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Artigo de método

Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

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DOI:

10.3791/55255

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24 de maio de 2017

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1Stem Cell and Regenerative Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR, 2Computational and Systems Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR

Neste artigo

Resumo

Aqui, detalhamos o método de equação de S de sorgo de P soralen reticulado, L igado e Híbridos H elegidos (SPLASH), que permite o mapeamento genômico de interações intramoleculares e intermoleculares RNA-RNA in vivo . SPLASH pode ser aplicado para estudar os interactomas de RNA de organismos, incluindo leveduras, bactérias e seres humanos.

Resumo

Saber como os RNAs interagem entre si e com os outros é fundamental para entender a regulação genética baseada no RNA na célula. Embora existam exemplos de interacções ARN-ARN, tais como interacções ARNm-ARNm, mostrou-se que regulam a expressão genética, a extensão total em que as interacções ARN ocorrem na célula é ainda desconhecida. Métodos anteriores para estudar as interações de RNA focaram principalmente em subconjuntos de RNAs que estão interagindo com uma determinada proteína ou espécies de RNA. Aqui, detalhamos um método chamado S equenciamento de P soralen reticulado, L igated, e S elegido H ybrids (SPLASH) que permite a captura do genoma de ARN interações in vivo de forma imparcial. SPLASH utiliza reticulação in vivo , ligação de proximidade e sequenciação de alto rendimento para identificar parceiros de ligação de bases de ARN intramoleculares e intermoleculares globalmente. SPLASH pode ser aplicado a diferentes organismos, incluindo bactérias, leveduras e células humanas, bemS diversas condições celulares para facilitar a compreensão da dinâmica da organização do RNA sob diversos contextos celulares. Todo o protocolo SPLASH experimental leva cerca de 5 dias para ser concluído eo fluxo de trabalho computacional leva aproximadamente 7 dias para ser concluído.

Introdução

Estudar como as macromoléculas se dobram e interagem entre si é a chave para a compreensão da regulação genética na célula. Embora muitos esforços tenham sido focados na década passada na compreensão de como o DNA e as proteínas contribuem para a regulação genética, relativamente menos se sabe sobre a regulação pós-transcricional da expressão gênica. O ARN contém informação tanto na sua sequência linear como na sua estrutura secundária e terciária 1 . Sua capacidade de basear o par com si e com os outros é importante para a sua função in vivo . Os avanços recentes na sondagem de estrutura secundária de RNA de alto rendimento proporcionaram informações valiosas sobre as localizações de regiões duplas e de cadeia simples no transcriptoma 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer informações sobre o emparelhamento interação parceiros ainda está em grande parte ausente. Para determinar qual a sequ�cia de ARN que interage com outra regi� de ARN no transcriptoma, necessitamos de informa�o global de pares.

Mapear par-sábio RNA interações em um global, imparcial forma tem sido tradicionalmente um grande desafio. Embora as abordagens anteriores, tais como CLASH 9 , hiCLIP 10 e RAP 11 , sejam usadas para identificar as interações de RNA em uma maneira de grande escala, essas técnicas tipicamente mapeiam o par de bases de RNA para um subconjunto de RNAs que interagem com uma determinada proteína ou espécies de RNA. Os desenvolvimentos recentes no estudo de interacções de ARN globais incluem o método RPL 12 , que não estabiliza as interacções de ARN in vivo e, portanto, só pode capturar um subconjunto de interacções in vivo . Para superar esses desafios, nós e outros desenvolvemos estratégias genéticas, semP ARN interacional in vivo , utilizando versões modificadas do reticulador psoraleno 13 , 14 , 15 . Neste protocolo, descrevemos os pormenores para realizar a equalização de S de Hélidos H reticulados, S igated e S elegidos por P soralen (SPLASH), que utiliza psoraleno biotinilado para reticular ARNs de emparelhamento de bases in vivo , seguido por ligação de proximidade e sequenciação de alto rendimento a Identificar parceiros de ARN-base de ligação genoma-wide ( Figura 1 ] 15 .

