A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

Resumo

Descrevemos aqui um método novo, robusto e eficiente de purificação por afinidade em tandem (TAP) para a expressão, isolamento e caracterização de complexos proteicos de células eucarióticas. Este protocolo pode ser utilizado para a caracterização bioquímica de complexos discretos, bem como a identificação de novos interagentes e modificações pós-traducionais que regulam sua função.

Resumo

A purificação dos complexos de ácido nucleico de proteína-proteína-proteína activa e é essencial para a caracterização das actividades enzimáticas e de identificação de novo de novas subunidades e as modificações pós-traducionais. sistemas bacterianos para permitir a expressão e purificação de uma grande variedade de polipéptidos simples e complexos de proteínas. No entanto, este sistema não permite a purificação de subunidades proteicas que contêm modificações pós-translacionais (por exemplo, fosforilação e acetilação), e a identificação de novas subunidades reguladoras que estão apenas presentes / expressas no sistema eucariota. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de um romance, robusta e eficiente método de purificação de afinidade em tandem (TAP), utilizando Streptomyces e proteínas marcada com Flag que facilita a purificação de complexos de proteínas com proteínas marcadas no epitopo transiente ou estavelmente expresso a partir de células eucarióticas. Este protocolo pode ser aplicado para caracterizar Protein funcionalidade complexa, para descobrir modificações pós-translacionais sobre subunidades complexas, e para identificar novos componentes complexos de regulação por espectrometria de massa. Notavelmente, este método TAP pode ser aplicado para estudar complexos proteicos formados por componentes eucarióticas ou patogénicos (viral e bacteriana), obtendo-se assim uma grande variedade de oportunidades experimentais jusante. Propomos que os investigadores que trabalham com complexos de proteína poderia utilizar esta abordagem de muitas maneiras diferentes.

Introdução

Interações proteína-proteína (IBP) são fundamentais para a regulação precisa de processos biológicos ^1, e mais estudos sobre estas PPIs poder informar sobre a sua função ^2. Várias abordagens têm sido desenvolvidos para o estudo e caracterização de IPP, bem como para a identificação de novo de novos componentes de proteínas reguladoras. Em 1989, Stanley Campos e colegas relataram a levedura de dois híbridos (Y2H) ensaio ^3. Esta abordagem permite a identificação imparcial e abrangente de interactianos (de caçar) para uma proteína definida de interesse (isca) em Saccharomyces cerevisiae. Para além da sua utilidade notável para a descoberta de IPP, o ensaio Y2H pode ser utilizado para caracterizar pares de proteínas em células de levedura, que define o mínimo de domínios interactuantes, e a identificação de mutações que abolem essas interacções. Ao modificar o ensaio Y2H, IPP também pode ser estudado em células de mamíferoclass = "xref"> 4. Variações do ensaio Y2H (por exemplo, sistema de levedura de três híbridos) também pode ser aplicada ao estudo de proteínas e de ARN-ligante orgânico proteína-pequeno em células.

Outra ferramenta utilizada para estudar os IPP num sistema homólogo é o ensaio de co-imunoprecipitação (co-IP) ^5. Ao utilizar um anticorpo para imunoprecipitar uma proteína de interesse, o ensaio de co-IP permite aos investigadores monitorar IPP em células para diferentes condições ambientais e experimentais situações. A utilização de proteínas marcadas no epitopo (por exemplo, FLAG, Myc, estreptococos e HA, entre outros), a purificação por afinidade (AP) métodos facilitou o isolamento de proteínas a partir de misturas complexas de proteínas para vários ensaios a jusante, incluindo Western blot, coloração de prata , e análise enzimática. No entanto, nenhuma destas abordagens anteriores permitem o isolamento de grandes quantidades de complexos de proteínas para caracterização adicional in vitro incluindo umssays, descoberta de subunidades reguladoras por espectrometria de massa, e a identificação de modificações pós-traducionais. Uma versão melhorada do método de AP AP é chamado tandem (TAP), que é uma técnica de purificação para o estudo de IPP através da criação de uma proteína de fusão com dois epitopos que se purifica por meio de dois pontos de acesso subsequentes ^{6, 7.} Neste artigo, apresentamos uma variação do método TAP para complexos de proteína de purificação em que duas subunidades são marcadas com epítopos diferentes e depois purificado através de dois APs sequenciais (STREP AP seguido por FLAG IP). Em primeiro lugar, proporcionar uma visão minimalista da TAP (Figura 1) e, em seguida, uma descrição detalhada de todas as etapas experimentais (Figura 2), de modo que os investigadores possam aplicá-las a seu complexo de proteína de interesse.

