Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55224
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 2,4, 1,2
1Department of Biological Sciences, Oakland University, 2OU-WB Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, 3Department of Obstetrics and Gynecology, St. John Provindence - Providence Park Hospital, 4Department of Neurosurgery, Beaumont Health System

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה של חבל טבור האנושי (UC) ו מדגם שליה העובר לתוך חוט קרונית (CL), ג'ל וורטון (WJ), צומת חבל-שליה (CPJ), ואת השליה עוברת (FP) עבור הבידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) באמצעות טכניקת תרבות explant.

Abstract

חבל הטבור האנושי (UC) ואת השליה אינם פולשניים, פרימיטיבי ומקורות שפע של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) צברו יותר ויותר תשומת לב כי הם אינם מהווים כל דאגות אתיות או מוסרית. שיטות קיימות כיום לבודד MSCs מ UC להניב כמויות נמוכות של תאים עם פוטנציאלי התפשטות משתנים. מאז UC הוא איבר אנטומי-מורכב, הבדלים במאפייני MSC יכולים להיות בגלל ההבדלים באזורי אנטומיים הבידוד שלהם. במחקר זה, אנו ראשונים גזורים דגימות כבל / שליה לשלושה אזורי אנטומיים דיסקרטיים: UC, צומת חבל-שליה (CPJ), ואת שליה עוברת (FP). שנית, שני אזורים מובחנים, רירי כבל (CL) ו ג'ל וורטון (WJ), הופרדו. טכניקת תרבות explant שמשה אז לבודד תאים מהארבעה המקורות. הזמן דרוש התרבות העיקרית של תאים מן explants מגוונת בהתאם למקור של הרקמה. תולדה של התאים התרחשה בתוך 3 - 4 daי"ש של explants CPJ, בעוד הצמיחה נצפתה לאחר 7 - 10 ימים ו -11 - 14 ימים מ CL / WJ ו explants FP, בהתאמה. התאים הבודדים היו חסיד הפלסטיק ומוצגים סמני מורפולוגיה פני fibroblastoid, כגון CD29, CD44, CD73, CD90, ו CD105, בדומה מח עצם (BM) MSCs -derived. עם זאת, את יעילות מושבת יוצרים של התאים המגוונים, עם CPJ-MSCs ו WJ-MSCs מראה יעילות גבוהה יותר מאשר BM-MSCs. MSCs מכל ארבעה מקורות הבדיל לתוך adipogenic, chondrogenic, שושלות לסרטן העצמות, המעיד על כך שהם היו מולטיפוטנטיים. CPJ-MSCs הבדיל באופן יעיל יותר בהשוואה למקורות אחרים MSC. תוצאות אלו מעידות כי CPJ הוא האזור אנטומיים החזק ביותר הניב מספר גבוה יותר של תאים, עם יכולות התחדשות עצמית התפשטות יותר במבחנה. לסיכום, הניתוח ההשוואתי של MSCs מהארבעה המקורות ציין כי CPJ הוא מקור מבטיח יותר של MSCs עבור טיפול בתא, regenerativרפואת e, והנדסת רקמות.

Introduction

תאי גזע נמצאים איברים ורקמות שונים של הגוף. הם בעלי פוטנציאל התחדשות ולשחק תפקיד מרכזי בתיקון רקמות ניזוקו בגוף לאורך כל תוחלת החיים האנושיים 1, 2. זה יצר הרבה עניין תאי גזע בוגרים (ASCs), במיוחד מאז, בניגוד לתאי גזע עובריים (ESCs), השימוש ASCs אינו מהווה דילמות מוסריות ואתיות. מספר מחקרים דיווחו על הבידוד של ASCs, כגון תאי סטרומה mesenchymal (MSCs); תאי גזע hematopoietic (HSCs); ואת אבות שונים, לרבות מקורות שונים בוגרת החל מח עצם (BM) כדי רקמה שומנית (AT) ו שיני עיסה 3, 4, 5. עם זאת, מספר ASCs נוכחים ברוב הנישות המבוגרות מוגבל, והבידוד שלהם בדרך כלל כרוך הליך פולשני וכואב עם תורם אפשריתחלואת אתר. בנוסף, גיל תורם ולחץ סביבתי גם יכולים לשחק תפקיד משמעותי בקביעת איכות הפעילות ביולוגית של התאים המבודדים 6, 7, 8. ASCs גם להציג שגשוג מוגבל פוטנציאל התמיינות במהלך בתרבות חוץ גופית.

כדי להתגבר על חסרונות אלה של ASCs הנוכחי, מקורות חדשים כבר רדף לבודד תאי גזע. מאמצים אלה הובילו את הבידוד של תאי גזע ממקורות סביב לידה, כולל דם טבורים, רקמת חוט, שליה, ואת מי שפיר 9 נוזל. מקורות אלה זכו לתשומת לב בגלל הזמינות הקלה והשופעת שלהם 10, 11, 12, 13. יתר על כן, רקמות סביב לידה ניתן להשיג הלא פולשני, ותאי גזע המופקים מהןיותר פרימיטיבי ASCs מבודד ממקורות מבוגר 14, 15. הם מנותקים מן הרקמות השיגו בלידת נחשבים עברו שינויים מינימאליים בגנום בשל לחצי הזדקנות סביבתיים 16.

עם זאת, המאפיינים דיווחו של תאי גזע ממקורות סביב הלידה ואת הפוטנציאל שלהם עצמית לחדש וכן להבדיל להשתנות 11 נרחב, 17. זה יכול להיות בין השאר בשל העובדה כי חבל הטבור האנושי (UC) הוא איבר מורכב. אנו משערים כי אזורים נפרדים של רקמות סביב הלידה ליצור נישות ספציפיות אחראי וריאציות והטבע פרימיטיבית יותר של תאי גזע אלה בהשוואה ASCs ממקורות שאינם סביב הלידה. מחקר זה מתאר את דיסקציה של דגימות כבל / שליה לשלושה אזורי אנטומיים דיסקרטיים: UC, צומת חבל-שליה (CPJ), גידולהשליה העובר ד (FP). UC היה גזור נוסף לשני אזורים: רירית כבל (CL) ו ג'ל וורטון (WJ). ניתוח של תאים מבודדים מן CL, WJ, CPJ, ו FP הפגינו שכולם הציג מורפולוגיה fibroblastoid והביע סמנים MSC, אך הם נבדלו עצמית והתחדשות ופוטנציאל בידול שלהם. CPJ שמקורם בתאי הציג בשיעור גבוה יותר של הפוטנציאל התפשטות עצמית והתחדשות לעומת UC- ותאי FP-נגזר, מה שהופך אותם למקור מבטיח יותר עבור טיפול בתא, רפואה רגנרטיבית, והנדסת רקמות.

Protocol

דוגמאות (n = 3) התקבלו בהסכמתם, תורמים בריאים דרך BioBank חולי Beaumont, Royal Oak, MI ואת ההשגחה החולה, Southfield, MI תחת HIC- (יק # 2012-101) ו IRB- (IRB # 820662- 3), בהתאמה, אישרה פרוטוקולים ומעובד כפי שאושר על ידי IBC (# 2858) של אוקלנד, אוניברסיטת רוצ'סטר, MI.