Neste manuscrito, descrevemos as etapas para realizar SPLASH usando células aderentes cultivadas, neste caso células HeLa. O mesmo protocolo pode ser facilmente adaptado a células de mamífero de suspensão e a células de levedura e bactérias. Resumidamente, as células HeLa são tratadas com psoraleno biotinilado e irradiadas a 365 nm para interligar os pares de bases de ARN em interacção in vivo. Os RNAs são então extraídos das células, fragmentados e enriquecidos para regiões de reticulação usando esferas de estreptavidina. Os fragmentos de ARN que interagem são então ligados em conjunto utilizando ligadura de proximidade e transformados numa biblioteca de cDNA para sequenciação profunda. Após sequenciação, os ARN quiméricos são mapeados no transcriptoma / genoma para identificar as regiões que interagem com o ARN que estão emparelhadas entre si. Utilizamos com sucesso SPLASH para identificar milhares de interações de RNA in vivo em leveduras e diferentes células humanas, incluindo emparelhamento de ARN intramolecular e intermolecular em diversas classes de RNAs, como snoRNAs, lncRNAs e mRNAs, vislumbrando os padrões de organização estrutural e interação De RNAs na célula.

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Protocolo

1. Tratamento de Células HeLa com Extracção de Psoraleno e ARN Biotinilados

  1. Células HeLa de cultura em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina estreptomicina (PS) numa placa de 10 cm.
  2. Lavar as células HeLa duas vezes com 5 mL de 1x PBS. Drene excesso de PBS completamente do prato, colocando o prato verticalmente por 1 min.
  3. Adicionar 1 mL de PBS contendo 200 μM de psoraleno biotinilado e 0,01% p / v de digitonina, às células uniformemente e incubar a 37 ° C durante 5 min. Enquanto o psoraleno biotinilado pode entrar na célula, a sua permeabilidade é muito maior quando as células são expostas a baixas quantidades de digitonina (0,01%) durante 5 min
  4. Remover a tampa da placa de 10 cm contendo as células HeLa tratadas e colocar o prato plano sobre gelo. Irradiar o prato que contém as células com 365 nm UV durante 20 min em gelo, a uma distância de 3 cm das lâmpadas UV, utilizando o reticulador UV.
  5. IsolarOtal de células HeLa por extracção de tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio de acordo com o protocolo do fabricante. Adicionar volume 1: 1 de isopropanol para precipitar o ARN à temperatura ambiente durante 30 min.
    Ponto de Pausa: O RNA pode ser armazenado a -20 ° C em isopropanol indefinidamente. Pode realizar-se uma transferência de pontos nesta etapa para verificar se o psoraleno biotinilado penetrou com sucesso nas células e tinha RNAs reticulados in vivo ( Figura 2 ).
  6. Centrifugar o ARN precipitado a 20 000 xg durante 30 min a 4 ° C para recuperar o ARN. Remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de etanol frio a 70% ao sedimento de ARN para lavar o ARN.
  7. Centrifugar as amostras a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e secar ao ar a pastilha durante 5 min à temperatura ambiente.
  8. Adicionar nuclease água livre para o RNA pellet e quantificar a concentração de RNA usando UV espectrômetro.
    Ponto de Pausa: O ARN pode ser armazenado a -80 ° C após fCongelamento de chicote em nitrogênio líquido.

2. Fragmentação de RNA

  1. Pré-aqueça 15 μL de 2x tampão de fragmentação de ARN e 10 μL da amostra de RNA (1 μg / μL) individualmente em tubos de PCR de 0,2 mL, a 95 ° C durante 1 min. Misturam 10 μL do tampão de fragmentação de ARN 2x aquecido com 10 μL de amostra de ARN pipetando para cima e para baixo. Incubar a amostra a 95 ° C durante 5 min. Parar a reação por arrefecimento rápido da reação em gelo.
  2. Transferir e juntar as 2 reacções de fragmentação a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicionar 40 μL de água livre de nuclease à reacção, 10 μL de acetato de sódio 3 M, 1 μL de glicogénio e 300 μL de etanol a 100% para a reacção de fragmentação. Incubar o ARN a -20 ° C durante pelo menos 1 h para precipitar o ARN.
  3. Centrifugar o ARN precipitado a 20.000 xg durante 30 min, remover o sobrenadante e lavar o ARN usando 1 mL de etanol a 70%.
  4. Centrifugar o ARN a 20.000 xg durante 15 min, remOve o sobrenadante e dissolver o ARN em 20 μL de água livre de nuclease.

