Células Humanas Lung dendríticas: distribuição espacial e fenotípica Identificação em endobrônquica Biópsias imunohistoquímica e citometria de fluxo

Resumo

As células imunes residentes no pulmão, incluindo células dendríticas (DCs) em humanos, são essenciais para a defesa contra patógenos e alérgenos inalados. No entanto, devido à escassez de tecido pulmonar humano, os estudos são limitados. Este trabalho apresenta protocolos para processamento de biópsias endobrônquicas da mucosa humana para estudo de DCs pulmonares usando imuno-histoquímica e citometria de fluxo.

Resumo

Os pulmões estão constantemente expostos ao ambiente externo, que além de partículas inofensivas, também contém patógenos, alérgenos e toxinas. Para manter a tolerância ou induzir uma resposta imune, o sistema imunológico deve lidar adequadamente com os antígenos inalados. As células dendríticas pulmonares (DCs) são essenciais para manter um equilíbrio delicado para iniciar a imunidade quando necessário, sem causar danos colaterais aos pulmões devido a uma resposta inflamatória exagerada. Embora haja uma compreensão detalhada do fenótipo e da função de células imunes, como DCs no sangue humano, o conhecimento dessas células em tecidos menos acessíveis, como os pulmões, é muito mais limitado, uma vez que estudos de amostras de tecido pulmonar humano, especialmente de indivíduos saudáveis, são escassos. Este trabalho apresenta uma estratégia para gerar caracterização espacial e fenotípica detalhada de DCs residentes no tecido pulmonar em humanos saudáveis que são submetidos a uma broncoscopia para a amostragem de biópsias endobrônquicas. Várias pequenas biópsias podem ser coletadas de cada indivíduo e podem ser posteriormente incorporadas para seccionamento ultrafino ou digeridas enzimaticamente para análise avançada de citometria de fluxo. Os protocolos descritos foram otimizados para produzir o máximo de informações de pequenas amostras de tecido que, em condições de estado estacionário, contêm apenas uma baixa frequência de DCs. Embora o presente trabalho se concentre em DCs, os métodos descritos podem ser expandidos diretamente para incluir outras células (imunes) de interesse encontradas no tecido pulmonar da mucosa. Além disso, os protocolos também são diretamente aplicáveis a amostras obtidas de pacientes portadores de doenças pulmonares em que a broncoscopia faz parte do estabelecimento do diagnóstico, como doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), sarcoidose ou câncer de pulmão.

Introdução

Os pulmões estão em contato contínuo com o ambiente externo e estão altamente expostos a ambas as partículas inofensivas e micróbios com a capacidade de causar doença. Portanto, é crítica para o sistema imunitário para montar respostas imunitárias potentes contra patogénios invasores, mas é igualmente importante para manter a tolerância a antigénios inalados que não causam doença. Para fornecer potente vigilância imunitária, o sistema respiratório é revestido com uma rede de células imunitárias, incluindo as células dendríticas (DC). DC são células profissionais de apresentação de antigénio, com a capacidade única para activar células T ingénuas. Em pulmões humanos, as DCs residentes encontram um antigénio e, em seguida, processo e transportá-lo para os gânglios linfáticos de drenagem do pulmão para a apresentação e a activação de células T ^{1, 2, 3.}

No sistema imunológico humano, as DCs pode ser dividido em vários sub-grupos, com Distinct mas sobrepostos funções: CD1c ⁺ e CD141 ⁺ DCs mielóides (MDCs) e CD123 ⁺ DCs plasmocitóides (PDCs) ^{4, 5.} Enquanto o conhecimento mais detalhado em DC humanas provém de estudos em sangue, é agora evidente que os pulmões humanos também abrigam populações raras de subconjuntos de DC com a capacidade de células T estimuladoras ^{6, 7, 8, 9.} No entanto, os dados mostram que se acumulam as células imunitárias, incluindo as DCs, diferem na sua frequência, fenótipo e função, dependendo da sua localização anatómica ^10. Assim, é importante para estudar as células imunes do tecido relevante para compreender a sua contribuição para a imunidade local e tolerância. Tomados em conjunto, o que sublinha a necessidade de estudar DCs pulmão residente quando confrontados com doenças pulmonares, apesar de DCs do sangue sendo mais prontamente disponíveis e acessíveis em humanos.

