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Artigo de método

Usando modelos de Zebrafish de infecções por vírus gripe humana A para Screen antivirais e Caracterizar imune do hospedeiro respostas de células

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DOI:

10.3791/55235

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20 de janeiro de 2017

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1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, 3School of Biology and Ecology, University of Maine, 4Division of Intramural Research, Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 5Department of Chemical and Biological Engineering, University of Maine

Neste artigo

Resumo

Modelos de infecção sistêmica e localizada de peixe-zebra para o vírus influenza A humano são demonstrados. Usando um modelo de infecção sistêmica, o peixe-zebra pode ser usado para rastrear medicamentos antivirais. Usando um modelo de infecção localizada, o peixe-zebra pode ser usado para caracterizar as respostas das células imunes do hospedeiro.

Resumo

A cada ano, os surtos de gripe sazonal afetam profundamente as sociedades em todo o mundo. Apesar dos esforços globais, a gripe continua sendo um fardo intratável para a saúde. A principal estratégia para reduzir as infecções é a vacinação anual. Em indivíduos que contraíram gripe, os medicamentos antivirais podem atenuar os sintomas. Há uma necessidade clara e não atendida de desenvolver estratégias alternativas para combater a gripe. Vários modelos animais foram criados para modelar as interações hospedeiro-influenza. Aqui, são descritos protocolos para geração de modelos de peixe-zebra para infecção sistêmica e localizada pelo vírus influenza A humano (IAV). Usando um modelo de infecção sistêmica por IAV, pequenas moléculas com potencial atividade antiviral podem ser rastreadas. Como prova de princípio, é descrito um protocolo que demonstra a eficácia do medicamento antiviral Zanamivir em peixes-zebra infectados com IAV. Ele mostra como os fenótipos da doença podem ser quantificados para pontuar a eficácia relativa de potenciais antivirais em peixes-zebra infectados com IAV. Nos últimos anos, tem havido uma maior apreciação pelo papel crítico que os neutrófilos desempenham na resposta do hospedeiro humano à infecção por influenza. O peixe-zebra tem se mostrado um modelo indispensável para o estudo da biologia dos neutrófilos, com impactos diretos na medicina humana. Um protocolo para gerar uma infecção localizada por IAV na linhagem de peixe-zebra Tg(mpx:mCherry) para estudar a biologia de neutrófilos no contexto de uma infecção viral localizada é descrito. O recrutamento de neutrófilos para locais de infecção localizados fornece um fenótipo quantificável adicional para avaliar manipulações experimentais que podem ter aplicações terapêuticas. Ambos os protocolos de peixe-zebra descreveram fielmente recapitular aspectos da infecção humana por IAV. O modelo de peixe-zebra possui inúmeras vantagens inerentes, incluindo alta fecundidade, clareza óptica, facilidade de triagem de drogas e disponibilidade de linhagens transgênicas, incluindo aquelas em que células imunes, como neutrófilos, são marcadas com proteínas fluorescentes. Os protocolos detalhados aqui exploram essas vantagens e têm o potencial de revelar insights críticos sobre as interações hospedeiro-IAV que podem se traduzir na clínica.

