagente. Vortex brevemente e girar para 10 segundos a 2.000 x g. Divide-se esta mistura (396 ul) para a linha não marcada de 8 tubos de PCR, colocando 48 ul em cada tubo.
    3. Usando uma pipeta de 8 canais, distribuir 3,3 ul da mistura de reagentes de carregamento mestre / mistura de amostra em cada poçode uma nova placa de 96 poços de PCR. Rotular esta placa, "Sample Mixes".
    4. Para cada placa de PCR de amostras:
      1. Vortex a placa durante 10 segundos e girar para 10 segundos a 500 x g. Remover a tampa e transferir 2,7 uL de cada amostra de 1-célula positiva para o correspondente poço na placa de amostra para a Mistura 1-célula poços indicados no mapa da placa.
      2. Se houver apenas uma placa de amostras, transferir 2,7 uL de cada padrão amplificado a sua cavidade correspondente na amostra Mistura placa de acordo com o mapa da placa.
      3. Se houver várias placas de amostras, transferir 2,7 uL de cada padrão amplificado para a sua posição correspondente na linha rotulada de tubos PCR. Adicionar padrões da placa atual de amostras a todos os padrões já estão lá. Selar a placa de amostras quando feito usando um filme de vedação.
    5. Se houver várias placas de amostras:
      1. Vortex da fileira de tubos de PCR contendo normas para10 seg e girar para 10 segundos a 2.000 x g. Transferir 2,7 ul de cada tubo de padrões mistos para o correspondente poço na placa de amostra Mistura de acordo com o mapa da placa.
    6. Coloque os poços NTC com 2,7 mL de água livre de nuclease, onde indicadas no mapa da placa. Selar a Amostra Mistura placa e armazenar a 4 ° C até ser necessário.
    7. Retire o autocolante da parte inferior de um novo chip microfluídico qPCR. Usando uma seringa de fluido da linha de comando com a tampa ainda, empurre para baixo a cada primavera acumulador para soltá-lo, e injetar cada acumulador com 150-200 mL de fluido da linha de controle.
    8. Inserir o chip na máquina de carregamento e executar o script de "Prime". Isso leva ~ 20 min.
    9. Ao preparar o sistema é feito, de vórtice e girar as placas de misturas de ensaio (preparado no passo 1.6) e misturas de amostra.
    10. Usando uma pipeta de 8 canais, transferir 4,5 uL de cada mistura de ensaio para o lado esquerdo do chip qPCR de microfluidos de acordo com o esquema mencionado G> A Figura 6. Pipeta com muito cuidado para evitar a criação de bolhas de ar no fundo dos poços. Quando terminar, selar a placa de misturas de ensaio e armazenar a -20 ° C para uso futuro.
    11. Transferir 4,5 ul de cada mistura de amostra para o lado direito do chip qPCR de microfluidos de acordo com a Figura 6. Inserir o chip na máquina de carregamento e executar o script "Carregar Mix". Isto leva ~ 90 min.
    12. Ligue o real-time PCR máquina de microfluidos, inicie o software de coleta de dados, e acender a luz para aquecê-la. Isso leva ~ 20 min.
    13. Quando o script de carga Mix é feito, verifique se não existem linhas em todo o chip isso indicaria um problema de carregamento. Remova cuidadosamente as partículas de poeira a partir do chip usando fita adesiva Scotch ou fita laboratório. Insira o chip no real-time PCR máquina de microfluidos e executar o script de coleta de dados. Use o software de análise para inspecionar os resultados e exportar os dados para análise posterior.
    _title "> 10. Análise de Dados
    1. Retirar as medições para as quais as curvas de amplificação qPCR mostram uma fraca qualidade (isto é, para os quais as curvas não se assemelham a curva sigmoidal de amplificação padrão) 20.
    2. Retirar amostras com mais de 30 de baixa qualidade ou de zero ou medições para as quais a expressão do gene de arrumação (ver passo 1.1) é muito mais baixa do que a maioria das outras amostras (Figura 7).
    3. Para cada gene, estimar a localização de pico de fusão correcta como a mediana dos locais pico de fusão a partir de cada amostra. Se uma medição tem um pico de fusão localizada a mais de 1 ° C a partir da mediana, remova que a medição da consideração 20.
    4. Para cada gene, criar uma curva padrão para estimar a contagem de mRNA em cada amostra usando uma planilha ou linguagem de script 20.
      NOTA: As normas deste experimento consistem de 10, 100, 1.000, ou 10.000 moléculasde ADNcd correspondente a cada transcrito de interesse. Se a transcrição reversa foram perfeitamente eficaz, os padrões que corresponderia a 20, 200, 2000 e 20000 moléculas de mRNA, uma vez que o ARNm e ADNc são de cadeia simples. Na prática, isto não é o caso, por isso, expressa como uma estimativa medições em unidades de moléculas × e RT, onde RT E é a eficiência da transcrição reversa.
      1. Para cada poço padrão, identificar m, o número de moléculas de ADNcs (duas vezes o número de moléculas de dsDNA) antes da amplificação (por exemplo, 20 a 200 moléculas, moléculas, etc.).
      2. Para cada poço padrão, identificar o valor t C de qPCR 20.
      3. Com os valores para m e C t, executar uma regressão linear usando a seguinte equação para gerar uma curva padrão com os parâmetros a e b para cada gene, e encontrar o valor de R 2 como umIndicador de n da bondade de ajuste:
        figure-protocol-1
      4. A partir da curva padrão, calcular a eficiência da PCR para cada gene de E:
        figure-protocol-2
        NOTA: o valor de E muito superiores a 1,0 (por exemplo, E> 1,1) não é fisicamente realista; um valor de R 2 para a regressão linear muito menos do que 1.0 (por exemplo, R 2 <0,985) significa que os padrões não estão a funcionar de forma fiável. Estes problemas geralmente indicam que o padrão mais baixo amplicão desce abaixo de um limite de quantificação fiável, e, assim, o padrão mais baixo deve ser excluída da regressão linear. Se uma regressão linear adequada não pode ser feita usando pelo menos três padrões únicos, descartar as medições de expressão para o gene.
      5. Se a regressão linear é adequada, usar os parâmetros de ajuste resultante a e b </ em> para cada gene para estimar o número de moléculas de mRNA est m (em unidades de moléculas × e RT) para o gene correspondente em cada amostra de célula única do valor medido de C T:
        figure-protocol-3
      6. Designar qualquer medição m est <1 como m est = 0. Além disso, designar qualquer medida sem amplificação na qPCR e, portanto, nenhum valor t C como m est = 0.
        NOTA: Medições com um m est inferior ao menor ou maior do que o padrão mais elevado utilizado na regressão são encontrados, por extrapolação a partir da curva padrão. Estas estimativas não são necessariamente inválida, mas deve ser considerada com cautela.
    5. Visualize os dados de expressão de genes de uma única célula.
      1. Faça um gráfico beeswarm (Dorn, J. e Santo, T., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange / 37105), no qual cada ponto representa a expressão génica em uma célula em particular; um exemplo é mostrado na Figura 8.
      2. Fazer um lote violino (Dorn, J., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661) em que a largura do "violino" representa a frequência das medições de expressão de genes em torno de um determinado nível no população de células analisadas; um exemplo é mostrado na Figura 8.
        NOTA: análises mais sofisticadas podem sondar os relacionamentos na expressão entre os pares de genes 21, 22 e pode-se inferir redes de expressão gênica.