1. טבורי עיבוד אדם טבור, צומת קורדון-שליה, ואת עובר שלית תאי בידוד

  1. בסביבה נקייה מחיידקים לאסוף דגימות של UC כ 10 ס"מ אורך, כולל 5 - 6 ס"מ מחובר CPJ ו 3 - 4 ס"מ של FP. מיד למקום כל דגימה במדיום אוסף כוס המכילה (DMEM עם 4500 מ"ג / גלוקוז מ"ל פתרון אנטיביוטי (0.1% גנטמיצין, 0.2% סטרפטומיצין, ו 0.12% פניצילין)) ולאחסן ב 4 ° C עד העברתו למעבדה ידי הצבתו על הקרח בתוך קופסת קלקר. לעבד המדגם ב 4 ° C. בתוך 2 - 4 h של אוסף.
  2. הנח את הדוגמה צלחת 150 מ"מ פטרי שמרה עלקרח בתוך ארון בטיחות ביולוגית. באמצעות מחט מזרק, לשטוף אותו מספר פעמים עם PBS קר כקרח כדי להסיר קרישי דם. ודא המדגם נשמר רטוב עם PBS במהלך עיבוד ואל תתנו לו להתייבש. כדי לשמור על סטריליות, לטפל בסביבה נקייה מחיידקים מדגם באמצעות כלים PBS וכירורגי autoclaved ברחבי עיבוד מדגם.
  3. לבחון היטב את המדגם כדי לזהות אזורים אנטומיים שונים: UC, CPJ, ו FP. ראשית לנתח את UC. החזק את הקצה העוברי של UC עם מלקחיים ובזהירות לבצע את החתך הראשון רק בחלק העליון של CPJ באמצעות זוג מספרי. עוברות את הסינון השני מתחת CPJ להפריד את CPJ (1.5 - 2.0 ס"מ) מן FP. מניח את UC המופרד, CPJ, ו FP בצלחות פטרי נפרדות להמשך עיבוד.
  4. חותכים את UC אורכית בעזרת מספריים מלקחיים, לחלוטין לחשוף את כלי הדם המקיפים WJ מבלי להפריע האפיתל.
  5. גרדו את WJ הרחק כלי הדם אפיתל הפנימי של subamnionבאמצעות אזמל, ולאחר מכן להסיר את כלי הדם. הקפד לגבות כל WJ perivascular הנותרים מתחת ומסביב כלי הדם, ואת מקום WJ שנאסף צלחת פטרי נפרדת.
  6. אסוף את הרקמות הנותרות, רירי כבל (CL), בצלחת פטרי נפרדת.
  7. לאחר הפרדת רקמות המייצג CL, WJ, CPJ, ו FP, להחליף את PBS עם 3 - 5 מ"ל של טריפסין פתרון מסחרי ו בנפרד לחתוך כל אחת הרקמות לתוך 1- לחתיכות 2 מ"מ באמצעות מספריים.
  8. דגירת חתיכות הרקמה בתמיסת טריפסין המסחרית ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתוך חממה 5% CO 2 לעיכול חלקי של הדגימות. שים לב העיכול החלקי על ידי הדמית שחרורו של תאים באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב.
  9. כדי דגימות-מעוכל חלקית, להוסיף נפח שווה של המדיום תרבות (CM; DMEM עם 4500 מ"ג / גלוקוז מ"ל ו 2 מ"מ L- גלוטמין, בתוספת 10% בסרום אדם / FBS פתרון אנטיביוטי (0.1% גנטמיצין, 0.2% סטרפטומיצין , ו 0.12% penicillin)) כדי לנטרל את פתרון טריפסין המסחרי. מעבירים את תוכן לתוך צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל ולתת להתיישב בחלקו מתעכל חתיכות רקמה עבור 3 דקות.
  10. בזהירות לשאוב supernatant, כולל תאים בודדים (הם אינם מרחיבים ביעילות), צלחת 15 - 20 חתיכות חלקית מתעכל רקמה על בקבוק תרבות 75 ס"מ 2 רקמות ולהוסיף 9 מ"ל של CM. לדגור על 37 מעלות צלזיוס לא להפריע צלוחיות התרבות עבור 2 - 3 ימים, כדי לאפשר את הדבקות של פיסות רקמה.
    הערה: החלק הנותר של הדגימות החלקיות מתעכלות רקמות יכול להיות cryopreserved עבור בידוד העתיד של תאים.
  11. לאחר 3 ימים של דגירה, לשנות את CM ולחפש את המראה של תולדה של תאים מן explant על בסיס יומי; צמיחת תאים צריכה להיות ברורה מן explants החסיד לאחר 3 - 4 ימים, 7 - 10 ימים, ו 11 - 14 ימי דגירה עבור CPJ, CL / WJ, ו FP, בהתאמה. מנקודה זו ואילך, לשנות את CM אחרי כל 3 ימים או כפינָחוּץ.
    הערה: צמיחת תאים מגיעה 70% מפגש 7 - 10 ימים לאחר תולדת התא הראשונית מן explant. שים לב פיסות רקמה לא חסידות לא להצמיח שום תולדת תא עד שהם לדבוק הפלסטיק. יש להקפיד כך הבקבוק אינו מופרע על מנת למנוע את ניתוק פיסות רקמה החסידה. אם יש חתיכות צפות לאחר 3 ימים של culturing הראשון, הם יכלו להינצל באמצעות העברתם בבקבוק חדש עבור הקובץ המצורף.
    הערה: כאשר צמיחת תאים מן explants רקמות מגיע 70% המפגש, הם צריכים להיות subcultured. כאמור לעיל, MSCs מ CL / WJ, FP, CPJ ויהיה מגיע למפגש ב -10 - 14 ימים, 14 - 20 ימים, ו -17 - 24 ימים, בהתאמה.
  12. כדי תת תאים נגמלה מן explants, לנתק את התאים באמצעות 1 - 2 מ"ל של טריפסין פתרון מסחרי / 75 ס"מ 2 בקבוק תרבות לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. לנטרל עם 1 - 2 מ"ל של CM צנטריפוגות 1500 XG במשך 3 דקות. עשההקפד לסובב את הבקבוק תוך הוספת טריפסין עבור אפילו פושט.
  13. הערה: תאי pelleted נחשבים מעבר 0 (P0) ו יושעו ב CM, נספרים subcultured בצפיפות זריעה של 1 x 10 4 / סנטימטר 2 עבור הגברה, אפיון, וכן להקפאה. תאי עודף ניתן cryopreserved ב P0.