Os primeiros estudos que investigaram DCs pulmão residente em seres humanos se baseou principalmente na morfologia ea expressão de marcadores individuais, tais como HLA-DR e CD11c, em secções de tecido usando imunohistoquímica ^{11, 12, 13.} Em contraste, estudos mais recentes têm normalmente dependiam de citometria de fluxo analisa a estudar diferentes subpopulações de células imunes. No entanto, uma vez que é difícil encontrar um único marcador de superfície celular que identifica exclusivamente um subconjunto específico DC, a limitação potencial de estudos que se aplique apenas quatro cores de citometria de fluxo é o risco de, incluindo populações de células com marcadores fenotípicos semelhantes, como DCs. Por exemplo, CD11c é expressa em todos os DCs mielóides e a grande maioria dos monócitos. Por outro lado, estudos em painéis de aplicação mais avançada de citometria de fluxo, o tecido de pulmão não-cancerosas de ressecções cirúrgicas de pacientes foram tipicamente utilizadosrefex "> ^{10, 14, 15, 16,} embora não esteja claro se estas populações raras são verdadeiramente representativa de DCs presente em indivíduos saudáveis. No geral, os estudos são limitados, em grande parte devido ao facto de cirurgicamente removidas ou de tecido de pulmão humano total é escassa.

Para superar algumas destas limitações, este trabalho descreve como realizar uma análise detalhada da distribuição espacial e uma identificação fenotípica de DCs em biópsias endobrônquicas mucosas obtidas de voluntários saudáveis ​​que se submetem a uma broncoscopia. Várias pequenas biópsias podem ser coletadas de cada indivíduo e pode, posteriormente, ser incorporado para corte e análise utilizando imuno-histoquímica ou enzimaticamente digerido para análise avançada de citometria de fluxo. Utilizando tecido pulmonar sob a forma de biópsias endobronquiais obtidos a partir de broncoscopia confere a vantagem de tornar possível realizar o rudy em voluntários saudáveis, ao contrário da cirurgia aberta dos pulmões que, por razões óbvias, é limitado a pacientes que necessitam de cirurgia torácica. Além disso, o tecido que é amostrado durante uma broncoscopia de voluntários saudáveis ​​é fisiologicamente normal, em contraste com uma área não afectada do tecido pulmonar em pacientes com uma doença pulmonar. Por outro lado, as biópsias são pequenos e o número de células recuperadas, mesmo quando o agrupamento diversas biópsias, limita o tipo de análises que podem ser realizadas.

Embora o presente trabalho se concentra em DCs, os métodos descritos podem ser diretamente ampliada para incluir outras células (imunes) de interesse que residem no tecido da mucosa do pulmão humano. Além disso, os protocolos são também directamente aplicáveis ​​às amostras obtidas de pacientes que sofrem de doenças pulmonares, onde broncoscopia faz parte de estabelecer o diagnóstico, tais como a doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), sarcoidose, ou câncer de pulmão.

Protocolo

NOTA: Esta pesquisa foi aprovada pelo Conselho de Revisão Ética regional no Umeå, na Suécia.

1. A broncoscopia para Amostragem endobrônquica Biópsias de Seres Humanos

1. Obter o consentimento informado de todos os participantes.
2. Tratar indivíduos com midazolam oral (4-8 mg) e glicopirr�nio intravenosa (0,2-04 mg) 30 minutos antes da broncoscopia. Aplicar anestesia tópica com lidocaína na laringe e os brônquios. Deixe o gargarejo assunto com ~ 3 ml de lidocaína 4% e aplicar 3 ml à base da língua e na laringe através de uma seringa laringe. Otimizar a anestesia tópica com 8-10 doses de lidocaína spray. Realizar esta etapa com a estar sujeito.
3. Inserir um broncoscópio de vídeo flexível pela boca através de um bocal de plástico com o sujeito na posição supina. Use um cateter de pulverização feita de propósito para completar a anestesia tópica da traquéia distal e brônquios através do broncoscópio. Aqui, utilizar uma dose de aproximadamente5-10 ml de lidocaína a 2%.
4. Tome 6-9 biópsias da mucosa endobrônquica da carina principal e as principais divisões brônquicas usando uma pinça fenestrados (Figura 1). Após a broncoscopia e antes de deixar o hospital, deixar o resto assunto para 2-4 horas e fornecer a ele / ela com uma refeição ligeira.