Introdução

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), o vírus da gripe infectar 5-10% dos adultos e 20-30% das crianças anualmente e causar 3-5 milhões de casos de doença grave e até 500.000 mortes no mundo 1. vacinação anual contra a gripe continuam a ser a melhor opção para prevenir a doença. Esforços como o Plano de Acção Global da OMS têm aumentado o uso da vacina sazonal, a capacidade de produção de vacinas e pesquisa e desenvolvimento de estratégias de vacinas mais potentes, a fim de reduzir a morbilidade e mortalidade associada a surtos de gripe sazonais 2. Os medicamentos antivirais como inibidores da neuraminidase (por exemplo Zanamivir e oseltamivir) estão disponíveis em alguns países e provaram ser eficazes nos sintomas atenuantes, quando administrado nas primeiras 48 horas de início 3, 4, 5. Apesar dos esforços globais, a contenção da gripe sazonal UOtbreaks continua a ser um desafio formidável neste momento, como o vírus da gripe variação antigénica excede frequentemente capacidades actuais para se adaptar à evolução do genoma do vírus 6. estratégias de vacina visando novas estirpes do vírus devem ser desenvolvidos com antecedência e são, por vezes, tornar-se menos do que optimamente eficaz devido a mudanças imprevistas nos tipos de estirpes que, eventualmente, predominam em uma época de gripe. Por estas razões, existe uma clara necessidade de desenvolver estratégias terapêuticas alternativas para conter infecções e reduzir a mortalidade. Ao atingir uma melhor compreensão da interação vírus-hospedeiro, pode ser possível desenvolver novos medicamentos anti-gripe e terapias adjuvantes 7, 8.

O host-gripe humana A interação do vírus (IAV) é complexa. Vários modelos animais da infecção pelo IAV humana têm sido desenvolvidos, a fim de obter insights sobre a interação vírus-hospedeiro, incluing ratos, cobaias, ratos de algodão, hamsters, furões e macacos 9. Enquanto fornece dados importantes que melhoraram a compreensão da dinâmica de acolhimento-IAV, cada organismo modelo possui desvantagens significativas que devem ser considerados quando se tenta traduzir as descobertas em medicina humana. Por exemplo, os ratos, que são o modelo mais amplamente utilizado, não prontamente desenvolver sintomas de infecção induzidas IAV quando infectadas com gripe humana isola 9. Isto é porque os ratos não têm o tropismo natural para a gripe humana isolados uma vez que as células epiteliais do rato expressam ct-2,3 ligações de ácido siálico, em vez de os α-2,6 ligações de ácido siálico expressos em células epiteliais humanas 10. As proteínas hemaglutinina presentes em isolados humanos IAV favoravelmente ligar e entrar nas células hospedeiras tendo ligações de ácido siálico alfa-2,6 por meio de endocitose mediada por receptores 9, 11, 12, 13. Como consequência, é agora aceite que no desenvolvimento de modelos de rato para a gripe humana, o cuidado deve ser tomado para emparelhar a tensão adequada de rato com a tensão adequada de gripe, de modo a alcançar fenótipos da doença que recapitulam aspectos da doença humana. Em contraste, as células epiteliais no tracto respiratório superior de furões possuem 2,6 a-ligações de ácido siálico que se assemelham a células de origem humana 14. Furões infectados compartilham muitas das características patológicas e clínicas observadas na doença humana, incluindo a patogenicidade e transmissibilidade dos vírus da gripe humanos e aviários 14, 15. Eles também são altamente passíveis de testes de eficácia da vacina. No entanto, o modelo de ferret para a gripe humana tem várias desvantagens relacionadas principalmente ao seu tamanho e custo de criação que fazem aquisição de estatisticamente signifidados signifi desafiadoras. Além disso, furões têm exibido previamente diferenças na farmacocinética dos medicamentos, biodisponibilidade e toxicidade que fazem eficácia teste difícil. Por exemplo, furões apresentar toxicidade para o M2 canal iônico amantadina inibidor 16. Assim, é claro que na escolha de um modelo animal para estudar dúvidas sobre infecções IAV humanos, é importante considerar as suas vantagens e limitações inerentes, e o aspecto da interacção hospedeiro-vírus que está sob investigação.

O peixe-zebra, Danio rerio, é um modelo animal que oferece oportunidades únicas para a investigação de infecção microbiana, resposta imune do hospedeiro, e terapias medicamentosas potenciais 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. A presença de ácidos siálicos α-2,6-ligadas na superfície de células do peixe-zebra sugeriu a sua susceptibilidade para IAV, o que foi confirmado em estudos de infecção e fotografada in vivo, utilizando uma estirpe repórter fluorescente de 19 IAV. Em peixes-zebra IAV-infectadas, a expressão aumentada dos antivirais ifnphi1 e MXA transcritos indicaram que uma resposta imune inata tinha sido estimulado, e a patologia exibida por peixe-zebra IAV-infectados, incluindo edema e destruição de tecidos, foi semelhante ao observado em infecções por influenza humanos . Além disso, o inibidor da neuraminidase IAV antiviral zanamivir mortalidade limitado e reduzido de replicação viral em peixes-zebra 19.