Para demonstrar a aplicabilidade do método de TAP, nós escolhemos um bem caracterizado ciclina-CDK complexa (referido como PTEFB quinase), que é composta da subunidade reguladora da ciclina T1 (CycT1) e uma cinase (CDK9), e está envolvido na regulação da transcrição por ARN-polimerase II (pol II) ^{8, 9, 10.} P-TEFb fosforila o domínio C-terminal de pol II e os seus associados factores de alongamento negativos, o que alivia a pausa da transcrição no promotor e facilita assim a transcrição de alongamento ^{11, 12, 13.} Com essa interação conhecida em mente, STREP-marcado CycT1 e CDK9 marcado com FLAG foram mais expressos em células HEK293T. Uma experiência recíproca TAP foi realizada com CDK9 marcaram-STREP e marcado com FLAG CycT1 para validar ainda mais que a interacção da proteína é independente dos epítopos utilizados. As células foram recolhidas e lisadas 48 h após a transfecção. O ligado solúvel foi purificado por TAP (STREP AP seguido por FLAGIP). Entrada e proteínas purificadas foram analisadas por Western blot e por coloração com prata (Figura 3).

Protocolo

1. Células chapeamento

1. Um dia antes da transfecção, placa de 3,5 x 10 ⁶ células HEK293T em 10 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml estoque) por placa de 100 mm. Placa 3 - 5 100 mm pratos por experiência / condição para garantir a recuperação de proteína suficiente.
   NOTA: O número de placas tem que ser determinada para cada experiência / condição, que vai contar com os níveis de expressão e a solubilidade do complexo proteína de interesse. Alternativamente, se a purificação é necessária maior escala, as linhas celulares podem ser adaptadas para crescer em suspensão em frascos rotativos de ^2, mas este método não funciona para transfecções transientes.

2. Indução de transfecção de células ou linhas celulares estáveis

1. No dia seguinte, verifique as células ao microscópio. As células devem ser 70 - 80% confluentes antes de proceeding.
2. Transfectar as células com uma mistura total de 7 ug de ADN de plasmídeo e 21 uL de reagente de transfecção por placa de 100 mm. Transfectar as células com um vector que expressa GFP (Tabela 1) como um controlo para a eficiência da transfecção.
   NOTA: Se for utilizada uma linha celular estável semelhante HEK293-T-REX ou que induz a expressão de dois ou mais complexos subunidades em resposta à doxiciclina ^{14, 15,} o indutor terá de ser adicionado às células e incubado durante 48 h. Do mesmo modo, uma linha celular estável que induz a expressão de GFP após a adição do indutor também seria necessária para fins de validação. Avance para o passo 2.7.
3. Preparar a mistura de transfecção por placa de 100 mm. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, misturar 500 ul de DMEM suplementada com 7 ug de ADN plasmídeo total (correspondendo a dois ou mais plasmídeos). Num tubo de microcentrífuga separado, misturar 500 ul de DMEM sem suplementos with 21 ul de reagente de transfecção. Repita para cada reacção de transfecção.
4. Pipetar a solução de reagente de transfecção para a solução de DNA de plasmídeo (não misturar soluções na ordem inversa). Misturar por pipetagem de pelo menos 4 vezes.
5. Incubar esta mistura à temperatura ambiente durante 10 - 15 minutos, mas não mais do que 15 min.
6. Inclinar a placa para criar um reservatório de meios de comunicação e cuidadosamente pipetar a mistura de transfecção gota a gota, sobre o lado interior da placa, sem perturbar as células. Devolver o prato à sua posição original plana e homogeneizar suavemente para distribuir a mistura.
7. Incubar as células a 37 ° C numa incubadora de cultura de célula humidif içada com 5% de CO ₂ (esta condição é a seguir referido como "tecido incubadora de cultura"). Substitua a mídia 5 horas após a transfecção (opcional).