3. Selecção e eluição de tamanhos de ARN

  1. Adicionar 20 μL de corante de carga de ARN ao ARN recuperado no tubo de microcentrífuga. Aquecer o ARN com o corante de carga de RNA a 95 ° C durante 3 min e colocá-lo em gelo durante 2 min.
  2. Adicionar 3 μL de corante de carga de RNA a 0,25 μL de escada de ADN de 10 nt num tubo de microcentrífuga. Aquecer a escada a 95 ° C durante 3 min e colocá-lo em gelo por 2 min.
  3. Carregar a escada desnaturada e as amostras num gel de ureia TBE 8,6 cm x 6,8 cm 6% e fraccionar o tamanho por electroforese durante 40 min a 180 V. Manchar o gel em 10 mL de tampão TBE contendo 1: 10.000 de mancha de gel de ácido nucleico durante 5 Min no escuro.
  4. Perfure um tubo de microcentrífuga limpo de 0,6 mL na parte inferior usando uma agulha de 24 G e coloque-o em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
  5. Visualize as bandas no gel pós-corado utilizando um transiluminador e corte uma fatia de gel correspondente a 90-110 nt. Transfira a fatia de gel para o tubo de microcentrífuga perfurado de 0,6 mL no tubo de microcentrífuga de 2 mL. Esta selec�o de tamanho �realizada para permitir que os fragmentos quim�icos tenham um comprimento m�imo para mapear para o transcriptoma e para distinguir entre produtos ligados de proximidade versus produtos n� ligados em etapas de selec�o de tamanho a jusante.
  6. Centrifugar as fatias de gel a 12.000 xg à temperatura ambiente durante 2 minutos para triturar a fatia de gel e recolhê-la no tubo de microcentrífuga de 2 mL. Descarte o tubo vazio de microcentrifugadora de 0,6 mL. Adicionar 700 μL de tampão de eluição à fatia de gel triturada no tubo de microcentrífuga de 2 mL e incubar a 4 ° C durante a noite com rotação constante, para permitir a difusão das amostras para o tampão.
  7. Transferir as fatias de gel e o tampão de eluição para um filtro de tubo de centrífuga e centrifugar a 20.000 xg durante 2 min. As fatias de gel serão aprisionadas no compartimento superior do filtro. Descarte as fatias de gel e o compartimento superior.
  8. Adicionar 1 μL de glicogênio e 700 μL de 100% de isopropanol ao filtrado no tubo de microcentrífuga e precipitar o ARN a -20 ° C durante pelo menos 1 h ou durante a noite.
    Ponto de Pausa: O ARN pode ser precipitado indefinidamente em isopropanol a -20 ° C.
  9. Centrifugar o ARN precipitado a 20 000 xg durante 30 min a 4 ° C para recuperar o ARN. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de etanol frio a 70% para lavar a pastilha de RNA. Centrifugar o sedimento lavado a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
  10. Remover o tampão de lavagem e adicionar 20 μL de água livre de nuclease para ressuspender o RNA. Quantificar a concentração de RNA utilizando um espectrómetro UV.
    Ponto de Pausa: O RNA pode ser armazenado a -80 ° C após congelamento rápido em nitrogênio líquido.