2. אפיון התאים המבודדים

  1. Assay מושבה יעיל להרכיב (CFE)
    1. מעיל המנות 100 מ"מ פטרי (שטח הפנים של 60 ס"מ 2) עם 0.1% ג'לטין במשך 30 דקות ומניחים אותם בחממה CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: למרות שלא הכרחי, ציפוי ג'לטין משפר דבקות תא.
    2. הסר את ג'לטין עודף וזרעי צלחת מצופה עם תאים P0 בריכוז של 1.63 תאים / ס"מ 2. להוסיף 3 מ"ל של CM דגירה בחממה 2 CO ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. מעקב אחר צלחות הזרע לצמיחה משובטתעל ידי מיקרוסקופ אור (LM) ולשנות את המדיום כל 3 ימים.
    4. לאחר 10 - 14 ימים של צמיחת תאים, לשטוף את צלחות פטרי פעמיים עם PBS ולתקן את התאים paraformaldehyde 4% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: Paraformaldehyde רעיל. אנא לתרגל זהירות ידי לבישת כפפות משקפים במהלך שימוש.
    5. כתם התאים הקבועים עם סגול קריסטל 0.1% עבור 1 שעות בטמפרטורת חדר ולשטוף את הצלחת עם מי ברז עד הכתם הכחול המאוגד נעלם.
    6. ספירת המושבות מורכבות לפחות 50 תאים באמצעות LM.
  2. ביטוי של סמנים פני התא
    1. תרבות התאים המבודדים כדי מפגש 70%, לנתק עם פתרון טריפסין מסחרי, ולהתרחץ גלולה ידי צנטריפוגה ב 1500 XG במשך 3 דקות. להשעות את התאים במאגר FACS (1x PBS עם FBS 2% ו 0.1% אזיד הנתרן).
      הערה: אזיד הנתרן הוא רעיל. אנא לתרגל זהירות ידי לבישת כפפות משקפים במהלך שימוש.
      2. 6) עם FITC- או APC-שכותרתו MSC ספציפי נוגדנים (נוגדנים FITC- מצומדות נגד: CD44 ו CD90 או נוגדנים APC מצומדות נגד: CD29, CD73, ו CD105) במאגר FACS עבור 30 דק ' ב 4 ° C בחושך.
    2. צנטריפוגה התאים מוכתם 670 XG במשך 5 דקות, לשאוב supernatant, מחדש להשעות התאים 500 μL של חיץ FACS.
    3. נתח את התאים מוכתם נוגדן באמצעות FACS פי הפרוטוקול של היצרן.

פוטנציאל התמיינות 3.

  1. בידול Adipogenic
    1. תרבות התאים המבודדים כדי מפגש 70%, לנתק עם פתרון טריפסין מסחרי, ולהתרחץ גלולה ידי צנטריפוגה ב 1500 XG במשך 3 דקות.
    2. בתוך חממה CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס, התרבות התאים בריכוז של 100,000 תאים / גם צלחת 6-היטב המכיל 2 מ"ל של CM.
    3. לאחר 24 שעות, להחליף את CM עם adipogבינוני בידול enic (0.5 מיקרומטר isobutyl-methylxanthine, 1 dexamethasone מיקרומטר, 10 מיקרומטר אינסולין, ו 200 מיקרומטר אינדומטצין) דגירה. שינוי מדיום הבידול כל 3 ימים או בתדירות נחוצה.
    4. לאחר 3 שבועות של דגירה, לתקן את התאים עם 2 מ"ל של paraformaldehyde 4% בכל טוב עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר ואת הכתם עם שמן אדום O כדי לזהות את הייצור של טיפות השומנים כדי לנתח לבידול adipogenic.
      הערה: Paraformaldehyde רעיל. אנא לתרגל זהירות ידי לבישת כפפות משקפים במהלך שימוש.
    5. פנקו את התאים קבוע עם 60% isopropanol (2 מ"ל / היטב של צלחת 6-היטב) עבור 5 דקות.
    6. החלף את isopropanol עם 2 מ"ל של כתם שמן אדום O (פילטר 3 חלקים שמן אדום O כתם ו 2 חלקים מים מזוקקים), דגירה של 15-30 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף 3 - 4 פעמים עם מי ברז כדי להסיר כל כתם מאוגד .
    7. דמיינו את טיפות שומנים מוכתם באדום, מעידות על שושלת תא adipogenic, uלשיר LM.
  2. בידול Chondrogenic
    1. תרבות מבודדת תאי 70 מפגש%, לנתק עם פתרון טריפסין מסחרי, ולשטוף עם PBS.
    2. גלולה התאים לזירוז chondrogenic, צנטריפוגה 250,000 תאים צינור צנטריפוגה 15 מ"ל עם 2 מ"ל של CM ב 11,000 XG במשך 8 דקות. דגירה כדורי לילה בשעה 37 ° C.
    3. לאחר 24 שעות, בעדינות להחליף את CM עם המדיום בידול chondrogenic (20 ng TGFβ1, 10 אינסולין ng, 100 dexamethasone ננומטר, ו 100 מיקרומטר חומצה אסקורבית) מבלי להפריע גלולה ולהמשיך הדגירה. שינוי מדיום הבידול כל 3 ימים או בתדירות נחוצה.
    4. לאחר 3 שבועות של דגירה, לתקן את התאים עם 2 מ"ל של paraformaldehyde 4% בכל טוב עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר. Cryosection ואת הכתם עם toluidine כחול 1% לבחון את הנוכחות או ייצור של מטריקס על מנת לקבוע בידול chondrogenic.
      הערה: Paraformaldehyde הוא רעיל. אנא לתרגל זהירות ידי לבישת כפפות משקפים במהלך שימוש.
    5. עבור cryosectioning, לשטוף את כדורי תא שנקטפו בעדינות פעמיים עם PBS ולתקן עם 1 מ"ל של paraformaldehyde 4% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: Paraformaldehyde רעיל. אנא לתרגל זהירות ידי לבישת כפפות והרכב משקפי במהלך השימוש.
    6. לשטוף את הכדורים פעמים עם PBS כדי להסיר את paraformaldehyde ולהעביר לתוך פתרון סוכרוז / אוקטובר (1: 2, 20% סוכרוז: אוקטובר). דגירה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות כדי לאפשר הפתרון לחלחל לתוך כדורי תא לחלוטין; זה יאפשר חתך חלק.
    7. מעביר את הכדורים לתוך תבניות OCT. להקפיא את התבניות ב -20 מעלות צלזיוס למשך 4 - 6 h ו cryosection על 10 - 12 חלקים בעובי מיקרון של הכדורים הסלולריים באמצעות cryostat מכתים toluidine כחול.
    8. שטפו את cryosections בעדינות עם PBS; להוסיף כמה טיפות של כתם כחול 1% toluidine, המכסים את הסעיפים הגלולים בשקופית לחלוטין; ו Incאובאטה עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר.
    9. שטפו את השקופיות עם מספר רב של פעמים PBS כדי destain. הסר את הכתם העודף ידי טבילת השקופיות בתמיסת אלכוהול מבוססת HCl (95% אלכוהול + 0.5 מיליליטר של HCl) מספר פעמים עד הצבע הכחול המאוגד נעלם. הר בסעיפים מוכתמים באמצעות 100 μL של פתרון הרכבה לשימור לטווח הארוך של השקופיות.
      הערה: כתמי כחולי הסעיפים מעידים על קיומו של glycosaminoglycans ו גליקופרוטאינים יהיה נצפה באמצעות LM.
  3. בידול osteogenic
    1. שוב, תרבות התאים הבודדים כדי מפגש 70%, לנתק עם פתרון טריפסין מסחרי, ולהתרחץ גלולה ידי צנטריפוגה ב 1500 XG במשך 3 דקות.
    2. תת-תרבות התאים בריכוז של 100,000 תאים / היטב צלחות 6-היטב המכיל 2 מ"ל של CM בתוך חממה CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. לאחר 24 שעות, להחליף את CM עם מדיום בידול osteogenic (0.1 μ; Dexamethasone M, 10 מיקרומטר β-glycerophosphate, ועל פוספט ascorbate 50 מיקרומטר) ולהמשיך את הדגירה. שינוי מדיום הבידול כל 3 ימים או בתדירות נחוצה.
    4. לאחר 3 שבועות של דגירה, לתקן את התאים עם 2 מיליליטר של 4% paraformaldehyde לכל טוב עבור 30 דקות בטמפרטורה ואת הכתם בחדר עם אדום פואית כדי לזהות הנוכחות של בתצהיר סידן כדי לקבוע בידול לסרטן עצמות.
      הערה: Paraformaldehyde רעיל. אנא לתרגל זהירות ידי לבישת כפפות משקפים במהלך שימוש.
    5. לשטוף בעדינות את התאים קבוע פעמיים עם מים מזוקקים ולטפל עם 2% כתם אדום פואית (2 מ"ל / היטב צלחת 6-היטב) עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר בחושך.
    6. הסר את הכתם עודף ידי שטיפה בעדינות עם מים מהברז כך משקעי סידן לא לעקור.
    7. דמיינו את משקעי סידן אדום מוכתם באמצעות LM.