3. A transfecção corrente ou Eficiência Indução

1. Às 24 h pós-transfecção, visualizar as células sob uma gripemicroscópio orescent para verificar a eficiência de transfecção (ou indução de linha de células estável controle HEK293T-Rex expressando GFP). Incubar por mais 24 horas.

4. Purificação de Afinidade STREP (STREP AP)

1. Recolher as células
   1. Em 48 horas após a transfecção, remova a mídia e adicionar 8 ml de solução salina 1x frio fosfato tamponada (PBS). Pipeta-se para baixo e para separar as células a partir da placa.
   2. Recolha e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifugar a células para baixo a 800 * g durante 4 min a 4 ° C.
   3. Remover o sobrenadante de PBS. Repetir a rotação para baixo (800 xg durante 1 min a 4 ° C) para eliminar qualquer PBS residual. Armazenar o sedimento de células a -80 ° C para uso futuro ou siga o procedimento a seguir para continuar a purificação de proteínas.
2. Lisar as células
   1. Ressuspender as peletes de células utilizando 5 x o volume de sedimento de células (~ 250 mL por placa) de Passive Lysis Buffer(PLB: Tris-HCl 20 pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 _mM, DTT 1 mM, protease de cocktail inibidor de comprimido, 5% v / v de glicerol, e 1,0% de NP-40) e transferir a suspensão de células para uma 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
   2. Resumidamente vortex a suspensão e nutar durante 30 min a 4 ° C.
   3. Girar a suspensão de células a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
   4. Transfira os lisados ​​solúveis para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e descartar os sedimentos celulares. Guardar a 10% do volume final do lisado solúvel como "entrada STREP AP." Armazenar a 4 ° C.
3. Equilibrando as contas STREP
   NOTA: Use STREP esferas para o primeiro passo AP! Complexos puxado para baixo com contas STREP recuperar significativamente mais proteína do que as puxou para baixo com contas de bandeira.
   1. Retire (N × 40 ul) + N ul da suspensão STREP talão 50% (n = número de amostras) e girar a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C.
      NOTA: Use de toda a mdicas outhed a esferas de pipeta.
   2. Remover o sobrenadante e adicionar 500 mL de PLB às pérolas. Nutar a mistura grânulos durante 5 min a 4 ° C. Girar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C.
      1. Repetir para um total de 3 lavagens. Ressuspender as esferas em PLB para um volume final de 40 ul N ×.
   3. Adicionar 40 ul de 50% de pasta STREP talão para cada amostra de ligado celular e nutar durante 2 horas a 4 ° C.
4. STREP AP
   1. Spin down solução a 1.500 g durante 2 min a 4 ° C.
   2. Remover o sobrenadante e armazenar como "STREP-AP por meio de fluxo (FT)" a 4 ° C.
   3. Adicionar 500 ul de Tampão de Lavagem STREP AP I (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 250 mM, _MgCl2 1,5 mM, DTT 1 mM, 5% de glicerol e 0,2% de NP-40) para os grânulos. Nutar a mistura grânulos durante 5 min a 4 ° C e centrifugação a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante.
      1. Repetir para um total de 4 lavagens.
         NOTA: Antes da quarta lavagem, transferir a solução de grânulos para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml para reduzir o fundo de proteína. Este passo é essencial.
   4. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, e EDTA 1 mM) e equilibrar as contas por inversão dos tubos. Girar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante.
   5. Eluir a proteína de interesse com 50 ul de tampão de eluição STREP (Tris-HCl 100 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, destiobiotina 2,5 mM e). Vortex a 800 rpm durante 15 min a 4 ° C.
   6. Girar as esferas a 1.500 xg durante 1 min a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante. Esta fracção corresponde à amostra "A eluição STREP AP".
   7. Guardar a fracção de esferas, a 4 ° C durante uma segunda eluição, que pode produzir-se a metade da quantidade de proteína obtida com a primeira eluição. Alíquota de 10% do AP STREP eluição por coloração com prata e / ou transferência de western^16.
5. Equilibrando as contas BANDEIRA
   1. Retire (nx 16 ul) + n ul de solução de esferas de FLAG (n = número de amostras) e girar a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C.
      NOTA: Use dicas de boca larga a contas pipeta.
   2. Remover o sobrenadante e adicionar 500 mL de tampão de lavagem FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, e 0,1% de NP-40) para os grânulos. Girar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repetir para um total de 3 lavagens.
   3. Ressuspender as pérolas em tampão de lavagem FLAG para um volume final de 16 ul NX.
   4. Adicionar 16 ul da suspensão FLAG grânulo para o restante eluição STREP AP e durante a noite a 4 ° nutar C.