4. Enriquecimento de regiões de reticulação de ARN

  1. Vortex estreptavidina revestido magnético grânulos vigorosamente para ressuspender as esferas homogênea no tubo. Transferir 100 μL de esferas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e colocá-lo em um ímãDurante 1 min para permitir que os grânulos furem ao lado magnético do tubo. Remova cuidadosamente o tampão de armazenamento dos grânulos e retire o tubo do suporte magnético.
  2. Adicionar 1 mL de Lysis Buffer às pérolas no tubo de microcentrífuga e pipetar para cima e para baixo. Colocar a microcentrífuga contendo esferas no suporte magnético durante 1 min para separar as esferas do tampão de lavagem. Repita este procedimento para um total de 3 lavagens.
  3. Remover o tampão de lavagem dos grânulos, colocando o microfuge contendo grânulos sobre o suporte magnético durante 1 min. Adicionar inibidor de RNase (1: 200) ao tampão de lise e adicionar 100 μL de tampão de lise às contas lavadas no tubo de microcentrífuga.
  4. Adicionar 2 mL de Tampão de Hibridização recentemente preparado, 1 mL de tampão de lise suplementado, 1,5 μg de ARN fraccionado de tamanho e 100 μL de esferas ressuspendidas para um tubo de centrifugação cónico de 15 mL. Vortex o tubo suavemente.
  5. Incubar o tubo de centrífuga cônica de 15 mL a 37 ° C por 30 min com rotação de ponta a ponta.Pré-aquecer o tampão de lavagem a 37 ° C.
  6. Coloque os tubos de centrifugação cônicos de 15 mL em um suporte magnético para tubos de 15 mL por 2 min para separar as esferas do tampão. Pipetar o tampão cuidadosamente para fora do tubo e descartá-lo.
  7. Adicionar 1 mL de tampão de lavagem pré-aquecido para as pérolas, pipetar para cima e para baixo e transferir as esferas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Incubar nas contas a 37 ° C durante 5 min, com rotação de extremidade a extremidade.
  8. Centrifugar rapidamente o conteúdo do tubo de microcentrífuga. Colocar as pérolas lavadas de 1,5 mL em tubos de microcentrífuga num suporte magnético para tubos de 2 mL durante 1 min, para separar as esferas do tampão de lavagem. Remova o tampão dos grânulos, pipetando suavemente o tampão para fora do tubo de microcentrífuga.
  9. Adicionar 1 mL de tampão de lavagem pré-aquecido para as esferas e pipeta para cima e para baixo para repetir a lavagem. Realizar um total de 5 lavagens. No final da 5ª lavagem, remova o tampão de lavagem colocando a microcentrífuga contendo grânulos no suporte do magneto para1 minuto.

5. Ligação de Proximidade

  1. Adicionar 1 mL de tampão de polinucleótido quinase T4 frio (PNK) às esferas lavadas e incubar as esferas durante 5 min a 4 ° C, com rotação de extremidade a extremidade. Coloque o tubo de microcentrífuga contendo os grânulos na tira magnética durante 1 min e retire suavemente o tampão T4 PNK. Repita este passo para um total de 2 lavagens e remova o tampão T4 PNK após a última lavagem.
  2. Adicionar tampões às contas, de acordo com a Tabela 1 . Para permitir que as extremidades 3 'do fragmento de ARN sejam ligadas a adaptadores 3' abaixo, incubar as esferas no tampão a 37 ° C durante 4 h com agitação constante para converter o grupo fosfato cíclico 3 'na extremidade do RNA para 3 'OH.
  3. Adicionar tampões à reacção anterior, de acordo com a Tabela 2 . Para permitir que a extremidade 5 'dos ​​fragmentos de ARN seja capaz de ligar, incubar a reacção a 37 ° C durante 1 h com agitação constante na presença de ATP, Para converter 5 'OH no ARN em 5' fosfato.
  4. Adicionar tampão à reacção anterior para realizar a ligação de proximidade, de acordo com a Tabela 3 . Incubar a reacção a 16 ° C durante 16 h, com agitação constante,
  5. Colocar a microcentrífuga contendo o ARN ligado num suporte magnético durante 1 min. Remover cuidadosamente o sobrenadante e adicionar 1 mL de tampão de lavagem à temperatura ambiente às contas. Ressuspender pipetando para cima e para baixo.
  6. Coloque o tubo de microcentrífuga sobre o suporte do magneto durante 1 min e remova cuidadosamente o tampão de lavagem. Realizar um total de 2 lavagens, e remover o tampão de lavagem dos grânulos no final da segunda lavagem.
  7. Adicionar 100 μL de RNA PK Buffer às pérolas e ressuspender pipetando para cima e para baixo. Aquecer as amostras a 95 ° C durante 10 min num bloco de calor.
  8. Arrefecer a amostra em gelo durante 1 min e adicionar 500 μL de tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio à amostra. Misture agitando vigorosamente durante 10 s. Incubar o mixtuTemperatura ambiente durante 10 min.
    Ponto de Pausa: O ARN pode ser armazenado em tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio a -80 ° C durante um par de meses.
  9. Adicionar 100 μL de clorofórmio às amostras extraídas com tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio. Vortex vigorosamente durante 10 s. Centrifugar as amostras a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
  10. Transferir 400 μL da camada aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 800 μL (2 volumes) de etanol a 100% e misturar pipetando para cima e para baixo.
  11. Transfira a solução de RNA para as colunas de limpeza de RNA e recupere o RNA seguindo as instruções do fabricante, garantindo que mesmo os RNAs pequenos sejam retidos. Eluir o ARN em 100 μL de água isenta de nuclease.
    Ponto de Pausa: O RNA pode ser armazenado a -80 ° C após congelamento rápido em nitrogênio líquido.