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    Resultados

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Uma visão geral do protocolo é demonstrado na Figura 1, incluindo os passos para o tratamento de células, o isolamento de células isoladas por FACS, a geração e a pré-amplificação de bibliotecas de ADNc a partir de lisados de célula única, a confirmação de bibliotecas de cDNA de uma única célula em poços classificadas, e a medição da expressão gênica por qPCR.

    Na preparação para o isolamento de uma única célul...

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    Discussão

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Nós apresentamos um método para o isolamento de células de mamíferos individuais a partir de uma população de células aderentes cultivadas em cultura e para ensaiar a expressão de genes de aproximadamente 96 em cada célula. Bom preparação prévia é crítico para este método funcione bem. Em particular, concepção e teste de iniciadores específicos para os pares de transcritos de interesse (passos 1,2-1,3) são demorados passos importantes, mas, como os iniciadores de determinar a qualidade das medições de uma única célula. ...

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    Divulgações

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Os autores não têm nada a divulgar.

    Agradecimentos

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Nós gostaríamos de agradecer a V. Kapoor na CCR ETIB Citometria de Fluxo do núcleo para sua ajuda na realização da separação de células durante o desenvolvimento deste protocolo. Agradecemos também a M. Raffeld ea Unidade de CCR LP Diagnóstico Molecular e J. Zhu eo NHLBI DNA Sequencing and Genomics núcleo por sua ajuda na realização do qPCR durante o desenvolvimento deste protocolo. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Intramural do NIH.

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    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    RNeasy Plus Mini KitQiagen74134
    Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade com inibidor de RNaseThermoFisher4374966
    Phusion DNA polimerase de alta fidelidadeKit de extração de
    gel QIAquickQiagen28704
    Quant-iT Kit de ensaio de dsDNA de alta sensibilidadeThermoFisherQ33120 
    Tubos de microcentrífuga de baixa adesão de 2,0 mlEUA Scientific1420-2600
    DNA Suspension BufferTeknovaT0221
    Axygen 0,2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes CorningPCR-02-LC
    GE 96,96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Kit de Reagentes de Carregamento de EnsaioFluidigm100-3415
    HyClone RPMI 1640 SoroFetal GE Healthcare Life SciencesSH30027.01
    , Certificado (EUA)ThermoFisher16000-044
    Solução Antibiótico-AntimicóticaCorning30-004-CI
    NeocarzinostatinSigmaN9162
    ELIMINaseDecon Labs1101
    SUPERase-InThermoFisherAM2696
    CellsDirect One-Step qRT-PCR KitThermoFisher11753500
    E. coli DNAAffymetrix14380 10 MG
    ThermalSeal Filme de Vedação, EstérilExcel ScientificSTR-THER-PLT
    BD FACSAria IIuBD Biosciences
    HyClone Tripsina 0.05%GE Healthcare Life SciencesSH30236.01
    PBS, 1xCorning21-040-CV
    Falcon 40 µ Filtro de células mCorning352340
    Exonuclease INew England BioLabsM0293S
    SsoFast EvaGreen Supermix com baixo ROXBio-Rad172-5210
    96.96 Dynamic Array IFC para expressão gênica (chip qPCR microfluídico)FluidigmBMK-M-96.96
    IFC Controller HX (máquina de carregamento)Fluidigm
    BioMark ou BioMark HD (máquina de qPCR microfluídica)Software
     Software Fluidigm
    MATLABMathWorks
    Bovino de análise de PCR em tempo real Fluidigm

    Referências

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