Descrevemos aqui um método novo, robusto e eficiente de purificação por afinidade em tandem (TAP) para a expressão, isolamento e caracterização de complexos proteicos de células eucarióticas. Este protocolo pode ser utilizado para a caracterização bioquímica de complexos discretos, bem como a identificação de novos interagentes e modificações pós-traducionais que regulam sua função.
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Artigo de método
A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A purificação dos complexos de ácido nucleico de proteína-proteína-proteína activa e é essencial para a caracterização das actividades enzimáticas e de identificação de novo de novas subunidades e as modificações pós-traducionais. sistemas bacterianos para permitir a expressão e purificação de uma grande variedade de polipéptidos simples e complexos de proteínas. No entanto, este sistema não permite a purificação de subunidades proteicas que contêm modificações pós-translacionais (por exemplo, fosforilação e acetilação), e a identificação de novas subunidades reguladoras que estão apenas presentes / expressas no sistema eucariota. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de um romance, robusta e eficiente método de purificação de afinidade em tandem (TAP), utilizando Streptomyces e proteínas marcada com Flag que facilita a purificação de complexos de proteínas com proteínas marcadas no epitopo transiente ou estavelmente expresso a partir de células eucarióticas. Este protocolo pode ser aplicado para caracterizar Protein funcionalidade complexa, para descobrir modificações pós-translacionais sobre subunidades complexas, e para identificar novos componentes complexos de regulação por espectrometria de massa. Notavelmente, este método TAP pode ser aplicado para estudar complexos proteicos formados por componentes eucarióticas ou patogénicos (viral e bacteriana), obtendo-se assim uma grande variedade de oportunidades experimentais jusante. Propomos que os investigadores que trabalham com complexos de proteína poderia utilizar esta abordagem de muitas maneiras diferentes.
Introdução
Interações proteína-proteína (IBP) são fundamentais para a regulação precisa de processos biológicos 1, e mais estudos sobre estas PPIs poder informar sobre a sua função 2. Várias abordagens têm sido desenvolvidos para o estudo e caracterização de IPP, bem como para a identificação de novo de novos componentes de proteínas reguladoras. Em 1989, Stanley Campos e colegas relataram a levedura de dois híbridos (Y2H) ensaio 3. Esta abordagem permite a identificação imparcial e abrangente de interactianos (de caçar) para uma proteína definida de interesse (isca) em Saccharomyces cere....
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Protocolo
1. Células chapeamento
- Um dia antes da transfecção, placa de 3,5 x 10 6 células HEK293T em 10 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml estoque) por placa de 100 mm. Placa 3 - 5 100 mm pratos por experiência / condição para garantir a recuperação de proteína suficiente.
NOTA: O número de placas tem que ser determinada para cada experiência / condição, que vai contar com os níveis de expressão e a solubilidade do complexo proteína de interesse. Alternativamente, se a purificação é necessária maior escala, as linhas celula....
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Resultados
Neste artigo, demonstrar a aplicabilidade do método de TAP para o bem caracterizado CycT1-CDK9 complexo (também conhecida como P-TEFb quinase).
Os plasmídeos que codificam ciclina T1-STREP (CycT1: S) e CDK9-FLAG (CDK9: F), ou CDK9-STREP (CDK9: S) e ciclina T1-FLAG (CycT1: F) (Tabela 1), foram transfectados em células HEK293T . Os controlos negativos incluíram as transfecções com um vector vazio e o CDK9: F ou .......
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Discussão
O protocolo aqui descrito para a expressão e o isolamento de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas não se limita à caracterização bioquímica de tais conjuntos moleculares, mas também pode ser utilizado para a identificação de novos interactores e modificações pós-traducionais que poderia regular a sua função. A utilização de etiquetas de afinidade não se restringe ao que é mencionado neste protocolo; mas a experiência sugere que o uso de STREP como o primeiro passo AP aumenta significativamente o rendi.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) do NIH sob o número de concessão R01AI114362 e pela concessão I-1782 da Fundação Welch a Iván D'Orso.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH3002.2FS | |
| Soro fetal | bovino GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH30071 | |
| Penicilina/Estreptomicina | MP Biomedicals | MP091670049 | |
| PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| Coquetel de inibidores de protease | Roche | ||
| STREP-Tactin Superflow | IBA Lifesciences | 2-1208-010 | |
| Tampão de eluição STREP-tag | IBA Lifesciences | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | F2426 | |
| Corning 100 mm &vezes; 20 mm estilo de cultura de células de poliestireno não pirogênico tratado 20/manga | Corning | ||
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Eppendorf | 022431081 | |
| Misturador Digital de Vórtice | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Rack de espuma de tubo micro de 48 furos | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Agitador Labquake rotisserie | Termo | Rolamento 415110 |
Referências
- Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
- Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
- Fields, S., Song, O.
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Reimpressões e permissões