6. Reticulação Reversa de Psoraleno Biotinilado

  1. Transferir os 100 μL das amostras eluídas para um poço de 24 pocomeu. Remover a tampa e irradiar a amostra sob UV 254 nm, durante 5 min em gelo.
  2. Transferir a amostra reticulada inversa para um tubo de microcentrífuga limpo. Adicionar 10 μL de acetato de sódio, 1 μL de glicogénio e 300 μL de etanol a 100% e precipitar o RNA a -20 ° C durante pelo menos 1 h ou de um dia para o outro.
    Ponto de Pausa: O ARN pode ser precipitado em etanol indefinidamente a -20 ° C.
  3. Centrifugar o ARN precipitado a 20 000 xg durante 30 min a 4 ° C para recuperar o ARN. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de etanol frio a 70% para lavar a pastilha de RNA.
  4. Centrifugar o sedimento lavado a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Remover o tampão de lavagem e adicionar 4,25 μL de água livre de nuclease para ressuspender o RNA. Transfira o RNA para um tubo de PCR de 0,2 mL.
    Ponto de Pausa: O RNA pode ser armazenado a -80 ° C após congelamento rápido em nitrogênio líquido.

7. Reverse Transcription and cDNA Circularization

  1. Adicionar 0,75 μLDe ligante de ARN (0,5 μg / μL) à amostra ressuspensa em tubo de PCR e aquecer a 80 ° C durante 90 s. Colocar a amostra em gelo durante 2 min.
  2. Adicionar os tampões à amostra desnaturada para ligar o adaptador 3 ', de acordo com a Tabela 4 . Incubar a reacção a 25 ° C durante 2,5 h.
  3. Transferir a reacção para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 90 μL de água livre de nuclease à reação, seguido por 10 μL de acetato de sódio, 1 μL de glicogênio e 300 μL de etanol a 100%. Precipitar o ARN a -20 ° C durante pelo menos 1 h ou durante a noite.
    Ponto de Pausa: O ARN pode ser precipitado em etanol indefinidamente a -20 ° C.
  4. Centrifugar o ARN precipitado a 20 000 xg durante 30 min a 4 ° C para recuperar o ARN. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de etanol frio a 70% para lavar a pastilha de RNA.
  5. Centrifugar o sedimento lavado a 20 000 g durante 15 min a 4 ° C. Remover o tampão de lavagem ressuspender o sedimento em 5 μL de n livre de nucleaseAter
  6. Adicionar 5 μL de corante de carga de ARN ao ARN recuperado no tubo de microcentrífuga. Aquecer o ARN com o corante de carga de RNA a 95 ° C durante 3 min e colocá-lo em gelo durante 2 min.
  7. Adicionar 3 μL de corante de carga de RNA a 0,25 μL de escada de ADN de 10 nt num tubo de microcentrífuga. Aquecer a escada a 95 ° C durante 3 min e colocá-lo em gelo por 2 min.
  8. Realizar o fraccionamento de tamanho utilizando 8,6 cm x 6,8 cm 6% de gel de ureia TBE como nos passos 3.3 e 3.4.
  9. Visualize o gel corado com mancha de ácido nucleico utilizando o transiluminador e corte uma fatia de gel correspondente a 110-140 nt na escada. Transfira a fatia de gel para o tubo de microcentrífuga perfurado de 0,6 mL no tubo de microcentrífuga de 2 mL e siga o protocolo das etapas 3,6- 3,9.
  10. Adicionar 5 μL de água livre de nuclease para ressuspender a pastilha de RNA. Transfira o RNA para um tubo de PCR de 0,2 mL.