Neste relatório, um protocolo para o sistema iniciarinfecções IC IAV em embriões de peixe-zebra é descrita. Usando Zanamivir em doses clinicamente relevantes como uma prova de princípio, a utilidade deste modelo de peixe-zebra infecção IAV para rastreio de compostos para a atividade antiviral é demonstrada. Além disso, um protocolo para a geração de uma localizada, infecção epitelial IAV no peixe-zebra nadar bexiga, um órgão que é considerado anatomicamente e funcionalmente análogo ao do pulmão de mamífero 21, 29, 30, 31, é descrito. Usando este modelo de infecção localizada IAV, o recrutamento dos neutrófilos para o local da infecção podem ser rastreados, permitindo que as investigações sobre o papel dos neutrófilos em biologia IAV infecção e inflamação. Estes modelos de peixe-zebra complementar modelos animais existentes de infecções IAV humanos e são particularmente úteis para testar pequenas moléculas e as respostas de células imunitárias, devido à possibilidade de s reforçadapoder Serviço Estatístico, a capacidade de moderado a ensaios de alto rendimento, e as habilidades para rastrear o comportamento de células imunes e função com luz de microscopia.

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Protocolo

Todo o trabalho deve ser realizado utilizando nível de biossegurança 2 (ou BSL2) normas descritas pelos Centros de Controle de Doenças (CDC) e de acordo com as diretrizes fixadas pela Institutional Animal Care e Comitês Uso (IACUC). Por favor conferir com as autoridades apropriadas para garantir a segurança e conformidade.

1. Cuidados e Manutenção Zebrafish

  1. Gerar peixe-zebra e recolher o número necessário de embriões para as experiências. Quando necessário, os tanques de criação em massa, como os descritos por Adatto et ai. 32, podem ser empregues para recolher um grande número de embriões desenvolvente-faseados.
  2. Permitir que embriões para desenvolver até o estágio desejado desenvolvimento (48 horas pós-fertilização para uma infecção sistêmica IAV [seção 3] ou 5 dias após a fertilização para um, nadar infecção localizada bexiga [seção 4]) em pratos fundos de Petri em baixa densidade (< 100 embriões / prato) a 28 ° C em água ovo estéril contendo 6/ Sal 0 ug ml mar (por exemplo, Instant Ocean) em água destilada.
    1. Remover embriões mortos com pipetas de transferência de plástico e mudar ovo por dia de água para garantir a saúde eo desenvolvimento ideal.

2. Preparação de Materiais e Reagentes

  1. Prepara-se uma solução de 4 mg / ml de estoque de tricaina-S (ajustar o pH a 7,0-7,4) em água destilada e autoclave. Armazenar a 4 ° C.
  2. Puxe capilares de vidro de borosilicato com filamentos usando um extrator micropipeta (por exemplo Micropipeta Puller com as seguintes configurações: ajuste de pressão = 100, calor = 550, puxe = [qualquer valor], velocidade = 130, tempo = 110).
    NOTA: Antes de aparar a agulha, o comprimento de onde a agulha começa a diminuir para a ponta da agulha seria de aproximadamente 12-15 mm. Isto pode variar, no entanto, com base na preferência e aplicação. Um cone mais, mais gradual pode ser mais preferível por causa do aumento da capacidade para perfurar o embrião e o RI reduzidask da curvatura da agulha ou quebrar.
  3. Derreter 2 g de agarose em 100 ml de água de ovo usando um forno de microondas. Faça placas sobre as quais se alinham e injetar os embriões por verter derretida agarose em placas de Petri profundas e que lhe permita solidificar.
  4. Faça a 10 mg / ml estoque de Zanamivir em água livre de nuclease. Alíquotas e congelamento a -20 ° C.
  5. Derreta 0,5 g de agarose em 50 ml de água ovo usando um forno de microondas para fazer embrião de montagem agarose. Manter em banho-maria a 50 ° C até estar pronto para usar durante o exame.

