Este protocolo descreve uma técnica de ensaio de higiene pessoal escalável em Drosophila que produz dados robustos e quantitativos para medir o comportamento de limpeza. O método baseia-se na comparação da diferença na acumulação de corantes nos corpos de animais não preparados versus groomed durante um período de tempo definido.
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Artigo de método
Quantificação do comportamento de higienização da Drosophila
Neste artigo
Resumo
Resumo
O comportamento de limpeza de Drosophila é um programa complexo de locomotores multi-passo que requer movimento coordenado de ambas as pernas dianteiras e as patas traseiras. Aqui apresentamos um protocolo de ensaio de grooming e um novo design de câmara que é econômico e escalável para estudos de pequena ou grande escala de grooming de Drosophila . As moscas são espalhadas por todo o corpo com corante Amarelo Brilhante e tem tempo para remover o corante dos seus corpos dentro da câmara. As moscas são então depositadas em um volume definido de etanol para solubilizar o corante. A absorvância espectral relativa de amostras de colorante e etanol para animais preparados e não untados é medida e registrada. O protocolo produz dados quantitativos de acumulação de corantes para moscas individuais, que podem ser facilmente calculados em média e comparados em amostras. Isso permite que os projetos experimentais avaliem facilmente a habilidade de preparação para estudos de animais mutantes ou manipulações de circuitos. Este procedimento eficiente é versátil e escalável. Mostramos wFluxo de ork do protocolo e dados comparativos entre animais WT e animais mutantes para o Receptor de Dopamina Drosophila tipo I ( DopR ).
Introdução
Grooming em Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) é um comportamento inata robusto que envolve a coordenação de múltiplos programas motorizados independentes 1 . As moscas da fruta limpam seus corpos de poeira, micróbios e outros agentes patogênicos que podem inibir a função fisiológica normal, como visão e vôo, ou levam a desafios imunes significativos. Na detecção e resposta a ambos mecânico 2 e activação imunitária 3, moscas repetitivamente esfregar as pernas em conjunto ou numa região do corpo alvo até que esteja suficientemente limpo e aparência progride para uma outr....
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Protocolo
1. Preparação
- Prepare um aspirador para mover Drosophila ao vivo de um frasco de cultura para a câmara de preparação. Aspiradores permitem a transferência de animais conscientes para as câmaras comportamentais para garantir que a anestesia não afete a observação comportamental subsequente.
- Usando tesouras cortar 1,5 pés de ID de tubo de tygon ⅛ ", OD ¼". Cortar pelo menos 1 polegada fora da ponta de uma ponta de micropipeta descartable de 1 mL. Segure um pedaço de malha quadrada de 1 cm (abertura 0,196 polegada) sobre a ponta cortada.
NOTA: A maioria das dicas de 1 mL possuem uma linha de gradação onde a ponta fica....
- Usando tesouras cortar 1,5 pés de ID de tubo de tygon ⅛ ", OD ¼". Cortar pelo menos 1 polegada fora da ponta de uma ponta de micropipeta descartable de 1 mL. Segure um pedaço de malha quadrada de 1 cm (abertura 0,196 polegada) sobre a ponta cortada.
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Resultados
O ensaio de limpeza produz dados quantitativos para avaliar o desempenho comportamental com base no restante relativo do corante acumulado deixado nos cadáveres das moscas após um tempo de medição para grooming (30 min). As imagens de amostra do design da câmara de limpeza deslizante e as principais etapas do ensaio são destacadas na Figura 1 . As moscas agregam uma quantidade significativa de corante do pó imediato por vortex na presença de corante ( Figura 2d, .......
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Discussão
O ensaio de preparação é relativamente simples, mas advertimos os experimentadores a prestarem atenção especial às seguintes questões. Manter uma vedação apertada apertando os parafusos nas placas superior e inferior após a introdução de moscas e corantes é essencial para resultados reprodutíveis. O corante amarelo brilhante é muito fino e as juntas soltas permitirão perdas de corante das bordas da câmara. A irregularidade no teor de corante para cada poço poderia facilmente eliminar a quantificação de limpeza, pois o p.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Agradecimentos
Desejamos agradecer Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon e Rose Hedreen por trabalhos iniciais no teste e no estabelecimento desta metodologia e projetos de câmara. Agradecemos a Kelly Tellez e Graham Buchan pela leitura e edição do manuscrito. Agradecemos Andrew Seeds e Julie Simpson por seu trabalho pioneiro e seus conselhos e apoio em sugerir o uso de Brilliant Yellow Dye (Sigma). Este trabalho é apoiado em parte pelo Mary E. Groff Surgical and Medical Research and Education Charitable Trust, Bronfman Science Center e Hellman Fellows Program.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de PVC transparente Tygon de alta flexibilidade | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", usado com pontas de micropipeta e malha para construir aspiradores bucais |
| Pontas de micropipeta (1 mL e 200 μ L) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Tela de Malha de Nylon, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Usado para construir câmaras de limpeza e aspiradores de boca |
| Fórceps Dumont #5 Roboz | Instrumento Cirúrgico | RS-5050 | |
| Corante Amarelo Brilhante | Sigma-Aldrich | 201375-25G | recomendamos o uso de luvas de nitrilo durante o manuseio deste produto |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | definido para "tocar" |
| Etanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | VWR International | 10025-726 | |
| Tubos de microcentrífuga de 0,65 mL Os | VWR International | 20170-293 | podem ser reutilizados com ensaios sucessivos |
| Placa UV de 96 poços | Corning | ||
| BioTek Synergy HTX Platereader | A BioTek | precisa baixar o catálogo para acessar o número do produto | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI.. ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" plástico acrílico | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 porcas | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" parafusos sextavados | McMaster-Carr | 92185A199 | a placa inferior precisa ser rosqueada para este tamanho parafuso |
| 8 - 32 x 1/2" parafusos sextavados | McMaster-Carr | 92185A194 | a segunda placa do topo precisa ser rosqueada |
| 2 - 56 parafusos de máquina Phillips de cabeça chata de 3/8" | McMaster-Carr | 91500A088 | estes mantêm as duas placas do meio juntas |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" tubo de alumínio | McMaster-Carr | 92510A044 | Fabricado internamente; O produto listado tem aproximadamente as mesmas dimensões e deve funcionar para parafusos de tamanho 8. Eles atuam como bainhas para os parafusos de 1" e colocam a tampa sextavada ligeiramente acima da superfície da placa superior |
Referências
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F.
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Reimpressões e permissões