    Ponto de Pausa: O RNA pode ser armazenado a -80 ° C após congelamento rápido em nitrogênio líquido.
  11. Adicionar 1 μL de iniciador RT a 1,2581; M ao ARN em tubo de PCR e aquecer a 80 ° C durante 2 min. Colocar a amostra em gelo durante 2 min.
  12. Adicionar os tampões para transcrição reversa de acordo com a Tabela 5 . Incubar a reacção a 50 ° C durante 30 min.
  13. Adicionar 1,1 μL de NaOH 1 N à reacção e aquecer a 98 ° C durante 20 min. Colocar a reacção sobre gelo.
  14. Transferir a reacção para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 90 μL de água livre de nuclease à reação, seguido por 10 μL de acetato de sódio, 1 μL de glicogênio e 300 μL de etanol a 100%. Precipitar o ADN a -20 ° C durante pelo menos 1 h ou durante a noite.
    Ponto de Pausa: O DNA pode ser precipitado indefinidamente em etanol a -20 ° C.
  15. Centrifugar o ADN precipitado a 20 000 g durante 30 min a 4 ° C para recuperar o ADN. Remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de etanol frio a 70% para lavar a pastilha de ADN. Centrifugar o sedimento lavado a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Remover o tampão de lavagem ressuspender o pelDeixe entrar 5 μL de água livre de nuclease.
  16. Realizar o fraccionamento de tamanho utilizando 8,6 cm x 6,8 cm 6% de gel de ureia TBE como nos passos 3.3 e 3.4.
  17. Visualize o gel pós-corado usando o transiluminador e corte uma fatia de gel correspondente a 200-240 nt na escada. O cDNA transcrito inverso é agora 96 ​​bases mais comprido do que o fragmento de ARN devido à adição do iniciador RT de 96 bases. Transfira a fatia de gel para o tubo de microcentrífuga perfurado de 0,6 mL no tubo de microcentrífuga de 2 mL.
  18. Centrifugar as fatias de gel a 12.000 xg à temperatura ambiente durante 2 minutos para triturar a fatia de gel e recolhê-la no tubo de microcentrífuga de 2 mL. Descarte o tubo vazio de microcentrifugadora de 0,6 mL.
  19. Adicionar 700 μL de tampão de eluição à fatia de gel triturada no tubo de microcentrífuga de 2 mL e incubar a 37 ° C durante 2 h com rotação constante. Siga o protocolo conforme descrito nas etapas 3.7 a 3.8.
  20. Adicionar 6 μL de água livre de nuclease para ressuspender a pastilha de ADN. Transferir o DNA para um tubo de PCR de 0,2 mL.
    Ponto de Pausa: O DNA pode ser armazenado a -80 ° C após congelamento rápido em nitrogênio líquido.
  21. Adicionar os tampões à reacção para a circularização de cDNA, de acordo com a Tabela 6 . Incubar a reacção a 60 ° C durante 1 hora e aquecer a 80 ° C durante 10 minutos para inactivar a reacção.
  22. Transferir a reacção para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Purificar o cDNA circularizado utilizando uma coluna de limpeza de ADN de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar 20 μL de água livre de nuclease à coluna para eluir o cDNA purificado.
    Ponto de Pausa: O DNA pode ser armazenado a -20 ° C por um par de meses.