3. Systemic IAV Infecção (48 horas pós-fertilização)

ATENÇÃO: Todas as equipes de pesquisa devem consultar seus supervisores e médicos sobre a vacinação antes de iniciar o trabalho com IAV.

  1. dechorionate manualmente embriões no dia do experimento usando fórceps # 5. Tome cuidado para remover e sacrificar embriões que foram feridos no processo em 200 mg / ml solução tricaina.
  2. preparação dof IAV para microinjeção
    NOTA: As estirpes que foram mostrados para infectar embriões de peixe-zebra são vírus influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), vírus influenza A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31), e o repórter fluorescente estirpe da gripe NS1-GFP 33. Detalhes sobre APR8 e X-31, e outras estirpes, podem ser encontrados na base de dados de Influenza Investigação
    1. Propagar a estirpe NS1-GFP do IAV em ovos de galinha embrionados, tal como descrito anteriormente 34, 35. Recolha, alíquota, e titular o líquido alantóico contendo IAV, e armazenar a -80 ° C. Pré-titulados APR8 e X-31 os vírus podem ser adquiridos comercialmente.
      1. Imediatamente antes da infecção, descongelar rapidamente uma aliquota IAV em luvas e, em seguida, colocar rapidamente sobre gelo para reduzir a perda de título.
    2. diluição viral
      1. Se utilizar os APR8 ou X-31 vírus, dilui-se a 3,3 x 10 6 de ovo a dose infecciosa a 50% (EID50) / ml em estéril, PBS gelado Supplempondentes com 0,25% de vermelho de fenol (para auxiliar na visualização) numa câmara de fluxo laminar. Simultaneamente configurar um controle que contém estéril PBS com 0,25% de fenol vermelho.
      2. Se usando NS1-GFP estirpe 33, dilui-se a 1,5 x 10 ~ 2 unidades formadoras de placas (PFU) por NL em estéril, PBS gelado contendo 0,25% de vermelho de fenol (para auxiliar na visualização) numa câmara de fluxo laminar. Simultaneamente configurar um controle que contém líquido alantóico de ovos de galinha não infectadas diluído como o vírus em PBS estéril com 0,25% de fenol vermelho.
      3. Manter IAV em gelo até estar pronto para usar.
    3. solução de vírus Pipet em agulhas microinjeção usando dicas microloader imediatamente antes da utilização. Inserção de agulha de microinjecção no suporte adequado do aparelho de injecção (por exemplo, 3-MPPI pressão do sistema de injecção).
    4. Durante a visualização no microscópio estéreo, gentilmente cortar a ponta da agulha microinjeção com afiados, esterilizado # 5 fórceps.
      NOTA: É recoded que a ponta microinjeção ser cortada gradualmente.
    5. Pressione o pedal do sistema de injeção de pressão e injetar uma gota de óleo microscópio de imersão em um slide de calibração do micrômetro. Medir o diâmetro da gota. Calcular o volume da gota usando a equação, V = / 3πr 3 4, em que V é o volume em NL e r é o raio em um.
      NOTA: Se o diâmetro da gota é muito pequeno, de vidro adicional pode ser cortada ou ajustes de pressão e de sincronização pode ser ajustado. Se o diâmetro da gota é muito grande, ajustes de pressão e de sincronização pode ser ajustada.
    6. Ajustar ajustes de pressão e de sincronização no injector de pressão e / ou reclip a ponta da agulha até que o volume de injecção desejado é obtido (tipicamente 1-3 nl). ajustes de pressão entre 20 e 30 configurações PSI e duração do pulso entre 40 e 80 ms são típicos. Ajuste a pressão de retorno para que ele contraria a pressão capilar, mas não vaza IAV (pressão líquida zero).
  3. Alinhar embriões para Injection
    1. Anestesiar embriões dechorionated em 200 ug / ml tricaina.
    2. Uma vez que o movimento cessa, transferir 10-20 embriões para uma placa de agarose a 2% (preparado na seção 2.3) com uma pipeta de plástico. Usar uma pipeta de plástico para remover o excesso de líquido.
    3. Alinhe delicadamente embriões para microinjeção com um capilar de fogo-polido e vidro de borosilicato selado. Usando um microscópio estéreo, embriões suavemente orientar de modo que a conduta de Cuvier ou da veia cardinal posterior está em linha com a agulha de microinjecção (Figura 1A).
  4. IAV microinjeção
    1. Insira com cuidado a agulha microinjeção no duto de Cuvier ou a veia posterior cardeal. Pressionar o pedal de pé para injectar o volume desejado de IAV para o sistema circulatório do embrião (Figura 1A). Os embriões podem ser injectada mais de uma vez, se necessário.
      NOTA: O bolus injecção deve ser varrido para a circulação e distribbuído por todo o corpo. Se o volume de injecção recolhe no local da injecção, remover embrião de experiência e eutanásia.
    2. Repita injecções em diferentes embriões com solução de controlo específico para a estirpe do vírus escolhido. Para APR8 e X-31, utilize o controlo descrito no ponto 3.2.2.1; para o NS1-GFP, use o controle descrito no ponto 3.2.2.2.
  5. Transferência de embriões para placas de Petri rotulados contendo água ovo estéril e coloque em incubadoras a 33 ° C.
    NOTA: Infected embriões devem ser cultivadas a 33 ° C, para suportar a replicação viral aumentada. Além disso, a incubação a 33 ° C imita mais de perto a temperatura do tracto respiratório superior humano, que está em contacto estreito com temperaturas mais baixas no ambiente externo e é, onde ocorrem as infecções IAV. Embriões podem aclimatar a uma ampla faixa de temperatura de 34.