4. צ'ה פולימראז טרנסקריפטאז כמותי הפוךבתגובה (qRT-PCR) ניתוח

  1. תרבות התאים המבודדים כדי 70% מפגש, לנתק עם פתרון טריפסין מסחרי, לשטוף, ו גלול ידי צנטריפוגה ב 1500 XG במשך 3 דקות כדי לבודד את הרנ"א הסלולר הכולל.
  2. שוטפים את התאים עם PBS להסיר עקבות של FBS, ולאחר מכן להמשיך בידוד RNA באמצעות ערכת טיהור מסחרי RNA, בעקבות הוראות היצרן.
  3. לטהר את RNA הכולל מבודד על ידי טיפול עם DNase ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמצעות thermocycler. לסנתז cDNA באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן.
  4. הכן בשלושה עותקים 10-μL התגובות PCR בצלחת 96-היטב, עם כל תגובה המכילה 5 μL של Supermix SYBR ירוק PCR; 3 μL של מים מזוקקים פעמיים; 0.5 μL של כל צבע יסוד, קדימה לאחור; ו 1 μL של cDNA המדולל (01:10).
  5. בצע PCR תחת הפרמטרים הבאים: 10 דקות ב 98 מעלות צלזיוס, ואחריו 44 מחזורים של 30 s לכל ב 98 &# 176; ג, 20 שניות על 60 מעלות צלזיוס, ו 30 שניות על 72 מעלות צלזיוס.
  6. לנרמל את ההגברה של גני המטרה אל גני ההפניה, GAPDH ו β-יקטין; רצפים פריימר מפורטים בטבלה 1.

5. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע את כל הניתוחים באמצעות תוכנה סטטיסטית. להציג את הנתונים כממוצע ± SEM. תוצאות עם p-value (** p ≤ 0.01 ו * p ≤ 0.05) נחשבו משמעותיים מבחינה סטטיסטית.

Representative Results

Dissection ובידוד של תאים מן הטבורים אנושיים, צומת קורדון-שליה, ואת עובר שליה

רקמת Perinatal מורכבת משלושה אזורי אנטומיים דיסקרטיים. הראשון הוא UC, המכיל שני עורקים ווריד אחד, כמו גם שני אזורים מובחנים: CL (הקרום החיצוני של הכבל) ו WJ (חומר דמוי ג'לי המקיפים את כלי הדם בתוך כבל). השני הוא CPJ (החיבור בין הכבל ואת השליה), והשלישי הוא FP, המהווה מיד לאחר CPJ (כבל מכניס לתוך השליה, אשר מחוברת לדופן הרחם של אמא). סכמטית של פרוטוקול הבידוד של תאים מרקמות סביב לידה מתוארת באיור 1. ארבעת מקורות-CL, WJ, CPJ, ו FP-ניתנים לזיהוי באופן ברור הופרדו לבודד תאים מן explants, כפי שמוצג באיור 2. Tהמראה של התא הוא תולדה מתרבויות explant היה פיקוח שגרתי והקליט ידי LM. תאי fibroblastoid חסידים נצפו לאחר 3-4 ימים של culturing את explants CPJ. תאים עם מורפולוגיה דומה הופיע 7-8, 9-10, ו 11-14 ימים לאחר culturing ל- WJ, CL, ו explants FP, בהתאמה. התולדה של תאים מן explants המייצג את המקורות השונים (CL, WJ, CPJ, ו FP) מתואר באיור 3 א. תאים אלה נחשבו P0. כאשר תאים P0 היו subcultured, הם הופיעו לגדול clonally, הצגת מורפולוגיה fibroblastoid דומה לזה של BM-MSCs. עם זאת, הם הציגו וריאציה בזמן הכפלת האוכלוסייה, החל 32 שעות עד 94 שעות עבור תאים מן CPJ ו FP, כפי שמוצג באיור 3B ו- C. תאים מן WJ ו CL היו פעמים הכפלה דומה המדיאלי CPJ ו FP. ניתוח נוסף של תאי P0 ציין שהם גם מגוונת CFE, החל 16 כדי 92 מושבות.תאים מן CPJ היו הגבוהים ביותר (92), ואילו תאי FP היו CFE הנמוך ביותר (16). תאים מן CL ו WJ היו ערכים CFE של 59 ו 80 מושבות, בהתאמה (איור 4A -C). התאים מ CL היו ערכי CFE דומים BM-MSCs. התוצאות מראות כי תאים שמקורם CPJ יש יכולות שגשוג והתחדשות עצמית גבוהה.

Immunoprofile של התאים הבודדים

תאים מבודדים מן CL, WJ, CPJ, ו FP נחקרו ביטוי של סמנים תא ספציפי. תאי P3-5 מוצגים ביטוי חיובי עבור סמני MSCs כגון CD29, CD44, CD73, CD90, ו CD105 (איור 5 א 'וב'). תאים אלה ידועים גם להביע בכיתת histocompatibility גדולה שאני מרקר, HLA-ABC, ואינו מביע בכיתה השנייה סמן, HLA-DR 3. האחוזים של תאים חיוביים עבור הESE סמנים שנבחרו מכל ארבעת המקורות היו דומים לזו שהביעה BM-MSCs הסטנדרטי. עם זאת, יחסי MFI עולים כי WJ- ותאי הנגזרות CPJ דומים כמעט והם אפילו גבוהים יותר מאשר Cl- ותאי FP-נגזרים (איור 5 ג). מעניין, למרות ערכים משתנים CFE, כל התאים ממקורות שונים הביעו רמות דומות של סמני MSC. על סמך התוצאות של סמנים פני התא, התאים מבודדים מכל ארבעה מקורות נחשבו MSCs. ניתוח נוסף של תאים אלה עולה כי הם גם מבטאים גנים מגוונת", Oct4, NANOG, KLF4, ו Sox2, כפי שמוצג באיור 5D. CPJ-MSCs היה הביטוי העליון של סמנים pluripotency, ואחריו WJ-, Cl- ו FP-MSCs.

