Aqui, apresentamos os protocolos que foram usados com sucesso para a coleta de espermatozoides de golfinho, criopreservação e desempenho de fertilização in vitro heterólogo usando oócitos bovinos.
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Artigo de método
Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) espermatozoides: recolha, criopreservação e heterólogo fertilização In Vitro
Neste artigo
Resumo
Resumo
O uso de espermatozoides criopreservados golfinho facilita a troca de material genético entre parques aquáticos e torna espermatozoides acessível aos laboratórios para estudos aprofundar nossa compreensão da reprodução de mamíferos marinhos. Fertilização in vitro heterólogo, um substituto para fertilização in vitro homólogo, poderia fornecer um meio para testar a fertilidade do esperma potencial; para estudar a fisiologia de gametas e desenvolvimento precoce do embrião; e para evitar o uso de oócitos valioso golfinho, que são difíceis de obter. Aqui, apresentamos os protocolos que têm sido utilizados com sucesso para recolher e cryopreserve espermatozoides de golfinho. A colheita de sémen é executada pela estimulação manual sobre golfinhos treinados. Criopreservação é realizada usando um extensor de gema de ovo com base TRIS com glicerol. Além disso, apresentamos um protocolo que descreve a fertilização in vitro heterólogo usando espermatozoides golfinho e oócitos bovinos e que verifica a natureza híbrida do embrião resultante usando PCR. Fertilização heteróloga gera perguntas sobre fertilização e pode ser usada como uma ferramenta para estudar a fisiologia de gametas e desenvolvimento precoce do embrião. Além disso, o sucesso da fertilização in vitro heterólogo demonstra o potencial desta técnica para testar o esperma de golfinho fertilizando a capacidade, o que vale a pena o exame adicional.
Introdução
Tecnologias de reprodução assistida estão pouco desenvolvidas em animais selvagens, incluindo os mamíferos marinhos. A falta de métodos sensíveis para avaliar o sucesso de fertilização esperma contribui para o desenvolvimento de tecnologias de reprodução de espécies como o golfinho. Não era até recentemente que os parâmetros básicos seminais do golfinho-roaz (Tursiops truncatus) foram relatados1,2. No entanto, variáveis, tais como a motilidade e morfologia, embora amplamente utilizado, dar informações limitadas sobre a eficiência reprodutiva. O melhor indicador da qualidade do esperma é a avaliação do....
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Protocolo
declaração de ética: todos os procedimentos experimentais foram revistos e aprovados pelo Comitê de uso do Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) e institucionais Cuidado Animal. Todos os experimentos foram realizados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, tal como adoptadas pela sociedade para o estudo da reprodução e para o Animal Welfare Act para cuidar dos mamíferos marinhos.
1. coleção de esperma de golfinho e criopreservação
- preparação
- fazer FERT médio (heparina e hypotaurine-livre). Preparar suplementado FERT-TALP com bicarbona....
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Resultados
Todos os resultados, tabelas e figuras (1 e 2) aqui apresentadas foram reproduzidas com permissão3.
Espermatozoides de golfinho tem alta mobilidade após congelação e descongelação
A golfinho congelado-descongelar ejacula mostrou percentagens (% ± DP) de 84.5 ± 5,3 total motile e 69,1 ± 5,1 espermatozoides móveis progressivos. Em termos de mobilidad.......
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Discussão
Para muitas espécies diferentes de mamíferos, existem diversas vantagens em usar o esperma congelado-descongelar. Estes incluem a capacidade de transferir material genético valioso, o potencial para distribuição em todo o mundo, o baixo risco de contaminação e a capacidade de preservar os gametas masculinos por décadas. O uso de espermatozoides criopreservados é essencial para o golfinho, porque esta espécie está protegida sob o apêndice II da CITES, que limita o transporte e o intercâmbio de animais entre diferentes par.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
seu trabalho foi financiado pelo Ministério da economia e competitividade (AGL2015-70140-R a D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan e J. F. Pérez-Gutiérrez e Seneca Fundação de Murcia (Grant 20040/GERM/16 para F. García-Vázquez) espanhol
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| FERT-TALP médio | Merck | ||
| TCM-199 | Sigma | M-4530 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 | |
| Pratos de 4 poços | Nunc | 176740 | |
| Gradiente de densidade BoviPure | Nidacon International | BP-100 | |
| Solução de lavagem Boviwash | Nidacon International | BW-100 | |
| Cloreto de magnésio | Promega | A35 1H | |
| Água estéril | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H | |
| Buffer Tris Borato EDTA | Sigma | T4415 | |
| MB agarose | Biotools | 20.012 | |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A | |
| MB agarose | Biotools | 20.012 | |
| Taq polimerase | Promega | ||
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A | |
| Câmara de contagem Makler | Câmara Sefi Medical | ||
| Thoma | Hecht-Assistant | ||
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | ||
| Osmômetro Micro osmômetro avançado 3300 | Norwood | ||
| Sistema de análise de esperma assistido por computador | Projectes y Serveis I+D | ||
| Estereomicroscópio MZ 95 | Leica | ||
| Óptica epifluorescente Eclipse Te300 | Nikon | ||
| Software de assistente confocal 4.02 | Software de | Bio-Rad 3D | |
| Microscopia confocal de varredura a laser | Bio-Rad | ||
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | ||
| Tubos de microcentrífuga | VWR | ||
| Iluminador UV | Bio-Rad | ||
| PCR Termociclador Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
Referências
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al.
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Reimpressões e permissões