2. Incorporação das biópsias em Glicol Metiloacrilado (GMA) Resin

NOTA: O protocolo imunocoloração GMA foi originalmente desenvolvido na Universidade de Southampton, Unidade histoquímica Investigação ^17.

1. Fixação: Para imuno-histoquímica, remover as biópsias do fórceps e colocá-las directamente em frascos de vidro contendo 3 ml de inibidores de acetona e protease desidratados gelado (fluoreto de fenilmetilsulfonilo (35 mg / 100 ml de acetona) e iodoacetamida (370 mg / 100 ml de acetona )). Corrigir o tecido durante a noite a -20 ° C (Figura 2).
   NOTA: Os seguintes passos devem ser performada em um exaustor com luvas de borracha nitrílica apropriadas. O kit incorporação contém componentes que podem causar reações de sensibilização, irritação e / ou de pele alérgica. Todos os resíduos devem ser eliminados como resíduos perigosos.
2. Desidratação: Remover a acetona com inibidores e substituir com acetona desidratada fresco (sem inibidores) durante 15 min à temperatura ambiente (TA). Remova a acetona e substituí-lo com benzoato de metilo em 15 min.
3. Infiltração: Prepara-se uma solução de processamento da solução de benzoato de metilo 5% em monómero de metacrilato de glicol; 10 ml é suficiente para um frasco para injectáveis. Usando pipetas de Pasteur de plástico, de aspiração a partir da solução de benzoato de metilo e substituir com 3 ml de solução de processamento. Incubam-se as biópsias e solução de processamento em excesso a 4 ° C durante 2 horas; Pipetas de Pasteur pode ser usado para todas as alterações de solução subsequentes, incluindo a incorporação de solução.
4. Troque a solução de processamento a cada 2 horas (3x 2 incubações hr), de modo que o tempo total de infiltração do biopsies na solução de transformação é de pelo menos 6 horas. Inserir etiquetas de papel para dentro da extremidade superior das cápsulas de embebimento para identificar as biópsias.
5. Prepara-se uma solução de incorporação de 75 mg de peróxido de benzoílo em 10 mL de monómero metacrilato de glicol. Adicionar 0,25 ml de N, N-dimetilanilina poli (óxido de etileno) (acelerador) à solução de incorporação para iniciar a reacção de polimerização. Remover a solução de transformação e colocar uma biópsia de dentro da cápsula incorporação relevante usando uma pinça.
6. Lentamente encher a cápsula incorporação ao topo com uma solução de incorporação e fechar a tampa. Evitar perturbar a biópsia e criando grandes bolhas de ar. Incubam-se as cápsulas a 4 ° C até que a resina tenha polimerizado completamente.
7. Armazenar as biópsias incorporados a -20 ° C em um tubo de 50 ml contendo cerca de 5 g de gel de sílica.