5. FLAG IP

1. Spin down a suspensão esferas BANDEIRA a 1.500 g durante 2 min a 4 ° C. Salve o sobrenadante e armazenar como a "bandeira IP Flow-through" (FT) a 4 ° C.
2. Adicionar 50081; l de tampão de lavagem FLAG para a solução. Nutar durante 5 min a 4 ° C e centrifugação a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repetir para um total de 4 lavagens e remover o sobrenadante depois de cada lavagem.
   NOTA: Antes da quarta lavagem, transferir a solução de proteína de grânulos para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml para reduzir o fundo. Este passo é essencial.
3. Retirar o sobrenadante do centrifugação final e adicionar 30 uL de tampão de lavagem FLAG contendo 200 ng / mL de péptido FLAG nas pérolas. Vortex a 800 rpm durante 2 horas a 4 ° C.
4. Girar a suspensão a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Colher o sobrenadante e armazenar a 4 ° C como o "BANDEIRA IP eluição."
   NOTA: As amostras de eluição pode ser confirmada por coloração de prata e / ou transferência de Western utilizando protocolos padrão de ^16, e está pronto para mais ensaios de proteína. Ao configurar um western blot, execute todas as seguintes amostras: (1) STREP AP entrada, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elution, (4) BANDEIRA IP FT, e (5) BANDEIRA IP eluição. Volumes carregados terá de ser determinado para cada experimento. Todas as amostras recolhidas e contas podem ser armazenadas a 4 ° C para armazenagem a curto prazo e a -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Amostras de TAP podem ser analisados por espectrometria de massa para verificar a identidade dos seus componentes, para identificar novas modificações pós-traducionais (PTMs), e / ou para descobrir qualquer interacção nova proteína com o complexo purificado ^{2, 17.} Para este efeito, após a execução de um gel de mancha de Coomassie ou prata, as bandas podem ser excisadas a partir do gel utilizando um bisturi limpa. Vários excelentes comentários que discutem métodos de espectrometria de massa foram publicados anteriormente ^{18, 19.}

Resultados

Neste artigo, demonstrar a aplicabilidade do método de TAP para o bem caracterizado CycT1-CDK9 complexo (também conhecida como P-TEFb quinase).

Os plasmídeos que codificam ciclina T1-STREP (CycT1: S) e CDK9-FLAG (CDK9: F), ou CDK9-STREP (CDK9: S) e ciclina T1-FLAG (CycT1: F) (Tabela 1), foram transfectados em células HEK293T . Os controlos negativos incluíram as transfecções com um vector vazio e o CDK9: F ou ...

Discussão

O protocolo aqui descrito para a expressão e o isolamento de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas não se limita à caracterização bioquímica de tais conjuntos moleculares, mas também pode ser utilizado para a identificação de novos interactores e modificações pós-traducionais que poderia regular a sua função. A utilização de etiquetas de afinidade não se restringe ao que é mencionado neste protocolo; mas a experiência sugere que o uso de STREP como o primeiro passo AP aumenta significativamente o rendi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH3002.2FS
Soro fetal	bovino GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH30071
Penicilina/Estreptomicina	MP Biomedicals	MP091670049
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688
Coquetel de inibidores de protease	Roche
STREP-Tactin Superflow	IBA Lifesciences	2-1208-010
Tampão de eluição STREP-tag	IBA Lifesciences	2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	F2426
Corning 100 mm &vezes; 20 mm estilo de cultura de células de poliestireno não pirogênico tratado 20/manga	Corning
Protein Lo-Bind Eppendorf	Eppendorf	022431081
Misturador Digital de Vórtice	Fisher Scientific	02-215-370
Rack de espuma de tubo micro de 48 furos	Fisher Scientific	02-215-386
Agitador Labquake rotisserie	Termo	Rolamento 415110