פוטנציאל התמיינות של MSCs המבודדת

תקן הזהב לאפיון MSCs הוא יכל differentiate לתוך שושלות מרובות. התוצאות שלנו הראו כי MSCs מבודד מכל המקורות סביב הלידה הבדיל בקלות לתוך תאים מסוגים adipogenic, chondrogenic, ואת העצמות. נגזרים Adipogenic המיוצר טיפות השומנים שהיו מוכתמים חיובי עם שמן אדום O, כפי שמוצג באיור 6 א. כתמים כחולים toluidine של הנגזר chondrogenic של MSCs הפגינו נוכחות של proteoglycans ו גליקופרוטאינים שסייעה בייצור תאי מטריקס (איור 6). נגזרים לסרטן העצמות של MSCs מוכתם חיובי עם אדום פואית להעיד על נוכחות של משקעי סידן מעורב מינרליזציה העצם, כפי שמוצג באיור 6C.

כצפוי, ניתוח תעתיק של MSCs מבודד מכל המקורות הראה בידול trilineage (איור 6D -f). עם זאת, את הסירential של בידול מגוון בהתאם למקור של MSCs. נגזר Adipogenic של WJ-MSCs היה 2-לקפל רמות ביטוי גדולות יותר של גני adipogenic הנבחרים (CEBPβ, FABP4, ו PPARγ) לעומת CPJ-MSCs. Cl- ו FP-MSCs היה הביטוי הנמוך ביותר של גנים אלה. במקרה של בידול chondrogenic, נגזרים CPJ-MSCs הביעו שנבחרו גנים chondrogenic (SOX9 ו col2) 50 גבוה פי מאשר נגזרים WJ- ו FP-MSCs. בדומה בידול עניי adipogenic של CL-MSCs, יש להם פוטנציאל chondrogenic נמוך, כפי שבאו לידי ביטוי על ידי הביטוי הנמוך ביותר של גני chondrogenic. CPJ-MSCs גם הראה את פוטנציאל בידול osteogenic הגבוה ביותר, כפי שמצוין על ידי רמות התמליל 2-לקפל הגבוהות של גנים לסרטן עצמות נבחרים (col1, OPN, ו OCN). עם זאת, הביטוי של Runx2 סמן מולידו היה גבוה ביותר נגזר לסרטן עצמות של WJ-MSCs, המציין כי תאים אלה בוששו להגיב לתנאי בידול. שוב, CL-MSCs הראה לענייםבידול לתוך שושלת לסרטן עצמות. התוצאות מראות כי CPJ-MSCs ו WJ-MSCs מוצג פוטנציאל בידול גדול יותר Cl- ו FP-MSCs. CL-MSCs היה הפוטנציאל הנמוך ביותר להתמיין נגזר trilineage.

איור 1
איור 1: סכמטי של הבידוד של תאים מחוט אדם טבור, צומת קורדון-שליה, ואת עובר שליה. בדוק את המדגם נאספו ולהמשיך עם דיסקציה. שלב 1. ידני לנתח ולהפריד מדגם כבל / שליה לשלושה אזורים נפרדים: חבל טבור (UC), צומת חבל-שליה (CPJ), ואת שליה עוברת (FP). הפרד את שני אזורים מובחנים של UC לתוך רירית כבל (CL) ו ג'ל וורטון (WJ) באמצעות מספריים מלקחיים. שלב 2. חותך כל אחת הרקמות הגזורות בנפרד לתוך 1- to חתיכות 2 מ"מ באמצעות מספריים חלקית לעכל את החלקים. שלב 3. תרבות חתיכות רקמה. שלב 4. לבודד את התאים מן explants ידי טריפסין טיפול. תת ולאפיין את התאים המבודדים. שלב 5. תאים מבודדים ואופיינו יכול להיות מוגבר בשימוש עבור יישומים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: Dissection והתרבות של Explants מן טבורי אנושי הטבור, צומת קורדון-השליה, ואת העובר שליה. מוצגים הם שלושה אזורי אנטומיים שונים של מדגם כבל / שליה: UC (פיצול לתוך CL ו WJ), CPJ, ו FP, כמו גם את העורקים וורידים הקשורים. CL, WJ, CPJ,ו FP הופרדו על ידי דיסקציה ידנית כדי לבודד תאים מן explants. כל האזורים הגזורים נחתך בנפרד לרסיסים קטנים ותרבותי 75 סנטימטר 2 צלחות באמצעות 9 מיליליטר של CM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: מורפולוגיה של תאים מבודדים מן הטבורים אנושיים טבור, קורדון-שלית צומת, ואת עובר שליה. (א) תולדה Cell מן explants של CL, WJ, CPJ, ו FP, דמיינו כפי LM. תת (B) של תאים מבודדים מן CL, WJ, CPJ, ו explants FP הראה מורפולוגיה fibroblastoid. סרגל הסולם מייצג 100 מיקרומטר (גדלה: 4X). (ג) האוכלוסין הכפלת זמן של tהוא מבודד תאים מן CL, WJ, CPJ, ו FP. BM-MSCs שמש כסטנדרט. הברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע של מדידות בשלושה עותקים (** p ≤ 0.01 ו * p ≤ 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: מושבת יוצרי יעילות של תאים מחוט אדם טבור, קורדון-שלית צומת, ואת עובר שליה. צמיחה (א) של התאים (P0) המבודדים CL, WJ, CPJ, ו FP, מצופית בצפיפות משובטת של 1.63 תאים / סנטימטר 2, היו דמיינה ידי LM. (ב) Photomicrographs של תאים מוכתמים סגול קריסטל מוצג קיבולת מושבה יוצרי. (ג) מושבה אחת של תאי שנינות מוכתמותסגול קריסטל h. ברי המידה מייצגים 100 מיקרומטר (גדלה: 4X). (ד) ייצוג גרפי של מספר מושבות נוצרו מהתאים נגזרים CL, WJ, CPJ, ו FP. BM-MSCs שמש כסטנדרט. הברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע של מדידות בשלושה עותקים (** p ≤ 0.01 ו * p ≤ 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: ניתוח של סמני MSC שהביעו התאים המבודדים מן האדם טבור קורד, קורדון-שלית צומת, ואת עובר שליה. (א) הביטוי של סמנים משטח המזנכימה (CD29, CD44, CD73, CD90, ו CD105) על ידי תאים מן CL, WJ, CPJ, ו FP, כפי להרתיע ממוקש ידי cytometry הזרימה. (B ו- C) ייצוג גרפי של האחוזים של תאים חיוביים עוצם ניאון החציוני (MFI) היחסי עבור סמני משטח המזנכימה שנבחרו. יחסי MFI חושבו על ידי חלוקת ערך MFI של הסמן (שנוצר על ידי התוכנה המבוססת על עוצמת הקרינה של אוכלוסיות תאים מגודרות) לפי ערך MFI של אלוטיפ. הברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע של מדידות בשלושה עותקים. (ד) הביטוי של גנים מגוונת" (Oct4, NANOG, KLF4, ו Sox2) על ידי תאים מן CL, WJ, CPJ, ו FP, כפי שנקבע על ידי qRT-PCR. (** p ≤ 0.01 ו * p ≤ 0.05). התבטאות גנים היה מנורמל GAPDH ו β-אקטין, ואת ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע של מדידות בשלושה עותקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 6
איור 6: Multilineage דיפרנציאציה של MSCs המבודדת מן הטבורים אנושיים טבור, קורדון-שלית צומת, ואת עובר שליה. תאים (א) הודגרו במדיום בידול adipogenic עבור 3 שבועות ומוכתמים O האדום השמן, המעיד על הנוכחות של טיפות שומנים. (ב) כדורי תא הודגרו במדיום בידול chondrogenic עבור 3 שבועות. cryosections היסטולוגית של תרבויות גלולות הוכתם toluidine הכחול, מוצג בנוכחות glycosaminoglycans. תאים (C) הודגרו במדיום בידול osteogenic עבור 3 שבועות ומוכתמים אדום פואית, מוצגים לייצור משקעי סידן מציעים מינרליזציה עצם. כל התמונות התקבלו על ידי LM. סרגל הסולם מייצג 100 מיקרומטר (גדלה: 4X). BM-MSCs אנחנומחדש משמש כסטנדרט. (DF) הביטוי של גנים נבחרים (CEBPβ, FABP4, ו PPARγ; SOX9, Acan, ו col2; ו col1, Runx2, OPN, ו OCN המייצג את הבידול של MSCs לתוך adipogenic, chondrogenic, שושלות לסרטן העצמות, בהתאמה), כפי שנקבע על ידי ניתוח qRT-PCR (** p ≤ 0.01 ו * p ≤ 0.05). התבטאות גנים היה מנורמל GAPDH ו β-אקטין, וברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע של מדידות בשלושה עותקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