3. Seccionamento de endobrônquicos Biópsias GMA-encaixados

1. revestimento de lâmina de microscópio: Lavar as lâminas de microscópio em ummáquina de lavar louça num ciclo normal. Cobrir os slides e permitir-lhes a secar ao ar.
2. Prepara-se uma solução de revestimento de 10% de poli-L-lisina solução (PLL) em água destilada. Submergir as lâminas em solução de revestimento para 5 min, e depois deixá-los secar ao ar. Armazenar lâminas revestidas com PLL secos em suas caixas originais.
3. Lavar as tiras da folha de vidro com 0,1% de Tween 20 em água destilada. Lavar o copo com 70% de etanol e seco com toalhas de papel. Cortar lâminas de vidro da faixa de vidro usando um fabricante de faca. Armazenar as lâminas num recipiente que impede o movimento para garantir que a aresta de corte não seja danificada ou cortada.
4. Biópsia aparar: Coloque a cápsula biópsia em um divisor de cápsula e reduzir cada lado usando uma lâmina de ponta única em aço carbono. Remova a biópsia GMA-incorporado e coloque-a firmemente em um vício. Apare o excesso GMA de todo o biópsia usando a lâmina de aço.
5. seccionamento GMA.
   1. Preparar uma solução de amoníaco a 0,05% com água destilada. Coloque a faca de vidro e biópsia em the micrótomo. alinhar cuidadosamente o bloco de biópsia com a lâmina, ajustando o suporte da faca e o ângulo do bloco de biópsia de modo que a lâmina assenta plana contra a superfície do bloco.
   2. Corte 2 mm de espessura utilizando o micrótomo em uma velocidade de corte lento e utilize uma pinça para transferir e flutuar as seções sobre a água de amônia. Flutuar as seções de 45-90 segundos, permitindo a recuperação antigênica gentil e desdobramento da seção.
   3. Pegar seções com lâmina de microscópio. Verifique a histologia da biópsia pela coloração rapidamente com azul de toluidina.
   4. Secam-se as lâminas em conjunto uma placa quente a 50 ° C e aplica 500 ul de corante azul de toluidina filtrou-se para uma secção utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico. Aqueça a seção sobre a chapa quente até um anel verde começa a surgir na borda da mancha, e, em seguida, lave-a com água.
   5. Usando um microscópio de luz, verifique a histologia biópsia. Secções utilizados para imuno-histoquímica deve conter boas áreas da lâmina não danificadopropria e do epitélio, com o menor número de glândulas e tão pouco músculo liso possível.
   6. Como no ponto 3.4.2, cortar seções que têm boa histologia e buscá-las com lâminas de microscópio PLL-revestidos para coloração imuno-histoquímica. Cortar, pelo menos, duas secções de cada biópsia para análise. lâminas secar por pelo menos 1 hora. Depois da secagem, as secções podem ser embrulhados em papel de alumínio e armazenadas a -20 ° C durante até 2 semanas, ou eles podem ser imediatamente imunocoradas.

4. imuno Coloração de endobrônquicos Biópsias GMA-encaixados

NOTA: A azida sódica é tóxica. Preparar a solução de azida de sódio a 0,1% dentro de um extractor de fumo e de distância a partir de ácidos. Em contacto com ácidos liberta gases tóxicos.

1. Desenhar em torno seções usando uma caneta com ponta de diamante e organizar os slides em um rack de coloração.
2. Execute um bloco peroxidase. Prepara-se uma solução de bloqueio da peroxidase de peróxido de hidrogénio a 0,3% em solução de azida de sódio a 0,1%. Apply 1 ml de peroxidase para o bloco de secções e incubar durante 30 min.
3. Prepara-se uma solução de lavagem com solução salina 0,05 M tamponada com Tris (TBS), pH 7,6. Lavar as lâminas em TBS, 3x 5 min.
4. Prepara-se uma solução do bloco de BSA a 1% em DMEM. Fazer isso com antecedência e em volumes grandes, alíquota e congelá-lo até que seja necessário. Escorra os slides e incubar as seções de solução de bloco para 30 min para bloquear anticorpo inespecífico vinculativo. Se a ligação não específica ainda ocorre, incluem um passo de incubação de 30 minutos com 5% de soro de bloco a partir das mesmas espécies como o anticorpo secundário.
5. Dilui-se o anticorpo primário (CD45 ou CD1a) em TBS até à concentração desejada (CD45 diluído a 1: 1000; CD1a diluído a 1: 1,00) e aplicá-lo a slides. Lamela as seções e incubar durante a noite à temperatura ambiente.
6. Lavar as lâminas em TBS três vezes. Dilui-se o anticorpo secundário biotinilado (dirigido contra as espécies hospedeiras anticorpo primário, no caso de coelho anti-rato F (ab _'2)) em TBS até à concentração desejada (1:300 diluição) e aplicá-lo aos slides. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente.
7. Prepara-se uma estreptavidina-peroxidase de biotina complexo de pelo menos 30 min antes da utilização. Certifique-se de que não é suficiente para cobrir todos os slides. Lavar as lâminas em TBS três vezes. Aplicar a solução para as lâminas e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente.
8. Lavar as lâminas em TBS três vezes. Preparar 3-amino-9-etilcarbazole solução de substrato de peroxidase (AEC) (feita segundo as instruções do fabricante). Aplicá-lo para as lâminas e incubar durante 20-30 minutos ou até que a intensidade da coloração desejada desenvolve.
9. Lavar as lâminas em água corrente durante 5 min. Contracoloração das secções com solução de hematoxilina de Mayer filtrada por 2 min. Lavar as lâminas em água corrente durante 5 minutos.
10. Escorra as lâminas e cobrir as seções com meio de montagem aquoso permanente. Seca-se as lâminas a 80 ° C num forno de secagem. Permitir que os slides para esfriar, e depois montá-los com DPX e colocar uma lamela.