4. localizada, bexiga natatória IAV Infecção em Tg (mpx: mCherry) Transgênicos Zebrafish (5 dias após a fertilização)

  1. Preparação do IAV para microinjeção
    1. Dilui-se a solução de injecção de tensão e controle de NS1-GFP, conforme descrito no ponto 3.2.
    2. Prepare agulhas conforme descrito na seção 2.2.
    3. Alinhar Tg (mpx: mCherry) 35 larvas contendo bexigas natatórias inflados como descrito no ponto 3.3 com a seguinte exceção. Alinhar larvas, de tal maneira que a agulha pode penetrar a bexiga natatória e o vírus pode ser depositado na parte posterior da bexiga natatória, como previamente descrito 36 (Figura 2A).
  2. IAV microinjeção
    1. Inserir a agulha suavemente microinjecção na bexiga natatória e injectar o volume desejado (por exemplo, 5 nl) para a parte posterior da estrutura (Figura 2A).
      NOTA: O bolus injecção deve recolher para o posterior e bolha de ar da bexiga natatória deve be deslocada para a frente. expressão da GFP deve começar a ser observada às 3 horas pós-injecção.
    2. injecções repetidas com a solução de controlo específico para a estirpe do vírus escolhido, como descrito na secção 3.4.2.
  3. Transferir larvas de placas de Petri contendo água ovo estéril e coloque em incubadoras a 33 ° C.

5. Antiviral Drug Treatment

NOTA: O protocolo abaixo descreve o tratamento zanamivir anteriormente mostrado na Gabor et ai. 19. Este protocolo pode ser modificado para rastrear outras drogas antivirais e tem o potencial de ser modificado para rastrear múltiplos compostos numa placa de 96 poços, formato de alto rendimento.