גֵן רצפי פריימר אורך מוצרים
Oct4 קדימה-CCCCTGGTGCCGTGAA 97
הפוך-GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG </ Td>
NANOG AAAGAATCTTCACCTATGCC צופה פני 110
GAAGGAAGAGGAGAGACAGT הפוכה
KLF4 צופה פני CGAACCCACACAGGTGAGAA 94
ההפוך TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC
Sox2 TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA צופה פני 75
ההפוך CTGGGGCTCAAACTTCTCTC
SOX9 צופה פני AGCGAACGCACATCAAGAC 85
ההפוך CTGTAGGCGATCTGTTGGGG
col2 צופה פני CTCGTGGCAGAGATGGAGAA 252
ההפוך CACCAGGTTCACCAGGATTG
פחית AGCCTGCGCTCCAATGACT צופה פני 103
col1 AAGGTCATGCTGGTCTTGCT צופה פני 114
ההפוך GACCCTGTTCACCTTTTCCA
Runx2 צופה פני TGCTTCATTCGCCTCACAAA 111
ההפוך AGTGACCTGCGGAGATTAAC
OPN צופה פני CATACAAGGCCATCCCCGTT 112
ההפוך TGGGTTTCAGCACTCTGGTC
OCN TAAACAGTGCTGGAGGCTGG צופה פני 191
ההפוך CTTGGACACAAAGGCTGCAC
CEBPβ צופה פני TATAGGCTGGGCTTCCCCTT 94
ההפוך AGCTTTCTGGTGTGACTCGG
FABP4 TTAGATGGGGGTGTCCTGGT צופה פני 158
ההפוך GGTCAACGTCCCTTGGCTTA
PPARγ צופה פני GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC 74
ההפוך ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG
GAPDH ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG צופה פני 101
ההפוך GCCATCACGCCACAGTTTC
תקטין AATCTGGCACCACACCTTCTAC צופה פני 170
ההפוך ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC

טבלה 1: רשימת רצפים אנוש פריימר השתמשו במחקר זה.

Discussion

התקדמות במחקר תאי גזע לא רק שפרה את ההבנה של תהליכי פיתוח בסיסיים אלא גם ספקה הזדמנויות מבטיחות עבור השימוש בתאי גזע ב ביוטכנולוגיים, תרופות, טיפול בתא, רפואת רגנרטיבית, ויישומי הנדסת רקמות 18, 19, 20. בעוד ESCs פלוריפוטנטיים מבודדים מעוברים מוקדמים הם המבטיחים ביותר, הם מתמודדים עם אתגרים טכניים דילמות אתיות 21, 22, 23. תאי גזע מושרים (iPSCs) נגזרים תאי בוגרים לספק אלטרנטיבה, אבל גם הם מתמודדים עם בעיות טכניות ובטיחות דומות 23. יתר על כן, iPSCs לא יכול להיות גנטי יציב או אולי יש שינויים גנטיים שעברו, ובכך להגביל השימוש הטיפולי שלהם. תאי גזע גם דווחו במגוון TIS לאחר הלידההתובעת ואיברים. המקורות הנפוצים ביותר של ASCs ואלה מח עצם, שומן, רקמות השריר. עם זאת, ASCs ממקורות לידה מוגבל צמיחה ופוטנציאל בידול 24, 25. הם גם סובלים בשל הזדקנות וחשיפה ללחצים סביבתיים ובכך הם לא תמיד יעילים עבור יישומים רפואיים 26, 27, 28. זה הוביל אותנו ואחרים כדי לחפש מקורות חדשים של תאי גזע כי הם נאיביים יותר ASCs.

חקרנו מקורות סביב הלידה עבור תאי גזע פרימיטיבי כחלופה ASCs. בדו"ח זה, אנו מספקים שיטה אמינה, יציבה, ופשוט לבודד MSCs אדם מן דגימות כבל / שליה. לשם השוואה למקורות ושיטות אחרים המשמשים את הבידוד של ASCs, בשיטה זו מספקת שיטה יעילה ולא פולשנית לבידוד כמויות גדולות של בפוMSCs h-איכות. כמו כן מדגיש את פוטנציאל הצמיחה והתבדלות הגבוה של MSCs סביב הלידה לעומת MSCs ממקורות מבוגרים כגון BM.

UC מצרף העובר לשליה הוא איבר גדול עם אזורים אנטומיים ברורים, כולל שני העורקים, עורק, CL, ו WJ (הרקמה שמסביב כלי הדם). מספר מחקרים דיווחו על הבידוד של MSCs מחוט כולו, WJ, או השליה, עם צמיחה משתנה והבחנה הפוטנציאלים 25, 29. עם זאת, עד כה, אף מחקר לא נחקר באופן יעיל בהשוואה לתאים מאזורי אנטומיים שונים של מדגם כבל / שליה. אנו מספקים כאן שיטה שיטתית ופשוטה לנתיחה של UC, CPJ, ומחובר FP לבידוד של MSCs. אנחנו גם להראות פרוטוקול מקיף ופשוט לאפיין ולהעריך את איכות התאים מבודדים על ידי קביעת capabil שגשוגםities, כמו גם הפוטנציאלים התחדשות עצמית והבחנה שלהם. שיטה זו היא לשחזור מניב כמות גדולה של MSCs מעולה באיכות.

מצאנו כי העיכול החלקי של חתיכות רקמה 1-2 מ"מ גודל באמצעות פתרון טריפסין מסחרי תאי ניב reproducibly מן explants, ואילו העיכול המלא של רקמה לתוך תאים בודדים היו תשואות עניות של תאים בודדים. עם זאת, מחקר אחד דיווח כי explants רקמות גדולות יותר של UC כ 10 מ"מ בגודל היו אופטימליים תא הבידוד 30. לעומת זאת, במחקר אחר הציע את שיטת explant הרקמות הביאה מחזור תרבות ארוך בתשואה נמוכה של תאים לעומת שיטת עיכול האנזים 31. בדוחות קודמים, לטיפול כבל רקמות עם collagenase השנייה hyaluronidase, בנפרד או בעקבות טריפסין, בוצעו לבודד תאים בחוט 32, 33 34. לא רק שיש מידה רבה של וריאציה בשיטות עיכול של רקמת החוט לפני culturing, אלא גם התאים הבודדים שנראה הטרוגנית. שימוש אנזימים קשים עבור פרקי זמן ארוכים עלול לבזות את קרום התא, המשפיע תא דבקות ושגשוגם. התוצאות של שיטה זו הראתה כי explants רקמות סביב הלידה-מעוכל חלקית סיפק תולדה של תאים מבלי לגרום נזק לתאים נרחב, מתוחזק כדאיות, והניבה כמויות גבוהות יותר של אוכלוסיות הומוגניות של MSCs.