8. Amplificação por PCR (PCR de pequena escala)

  1. Adicionar os tampões à reacção de acordo com a Tabela 7 para amplificação por PCR para testar o número mínimo de ciclos necessários para a amplificação da biblioteca.
  2. Configure as condições de ciclagem de PCR de acordo com a Tabela 8 . Pausar a reacção e transferir 5 μL deA reacção de PCR a 10, 15 e 20 ciclos, em tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mL.
  3. Adicionar 1 μL de corante de carga de gel de DNA 6x a cada uma das 5 μL de reação de PCR nos diferentes ciclos. Realizar electroforese em gel num gel de agarose a 3%, a 120 V, durante 1 h para visualizar os produtos de PCR.
    1. Utilize o menor número de ciclos de PCR (Y) que mostram amplificação em torno de 250 bases (na Figura 3 , existe uma banda forte a 15 ciclos de amplificação e uma banda fraca em 10 ciclos. Gerar material suficiente para sequenciamento profundo, uma vez que a quantidade de cDNA utilizada é 10 vezes superior à da amplificação por PCR em pequena escala).

9. Amplificação por PCR (PCR de Grande Escala) e Purificação

  1. Adicionar os tampões à reacção de acordo com a Tabela 9 para amplificação por PCR para PCR a grande escala.
  2. Configure as condições de ciclagem de PCR deTabela 10 .
  3. Adicionar 5 μL de corante de carga de gel de DNA 6x aos 25 μL de reação de PCR e carregar em um poço de um gel de agarose a 3%. Carregue 1 kb mais escada de DNA em um poço separado. Realizar electroforese em gel a 100 V, durante 1,5 h.
  4. Visualize o gel completo usando um Transiluminador UV.
  5. Tamanho extrair uma fatia de gel contendo produtos de PCR a partir de 200-300 bases e transferir o gel para um tubo de microcentrífuga limpa de 2 ml.
  6. Adicionar 1 mL de tampão de solubilidade em gel, de um kit de extração de gel de DNA, à fatia de gel e incubar à temperatura ambiente por 30 min, ou até o gel se dissolver, com agitação constante.
  7. Adicionar 200 μL de isopropanol ao gel dissolvido e misturar bem por pipetagem. Transferir 700 μL da amostra para uma coluna de limpeza de extracção de ADN gel e centrifugar a 13.000 xg durante 30 s. Manter a transferência da amostra dissolvida para a coluna até que toda a amostra tenha sido carregada na coluna.
  8. Adicionar 500 μL de tampão de solubilidade em gel,Seguido de 700 μL de tampão de lavagem em coluna, para a coluna, de acordo com o protocolo do fabricante. Adicionar 12 μL de água isenta de nuclease ao centro da coluna para eludir o ADN. Ponto de Pausa: O DNA pode ser armazenado a -20 ° C.
  9. Quantificar a concentração do DNA usando quantificação fluorométrica. Se múltiplas bibliotecas são construídas e reunidas em conjunto para seqüenciamento, adicione quantidade igual de cada amostra para o pool, para seqüenciamento de alto rendimento.

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Resultados

A Figura 1 ilustra o esquema do fluxo de trabalho SPLASH. Após a adição de psoraleno biotinilado na presença de 0,01% de digitonina e reticulação UV, o ARN total é extraído das células e é efectuada uma transferência de pontos para assegurar que a reticulação do biotinilado com o ARN tenha ocorrido eficientemente ( Figura 2 ). Utilizamos oligos biotinilados de 20 bases como controlos positivos para titular a quantidade de psoral...

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Discussão

Aqui, descrevemos em detalhes o fluxo de trabalho experimental e computacional para SPLASH, um método que nos permite identificar par-sábio RNA interações em um genoma-wide maneira. Utilizamos com sucesso SPLASH em bactérias, leveduras e culturas humanas e antecipamos que a estratégia pode ser amplamente aplicada a diversos organismos em diferentes estados celulares. Uma das etapas críticas no protocolo é começar com pelo menos 20 μg de RNA reticulado para ter material adequado para processos a jusante. O ARN é então fr...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros do laboratório Wan e do laboratório Nagarajan por discussões informativas. N.Nagarajan é apoiado pelo financiamento de A * STAR. Y.Wan é apoiado pelo financiamento de A * STAR e Sociedade em Ciência-Branco Weiss Fellowship.