5. StAnálise aining

1. Analisar as secções de ampliação de 40X usando um microscópio óptico com uma câmara montada ligado a um computador.
   NOTA: Para a análise celular, contagem positivamente coradas, as células nucleadas na lâmina própria e epitélio brônquico intacto, excluindo as áreas de músculo liso, glândulas, grandes vasos sanguíneos e tecido incompatíveis ou danificado.
2. Calcular a média dos contagens de células e corrigir a contagem celular média para a região da lâmina própria e o comprimento do epitélio. A área da lâmina e o comprimento do epitélio pode ser calculado utilizando um programa de análise de imagem.

6. Digestão Enzimática de endobrônquico Biópsias

1. Biópsias de lavagem: Utilizando fórceps estéreis, lugar biópsias intactas num tubo cónico de 15 ml contendo 10 ml de solução salina tamponada de Hank (HBSS) (Figura 3). Incubar durante 5 min à temperatura ambiente numa plataforma de agitação a 30 rpm. Transferir as biópsias para um d estérilish por decantação o conteúdo do tubo de 15 ml com HBSS.
2. Interrompendo muco com DTT: Substituir a HBSS no tubo com 10 ml de HBSS contendo 5 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT). Transferir as biópsias de volta para o tubo de 15 ml usando uma pinça estéril. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente numa plataforma de agitação a 30 rpm.
3. Vortex suavemente o tubo por 15 s. Transferir as biópsias num prato esterilizado por decantação o conteúdo do tubo de 15 ml com HBSS e DTT.
4. Transferir as biópsias para o meio de cultura: Substituir a HBSS e DTT no tubo com 10 ml de meio de cultura RPMI 1640. Transferir as biópsias de volta para o tubo de 15 ml usando uma pinça estéril. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente numa plataforma de agitação a 30 rpm.
5. A digestão com colagenase biópsias e ADNase.
   1. Prepara-se uma solução de digestão de colagenase II (0,25 mg / ml) e ADNase (0,2 mg / ml) em RPMI pré-aquecido contendo uma solução 1 M de HEPES. Adicionar 500 uL de solução de digestão por poço numa culto de tecido de 48 poçosplaca ure.
   2. Coloque uma biópsia por poço em solução digestão. Incubar a placa sobre uma plataforma de agitação durante 60 min a 37 ° C a 220 rpm. Pipeta-se para baixo e depois de 30 minutos para re-dispersam as biópsias, e após 60 min, para desagregar o tecido completamente.
6. Preparação de suspensões de células únicas.
   1. Piscina em conjunto as biópsias digeridos a partir dos poços para um tubo de 50 mL passando-a através de um filtro celular de 40 uM. Recolher os restantes células por lavagem dos poços com tampão de FACS gelada (soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) contendo soro fetal bovino a 2%).
   2. Apertar o tecido remanescente no filtro de células utilizando a parte de trás do êmbolo de uma seringa. Centrifugar as células digeridos a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Cuidadosamente remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão de FACS gelada. Contar as células utilizando um hemocitómetro e manualmente Tripano mancha azul para avaliar a viabilidade das células.

7. Análise citométrica de fluxo de células individuais de endobrônquica biópsias após digestão enzimática

1. Ressuspender o sedimento celular a aproximadamente 1 X 10 ⁶ células em 200 ul de tampão de FACS.
2. Adicionar um corante de viabilidade celular para a exclusão de células mortas de acordo com o protocolo do fabricante.
3. Adicionam-se 5 ul de reagente de bloqueio FcR e incubar durante 5 min a 4 ° C.
4. Adicionar anticorpos de superfície celular contra CD45 (2 ul), linhagem (CD3, CD20, CD56, CD66abce, e CD14; 2 ul cada), CD16 (0,5 mL), HLA-DR (3 mL), CD11c (5 ul), CD123 (5 ul), CD1c (3 mL), e CD103 (2 uL) e incubar durante 15 min a 4 ° C. Detalhes sobre anticorpos pode ser encontrado na secção Métodos, mas dosear e optimizar os anticorpos para o fluxo preciso citómetro em uso. Lavar anticorpos em excesso com PBS durante 5 min a 400 x g. Adquirir as amostras frescas em um citômetro de fluxo ou corrigir as células em paraformaldeído 1% antes da acquisit tardeíon.
5. Identificar DC humanas em biópsias pulmonares utilizando um ensaio de citometria de fluxo de ¹⁸ (Figura 4).
   NOTA: Usando uma citometria de fluxo de software de análise, as células imunes são distinguidos de outras células do pulmão por gating em CD45. As células mortas pode ser excluída como células que são positivas para o corante VIVO / MORTO. De todos CD45 ⁺ células vivo, células de linhagem (células B, células T, células NK, neutrófilos e monócitos) pode ser excluída usando um cocktail de anticorpos contra CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14, e CD16 em um canal. Seguindo que as células, HLA-DR ⁺ permitirá a identificação de todos os DCs humanas. MDCs pode ser distinguida de PDC com base na expressão de CD11c ou a falta de CD11c, respectivamente. MDCs pode ainda ser dividido em cd1c ⁺ MDCs ou CD141 ^+.

Resultados

Estudos que caracterizam as células do tecido residente respiratórias humanas imunes, incluindo as DCs, são limitadas, principalmente devido ao fato de que cirurgicamente removidas ou de tecido de pulmão humano total é escassa. Aqui, um método menos invasivo de obtenção de tecido de pulmão a partir de biópsias endobronquiais (EBB) de voluntários saudáveis ​​e os protocolos desenvolvidos para estudar as células do sistema imunológico no tecido usando imuno-histoquímica ou citometria de fl...

Discussão

Este artigo descreve como gerar uma caracterização espacial e fenotípica detalhada do pulmão DCs tecido residentes em humanos saudáveis ​​utilizando imuno-histoquímica e citometria de fluxo em biópsias da mucosa endobrônquica recolhidos durante broncoscopia. Nos parágrafos seguintes etapas críticas do protocolo são discutidos em detalhe.