  1. Às 3 horas após a infecção, substituir a água do ovo de NS1-GFP e peixes infectados com o controle com água de ovo estéril contendo 0, 16,7, ou 33,3 ng / ml Zanamivir.
    NOTA: Estas concentrações foram escolhidas de modo a tentar reproduzir os níveis fisiológicos obtidos following administração de zanamivir em pacientes humanos (100, 200, ou 600 mg, iv, duas vezes por dia ou 10 mg inalados, duas vezes por dia). As concentrações séricas em pacientes humanos variou 9,83-45,3 ng / mL 36.
  2. Ao longo de 5 dias, troque a água ovo a cada 12 horas e substituir com água de ovo estéril contendo a quantidade adequada de Zanamivir.
  3. Acompanhe curso da infecção.
    1. Anestesiar peixe-zebra em 200 ug / ml tricaina. Monitorar a expressão GFP por microscopia de fluorescência estéreo para observar visualmente as diferenças nos padrões de infecção entre peixes IAV-infectados e controle e entre os peixes imerso nas diferentes concentrações de drogas.
    2. Controlar a morbidade e mortalidade ao longo de 5 dias.
      1. Registre as observações sobre a dinâmica da infecção relacionados com a patologia da doença, incluindo os sinais de letargia e evidência de edema, diferenças de pigmentação, ocular e deformidades craniofaciais, e lordose. patologia da doençatipicamente, torna-se aparente nos peixes infectados controlo em 24-48 h pós-injecção, dependendo da quantidade de vírus injectado. Coletar imagens 24 horas após a injecção.
      2. A cada 24 horas, durante 5 dias após a infecção, registrar o número de larvas mortas, mórbido, e saudável. A morte é definida pela ausência de uma pulsação discernível. Traçar dados conforme desejado. Por exemplo, os dados do gráfico como um gráfico de barras empilhados, com percentagens de peixe saudável, mórbida, ou mortos representados graficamente no eixo dos Y e o grupo de tratamento no eixo dos x. 19
        NOTA: As mortalidades pode ser marcado por estimativas de sobrevivência de Kaplan-Meier. Dependendo da aplicação, pode ser adequado para o desenvolvimento de abordagens alternativas para a morbidade pontuação de peixe, incluindo uma matriz de pontuação que pode quantificar os graus de morbilidade com base nas características patológicas acima mencionadas observados.
      3. Consultar com um estatístico para aplicar as análises estatísticas apropriadas.

6. migração de neutrófilos

NOTA: O protocolo seguinte descreve um método para rastrear a migração de neutrófilos para a bexiga natatória na sequência de uma infecção localizada, epitelial IAV. Os métodos descritos podem ser modificados para testar os efeitos das manipulações genéticas e químicas. Usando esta técnica, será possível caracterizar os mecanismos subjacentes ao comportamento de neutrófilos durante a infecção IAV.

  1. Montagem Zebrafish for Imaging
    1. Anestesiar as larvas a ser trabalhada em 200 ug / ml tricaina.
    2. Transferir um indivíduo Tg (MPX: mCherry) larva que tenha sido infectado com NS1-GFP para um poço de um de 24 cavidades, placas com fundo de vidro em uma pequena gotícula de água do ovo (~ 50-100 ul). Repita com outros peixes IAV-infectado e controle.
    3. Lentamente, adicionar 1% de mídia embrião agarose de montagem a cada poço (seção 2.5), tendo o cuidado de não introduzir grandes bolhas.
      1. Suavemente ajustar a posição da larva de modo que ele é montado no seu lado.Goody e Henry 37 descrevem como fazer sondas que funcionam bem neste aplicativo usando os pinos de insetos que são montados em capilares de vidro de borosilicato com filamentos e superglued no lugar.
    4. Uma vez que a agarose endureça, suavemente encher os poços individuais com água ovo contendo 200 ug / ml tricaina.
    5. Com um microscópio confocal, a captura az série pilha de campo claro e de fluorescência imagens utilizando uma objectiva 20X focada na bexiga natatória.
      1. Definir os limites superior e inferior para que eles capturar toda a fluorescência verde e vermelho visivelmente observável.
      2. capturam imagens com 2.0 ms / pixel com etapas que são ≤ 4 mm. O aumento do tempo por pixel e reduzindo a distância entre as etapas (por exemplo, 0,5-1,0 mm) aumenta a resolução e qualidade de imagem.
      3. Gerar uma imagem bidimensional através da fusão de camadas.
      4. Compare o número de neutrófilos mpx-mCherry-positivos presente in as bexigas natatórias de peixe-zebra IAV-infectados e com injecção de controle.