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Materiais


Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 kb Plus DNA LadderLife Technologies Holdings Pte Ltd10787026DNA ladder
10 bp DNA ladderLife Technologies Holdings Pte Ltd10821-015DNA ladder
20% SDS solutionPrimeira BASEBUF-2052-1L   
20x SSCFirst BASEBUF-3050-20X1L
3.0 M Solução de Acetato de SódioFirst BASEBUF-1151-1L-pH5.2   Necessário para precipitação de ácido nucleico
Solução de Acrilamida 40%, 19:1Bio-Rad1610145TBE Componente de gel de ureia
Kit de tampão AmbionLife Technologies Holdings Pte LtdAM9010
Persulfato de Amônio, Grau Molecular   PromegaV3131 TBE Componente do gel de ureia
RNAclorofórmioMerck1,02445.1000
Sigma-AldrichB0126-25GBromofenol
CL9025K doepicentro do Spin-X do diodo do ADN do ligador da fita do
Sigma-AldrichCLS8160-96EA
cristalinos D5628-1G DIGITONIN CRISTALINOSigma-AldrichD5628-1GPara tratamento celular
Dark Reader Transilluminator Clare Chemical ResearchDark Reader DR89X Transiluminador Transiluminadorluz azul
DNA Gel Loading Dye (6x)Life Technologies Holdings Pte LtdR0611Necessário para eletroporação de gel de agarose
Dulbecco's Modified Eagle MediumPan BioTechP04-03500Para cultura de células Hela
Grânulos magnéticos de estreptavidinaLife Technologies Holdings Pte Ltd65002Dynabeads MyOne Streptavidin C1 
Suporte magnético para 15  Tubos mLLife Technologies Holdings Pte Ltd12301DDynaMag-15
Suporte magnético para 15  Tubos mL LifeTechnologies Holdings Pte Ltd12321DDynaMag-2
ThermoMixerEppendorf5382 000.015Eppendorf ThermoMixer  C
Psoraleno biotiniladoLife Technologies Holdings Pte Ltd29986EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotina
F8T5/BL HitachiF8T5/BL Lâmpada UV de 365 nm
Fetal Bovine SerumLife Technologies Holdings Pte Ltd10270106   Componentes do meio Hela
FormamidaPromegaH5052   Componente no buffer de hibridização
G8T5Sankyo-DenkiG8T5Lâmpada UV de 254 nm
GlycogenLife Technologies Holdings Pte Ltd10814010Necessário para precipitação de ácido nucleico
NanodropLife Technologies Holdings Pte LtdNanodrop 2000Espectrofotômetro para quantificação de ácido nucleico
Água livre de nuclease Primeira BASEBUF-1180-500ml   
Estreptomicina Penicilina   Life Technologies Holdings Pte Ltd15140122   Componentes do meio Hela
Polimerase DNA de Alta Fidelidade (2x)Life Technologies Holdings Pte LtdF531L Master Mix de PCR de alta fidelidade Phusion com tampão HF (2x)
Conjunto de Primers 1New England BiolabsE7335L Primers de PCR
Kit de extração de gel de DNAQIAgen28106Kit de extração de gel QIAquick
Kit de quantificação fluorométricaLife Technologies Holdings Pte LtdQ32854Qubit dsDNA HS Kit
de limpeza de RNAQiagen74106RNeasy Mini Kit Coluna de membrana de sílica
Inibidor de RnaseLife Technologies Holdings Pte LtdAM2696SUPERase In
Transcriptase reversaLife Technologies Holdings Pte Ltd18080400SuperScript III Síntese de primeira vertente SuperMix
Gel de ácido nucleico StainLife Technologies Holdings Pte LtdS11494SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polinucleotídeo QuinaseNew England BiolabsM0201LEnzima de reparo final
T4 RNA Ligase 1New England BiolabsM0204LEnzima para ligação de proximidade
T4 RNA Ligase 2, truncado KQNew England BiolabsM0373LEnzima para ligação do adaptador
TemedBio-Rad1610801TBE Componente de gel de ureia
Tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmioLife Technologies Holdings Pte Ltd15596018TRIzol® Reagente para extração de RNA
UreiaPrimeira BASEBIO-2070-5kg   
Reticulador UVStratagene400072UV Stratalinker 1800
Transiluminador UVUVP95-0417-01Para visualização de bandas
Xileno Cyanol FFSigma-AldrichX4126-10G
Limpeza de DNAZymo Research D4004Zymo DNA concentrator-5 
Lista de softwares necessários
software FastQC0.11.4http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
software SeqPrep1.0.7https://github.com/jstjohn/SeqPrep
software BWA0.7.12http://bio-bwa.sourceforge.net/
software SAMTOOLS1.2.1http://www.htslib.org/
PULLSEQ software1.0.2https://github.com/bcthomas/pullseq
software STAR2.5.0chttps://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py script PYTHONPYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py script PYTHON2.7.11
pickJunctionReads.awk AWK scriptAWK GNU 4.1.2https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Composição do tampão<
strong>Tampão de eluição
0,3 M acetato
< strong>Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Sempre adicione Superase-in fresco antes de usar, exceto ao lavar contas
Proteinase K Buffer 
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7,0
1 mM EDTA
0,5% SDS
Tampão de hibridização
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamida (armazenar no escuro a 4 &graus; C)
Sempre adicione Superase-in fresco antes de usar
2x Tampão de lavagem SSC
2x NaCl e citrato de sódio (SSC) (diluído do estoque SSC Invitrogen 20x)
0,5% SDS
2x tampão de fragmentação de RNA
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8,3
2x Carga de RNA Corante
95% Formamida
0,02% SDS
0,02% azul
0,01% de xileno cianol
1 mM EDTA
RT sequência de primer:
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG
Extração azul do do de do azul de Epicentro Filtros de https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src de sódio de bromofenol<td colspan="4">3' Sequência do adaptador de RNA: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC

Referências

  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
  2. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
  3. Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
  4. Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
  5. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
  6. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
  7. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
  8. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  9. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  10. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  11. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  12. Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
  13. Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
  14. Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
  15. Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).

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