בעוד הפרוטוקול לנתיחה והבידוד של תאים מן explants הוא פשוט, חלק מהשלבים עלול להוכיח להיות מאתגר. ראשית, להבטיח עמידת explant בכך שהוא מאפשר את הקשר שלהם אל פני השטח של בקבוק התרבות. זה יכול להיות קל באמצעות כמות קטנה של מדיום, רק מכסה את חתיכות רקמה לתרבות 2 h של הראשון, ולאחר מכן מוסיף בקפדנות את המדיום הנותר. Second, להגביל את מספר explants פחות מ 15 לכל בקבוק T75. שטח קטן מדי בין החלקים או חתיכות רבות מדי לכל בקבוק הם מעכב עבור תולדת תא. חתיכות שלישיות, רקמות שאינם מקלה על פני השטח של בקבוק התרבות לאחר 3 ימים של דגירה תועברנה בבקבוק חדש עבור דבקות ו culturing. חתיכות רביעיות, רקמות כדי להיות מתורבתות צריך להיות חופשי של פסולת תא, אשר מעכבת מצורפת. החמישית, התרביות של חתיכות גדולות דורשות מדיום יותר ואינה לשפר יעילות תולדת תא. לבסוף, לפקח על תרבויות explant מקרוב, במיוחד לאחר הופעת תולדת תא, כמו התאים עשויים להפוך במהירות ומחוברות ולבדל בהתאם למקור הרקמה. כמה מגבלות של הטכניקה כוללים חוסר מומחיות לנתח דגימות להפריד בין CL, WJ, CPJ, ו FP; גודל מדגם קטן, וכתוצאה מכך תשואת WJ נמוכה; ו-עיבוד הדגימות מתעכבות נדרשות להיות מעובד תוך 2-4 שעות של אוסף כדי AVOid הפסד התאוששות התא.

תקן הזהב עבור האפיון של MSCs הוא היכולת לדבוק פלסטיק, מהווה את הפנוטיפ fibroblastic, להתמיין שושלות מרובות. אלה הם גם קריטריונים נפוצים בשימוש להגדרת MSCs כמתואר ע"י ISCT 35. במחקר זה, התאים מבודדים מכל ארבעת המקורות היו חסיד הפלסטיק והיה ביטוי חיובי עבור סמני MSC (CD29, CD44, CD73, CD90, ו CD105) אבל ביטוי שלילי של CD45 סמן hematopoietic. בנוסף, הם הביעו אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA) אני בכיתה אבל היו שליליים לשיעור HLA II. בהשוואת BM-MSCs, WJ- ותאי הנגזרות CPJ היו גבוהים. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם הדיווחים הקודמים של UC הנגזרות 33 MSCs, 36, 37, 38. בנוסף, התוצאות שלנו הראו כי Cl-, WJ-, CPJ-, FP-MSCs הביע pluriגני עצמה כגון Oct4, NANOG, ו Sox2; עם זאת, הביטוי שלהם היה נמוך מזה של ESCs, כפי שדווח בעבר 39. תוצאות אלו היו גם הסכם עם מחקר קודם אשר דיווח הביטוי של סמני pluripotency בתאי סביב הלידה נגזרת 40. מעניין, זה היה נראה כי הביטוי של הסמן pluripotent היה גבוה ב CPJ-MSCs מאשר בתאים מבודדים ממקורות אחרים. זה גם היה שם לב כי UC-MSCs הציג פוטנציאל להתחדשות עצמית גדולה יותר BM-MSCs 41. מעניין לציין כי למרות דמיון במאפייני פנוטיפי, התאים המבודדים מארבעת המקורות היו ערכי CFE משתנים. עם זאת, למעט FP-MSC, וכולם היו טובים ערכים CFE מ BM-MSCs. CPJ-MSCs היה ערך CFE הגבוה ביותר וקצב ההתפשטות בהשוואה לכל MSCs האחר. בנוסף, WJ- ו CPJ-MSCs מוצגים פוטנציאלי בידול גבוהים יותר BM-MSCs. CL-MSCs הראה הבידול לפחותפוטנציאל לתוך כל שלוש שושלות (כלומר, adipogenic, chondrogenic, ו לסרטן העצמות), ואילו CPJ-MSCs היה פוטנציאל התמיינות trilineage הגבוהה ביותר FP-MSCs מוצג פוטנציאל התמיינות adipogenic לפחות.

לסיכום, התוצאות שלנו הראו כי איכות וכמות MSCs מבודד שונה בין ארבעת מקורות במדגם כבל / השליה. היה CPJ-MSCs יותר קיבולת התפשטות פוטנציאל התחדשות עצמית גדולה יותר. הם היו גם חזקים ב הבידול שלהם לתוך התאים מסוגי trilineage. בשל זמן ההכפלה הנמוך שלהם, CPJ-MSCs יכול להיות התרחב במהירות 1000-פי והשתמש עבור תרופת תפוקה גבוהה או הקרנה ביולוגית. תאים אלה יכולים להיות מקור מבטיח יותר עבור טיפול בתאים ויישומי רפואה רגנרטיבית.