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Resultados

Aqui, os dados que mostram como a infecção sistémica IAV no peixe-zebra pode ser usado para testar a eficácia do fármaco (Figura 1A) são fornecidos. Embriões em 48 horas pós-fertilização são injectados com APR8 (Figuras 1C, 1F), X-31 (Figuras 1E, 1G), ou NS1-GFP (Figuras 1 H-1I) através da conduta de Cuvier para iniciar uma infecção viral. Outro grupo de embriões em 48 horas pós-fertilização foram injetados para servir c...

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Discussão

Para maximizar os benefícios obtidos com o uso de um pequeno animal para modelar interações patógeno-hospedeiro humano, é importante para enquadrar questões de pesquisa e testar hipóteses que capitalizar sobre as vantagens inerentes do sistema modelo. Como um modelo para a infecção pelo IAV humano, o peixe-zebra tem vários pontos fortes, incluindo alta fecundidade, claridade óptica, receptividade ao rastreio de drogas, e da disponibilidade de linhas transgénicas que rotulam células do sistema imunológico, como neutrófil...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Mark Nilan pelo cuidado e manutenção do peixe-zebra e Meghan Breitbach e Deborah Bouchard por propagar NS1-GFP e determinar os títulos de IAV. Esta pesquisa foi apoiada pelo NIGMS grant NIH P20GM103534 e pela Estação Experimental Agrícola e Florestal do Maine (Publicação Número 3493).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Instant OceanSpectrum BrandsSS15-10
100 mm x 25 mm placas de Petri descartáveis estéreis VWR89107-632
Pipetas de transferência Fisherbrand13-711-7M
Tricaine-S (MS-222)Western Chemical
Borosilicato capilar de vidro com filamento Instrumento SutterBF120-69-10
Extrator de micropipeta flamejante/marrom Instrumento SutterP-97
AgaroseLonza50004
ZanamivirAK ScientificG939
Dumont #5 fórceps Pontas
microcarregadorEppendorf930001007
OlympusIMMOIL-F30CC Lâmina de calibração de estágio de microscópio Olympus IMMOIL-F30CC
Injetor de pressão AmScopeMR095
MPPI-3Instrumentação
Microscópio EstéreoOlympusSZ61
Unidade de contrapressãoInstrumentação Científica AplicadaBPU
Kit de suporte de micropipetaInstrumentação Científica Aplicada InterruptorMPIP
Instrumentação Científica Aplicada
Instrumentação Científica AplicadaMM33
Base MagnéticaInstrumentação Científica AplicadaBase Magnética Vermelho
Fenol Sigma-Aldrich P-4758
Incubadora de baixa temperaturaVWR2020
SteREO Discovery.V12Zeiss
IluminadorZeissHXP 200C
Fonte de luz friaZeiss CL6000 LED
Placa multipoços com fundo de vidro, 24 poçosMattekP24G-0-13-F
Microscópio confocalOlympusIX-81 com sistema confocal de varredura a laser FV-1000
Rio Charles 490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) Rio Charles 
Influenza NS1-GFPReferenciado em Manicassmy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)Referenciado em Lam et al. 2013
de EppendorfCientífica Aplicada de pé Micromanipulador FSW de Software Fluoview Olympus Prism v6 GraphPad Vírus Influenza A/PR/8/34 (H1N1) 490715

Referências

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