Passos críticos com o Protocolo

Seccionamento e imuno-histoquímica: É crítico para manter os blocos de biópsia a -20 ° C quando nã...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Broncoscopia
Broncoscópio BF1T160	Olympus	BF1T160
Fonte de luz	Pinça Olympus	Exera CV-160
Fenestrada	Olympus	FB21C	Usado para fazer biópsias
Bite Block	Conmed	1429	20 mm x 27 mm
Glicose 25%			500 ml
de brometo de glicopirrônio intravenoso 0,2 mg / ml			intravenoso. Previne a secreção de muco/saliva
Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o			Pode ser usado para relaxamento extra
Lidocaína, 40 mg/ml			Administração de boca e garganta / Gargarejo
Lidocaína 100 mg/ml spray			Administrado na parte de trás da garganta
Lidocaína 20 mg/ml spray			Administrado via broncoscópio nas vias aéreas
GMA processamento e incorporação
Frascos de			5 ml
Acetona	Sigma-Aldrich	32201-1L
Peneiras moleculares, 4 Å	Alfa Aesar	88120	Pellets de 3-4 mm de diâmetro
Fluoreto de fenilmetilsulfonil	Sigma-Aldrich	P-7626	0,035 g/100 ml acetona
Iodoacetamida	Sigma-Aldrich	I-6125	0,37 g/100 ml acetona
Polietileno-plano  Cápsulas de incorporação TAAB	TAAB laboratories	C094	500x 8 mm de diâmetro, polietileno, cápsulas de fundo plano
Suporte de cápsulas	TAAB laboratories	C054	Contém 25 cápsulas de 8 mm
JB-4 Kit de incorporação GMA	Polysciences	00226	Contém JB-4 Solução A (0026A-800), JB-4 solução B (0026B-3.8), peróxido de benzoíla (02618-12)
Benzoato de metila	Sigma-Aldrich	27614-1L
Gel de sílica com indicador de umidade	Scharlau	GE0043	2.5-6 mm
GMA sectioning
Lâminas de microscópio de vidro	ThermoFisher Scientific	10143562CEF	Bordas cortadas, extremidade fosca
Solução de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P8920-500mL	1:10 para solução de trabalho
Tiras de vidro em folha para ultramicrotomia	Alkar
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Wash solução (0,1% Tween20)
LKB 7800B Fabricante de facas	LKB
Divisor de cápsulas	TAAB laboratories	C065
Lâminas de aço carbono de borda única	TAAB laboratories	B054
Vice
Amônia, 25%	VWR	1133.1000	2 ml em 1 L, 1:500 (0,05%)
Micrótomo	Leica		Leica RM 2165
Fonte de luz	Leica		Leica CLS 150 XE
Microscópio com suporte de braço oscilante	Leica		Leica MZ6
GMA Immunohistochemistry
Diamond tip pen	Histolab	5218
Solução de peróxido de hidrogênio a 30%	AnalaR Normapur	23619.264
Azida de sódio	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
Cloreto de sódio	VWR produtos químicos	27810.295
Albumina de soro bovino	Millipore	82-045-2	Probumina BSA grau diagnóstico
Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546
Anticorpo CD45 anti-humano	BioLegend	304002	Camundongo monoclonal, clone HI30, isotipo IgG1k. Concentração de trabalho de 500 ng/ml
Anticorpo anti-CD1a humano	AbD Serotech	MCA80GA	Monoclonal de camundongo, clone NA1/34-HLK, isotipo IgG2a. Concentração de trabalho de 10 µ g/ml
Controle de isotipo monoclonal IgG1	de camundongo Abcam ab27479
Controle de isotipo monoclonal IgG2a de camundongo	Dako	X094301-2
Vectastain ABC Elite kit padrão	Vector Labs	PK-6100
AEC (3-amino-9-etilcarbazol) peroxidase substrato kite	Vector Labs	SK-4200
Mayers hematoxilina	HistoLab	01820
Meio de Montagem Aquosa Permanente	AbD Serotech	BUF058C
Forno
DPX solução de montagem permanente	VWR	360292F
Microscópio de luz	Leica		Leica DMLB
Câmera de microscópio	Leica		Leica DFC 320
Software de análise	Leica		Leica Qwin V3
Digestão enzimática
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	55021C
Ditiotreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
Colagenase II	Sigma-Aldrich	C6885
DNase	Sigma-Aldrich	10104159001  ROCHE
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Fórceps
Plataforma balancim	Instrumentos Grant	PMR-30
Tubos cônicos de 50 ml	Falcon	14-432-22
40 µ filtro de células m	Falcon	352340
Citometria de fluxo
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Kit de coloração de células mortas fixável Aqua	Life Technologies	L34957
CD45	BD	555485
CD3	BD	557757
CD20	BD
CD56	Biolegend	318332
CD66abce	Miltenyi	130-101-132
HLA-DR	BD
CD14	BD	557831
CD16	Biolegend	302026
CD11c	BD	560369
CD1c	Miltenyi	130-098-009
CD141	Miltenyi	130-090-514
CD103	Biolegend	350212
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	F8775
LSR II Citômetro de fluxo	BD		Citômetro de fluxo
FlowJo	FlowJo		Software para análise