Disclosures

החוקרים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחקר נתמך על ידי OU-WB ISCRM, אוקלנד אוניברסיטת מישיגן ראש מכון השדרה. נ Beeravolu ו ג מקי קבלו את פרס המחקר הבוגר המכללה מאוקלנד האוניברסיטה. אנו מעריכים ס בקשי לבחינת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM with 4,500 mg/mL glucose Invitrogen 11995065
FBS Aleken Biologicals FBSS500
Isobutyl-methylxanthine Sigma I5879-250mg
Dexamethasone Sigma D4902-100mg
Insulin Prospec CYT-270
Indomethacin Sigma I7378-5G
TGFβ1 Prospec CYT-716
Ascorbic acid Sigma A-7631
Ascorbate 2-phosphate Sigma A-8960
β-glycerophosphate Sigma G-6251
TrypLE Invitrogen 50591419
GeneJET RNA purification kit Thermo Scientific K0732
DNase Promega M6101
iScript kit Biorad 1708891
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit Biorad 1725274
4% paraformaldehyde Affymetrix 19943
OCT Thermo Scientific SH75-125D
Oil Red O  American MasterTech Scientific STORO100
Toluidine blue Thermo Scientific S71363
Crystal violet Sigma C3886
Alizarin red stain Thermo Scientific S25131
APC Mouse anti-Human CD29 BD Biosciences  559883
APC Mouse anti-Human CD34 BD Biosciences  555824
FITC Mouse anti-Human CD44 BD Biosciences  555478
FITC Mouse anti-Human CD45 BD Biosciences  555482
APC Mouse anti-Human CD73 BD Biosciences  560847
FITC Mouse anti-Human CD90 BD Biosciences  561969
APC Mouse anti-Human CD105 BD Biosciences  562408
Centrifuge IEC 93522M-2
CO2 incubator Thermo Scientific Hera Cell 150i
Light microscope (LM) Nikon Instruments Inc. Olympus
Hemacytometer Thermo Scientific 0267151B
Cryostat Leica CM3050 S
FACS Canto II and Diva Software BD Biosciences  Canto II 
Thermocycler MJ Research Inc. PTC-100
Real-Time PCR System  Bio-Rad CFX96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upadhyay, R. K. Role of regeneration in tissue repairing and therapies. J Regen Med Tissue Eng. 4 (1), 1 (2015).
  2. English, K., Mahon, B. P., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells; role in tissue repair, drug discovery and immune modulation. Curr Drug Deliv. 11 (5), 561-571 (2014).
  3. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells. Biomed Res Int. 2014, 436029 (2014).
  4. Hocking, A. M. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Cutaneous Wounds. Adv Wound Care. 1 (4), New Rochelle. 166-171 (2012).
  5. Anthony, D. F., Shiels, P. G. Exploiting paracrine mechanisms of tissue regeneration to repair damaged organs. Transplant Res. 2 (1), 10 (2013).
  6. Teschendorff, A. E., et al. Epigenetic variability in cells of normal cytology is associated with the risk of future morphological transformation. Genome Med. 4 (3), 24 (2012).
  7. Liu, L., et al. Chromatin modifications as determinants of muscle stem cell quiescence and chronological aging. Cell Rep. 4 (1), 189-204 (2013).
  8. Bentivegna, A., et al. DNA Methylation Changes during In Vitro Propagation of Human Mesenchymal Stem Cells: Implications for Their Genomic Stability. Stem Cells Int. 2013, 192425 (2013).
  9. Bieback, K., Brinkmann, I. Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From biology to cell therapy. World J Stem Cells. 2 (4), 81-92 (2010).
  10. Tobita, M., Tajima, S., Mizuno, H. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: stem cell transplantation methods that enhance stemness. Stem Cell Res Ther. 6, 215 (2015).
  11. Kim, D. W., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  12. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regen Med. 5 (1), 121-143 (2010).
  13. Díaz-Prado, S., et al. Human amniotic membrane as an alternative source of stem cells. Differentiation. 1, 162-171 (2011).
  14. Puissant, B., et al. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. Br J Haematol. 129 (1), 118-129 (2005).
  15. Christodoulou, I., Kolisis, F. N., Papaevangeliou, D., Zoumpourlis, V. Comparative Evaluation of Human Mesenchymal Stem Cells of Fetal (Wharton's Jelly) and Adult (Adipose Tissue) Origin during Prolonged In Vitro Expansion: Considerations for Cytotherapy. Stem Cells Int. 2013, 246134 (2013).
  16. Dalous, J., Larghero, J., Baud, O. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a novel strategy to protect the central nervous system: technical aspects, preclinical studies, and clinical perspectives. Pediatr Res. 71 (4), Pt 2 482-490 (2012).
  17. Escacena, N., Quesada-Hernandez, E., Capilla-Gonzalez, V., Soria, B., Hmadcha, A. Bottlenecks in the Efficient Use of Advanced Therapy Medicinal Products Based on Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  18. Law, S., Chaudhuri, S. Mesenchymal stem cell and regenerative medicine: regeneration versus immunomodulatory challenges. Am J Stem Cells. 2 (1), 22-38 (2013).
  19. Brower, J., et al. Mesenchymal stem cell therapy and delivery systems in nonhealing wounds. Adv Skin Wound Care. 24 (11), 524-532 (2011).
  20. Angelos, M. G., Kaufman, D. S. Pluripotent stem cell applications for regenerative medicine. Curr Opin Organ Transplant. 20 (6), 663-670 (2015).
  21. Pera, M. F. Scientific considerations relating to the ethics of the use of human embryonic stem cells in research and medicine. Reprod Fertil Dev. 13 (1), 23-29 (2001).
  22. Espinoza, N., Peterson, M. How to depolarise the ethical debate over human embryonic stem cell research (and other ethical debates too). J Med Ethics. 38 (8), 496-500 (2012).
  23. Barrilleaux, B., Knoepfler, P. S. Inducing iPSCs to escape the dish. Cell Stem Cell. 9 (2), 103-111 (2011).
  24. Ding, D. C., Chang, Y. H., Shyu, W. C., Lin, S. Z. Human umbilical cord mesenchymal stem cells: a new era for stem cell therapy. Cell Transplant. 24 (3), 339-347 (2015).
  25. Jeschke, M. G., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Kita, K. Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences. J Tissue Eng Regen Med. 4, 21-27 (2011).
  26. Oh, J., Lee, Y. D., Wagers, A. J. Stem cell aging: mechanisms, regulators and therapeutic opportunities. Nat Med. 20 (8), 870-880 (2014).
  27. Burkhalter, M. D., Rudolph, K. L., Sperka, T. Genome instability of ageing stem cells-Induction and defence mechanisms. Ageing Res Rev. 23, Pt A 29-36 (2015).
  28. Adams, P. D., Jasper, H., Rudolph, K. L. Aging-Induced Stem Cell Mutations as Drivers for Disease and Cancer. Cell Stem Cell. 16 (6), 601-612 (2015).
  29. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
  30. Trivanovic, D., et al. Mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood and umbilical cord Wharton's jelly. Srp Arh Celok Lek. 141 (3-4), 178-186 (2013).
  31. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726 (2013).
  32. Steigman, S. A., Fauza, D. O. Isolation of mesenchymal stem cells from amniotic fluid and placenta. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Chapter 1 (2007).
  33. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. Biomed Res Int. 2013, (2013).
  34. Conconi, M. T., Di Liddo, R., Tommasini, M., Calore, C., Parnigotto, P. P. Phenotype and differentiation potential of stem populations obtained from various zones of human umbilical cord-an overview. J Tissue Eng Regen Med. 4, 6-20 (2011).
  35. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  36. Weiss, M. L., et al. Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease. Stem Cells. 24 (3), 781-792 (2006).
  37. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  38. Durnaoglu, S., Genc, S., Genc, K. Patient-specific pluripotent stem cells in neurological diseases. Stem Cells Int. 2011, 212487 (2011).
  39. Beeravolu, N., et al. Isolation and comparative analysis of potential stem/progenitor cells from different regions of human umbilical cord. Stem Cell Res. 16 (3), 696-711 (2016).
  40. Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2010).
  41. Nagamura-Inoue, T., He, H. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells: Their advantages and potential clinical utility. World J Stem Cells. 6 (2), 195-202 (2014).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 122 תקופת הלידה טבורי צומת קורדון-השליה שליה תאי סטרומה mesenchymal סמנים MSC תאים מולטיפוטנטיים סמנים פלוריפוטנטיים
בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beeravolu, N., McKee, C., Alamri,… More

Beeravolu, N., McKee, C., Alamri, A., Mikhael, S., Brown, C., Perez-Cruet, M., Chaudhry, G. R. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. J. Vis. Exp. (122), e55224, doi:10.3791/55224 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter