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Artigo de método

Propagação em pequena escala de iPSCs humano em condições sem soro para a caracterização imunocitoquímica de rotina

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DOI:

10.3791/55260

⸱

18 de fevereiro de 2017

 , 
1Department of Neurology, The University of Arizona

Neste artigo

Resumo

A caracterização regular de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), para verificar a manutenção de seu estado pluripotente, é um passo importante antes que essas células sejam usadas para outras aplicações. Aqui descrevemos um método para a propagação em pequena escala de iPSCs humanas especificamente projetado para permitir sua caracterização fácil e rotineira via imunocitoquímica.

Resumo

Há um grande interesse na utilização de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) para modelagem de doenças e terapêutica celular devido à especificidade do paciente e à estaminalidade característica. No entanto, a pluripotência das iPSCs, que é essencial para sua funcionalidade, deve ser confirmada antes que essas células possam ser usadas em tais aplicações. Embora uma caracterização rigorosa das iPSCs, por meio de diferentes ensaios celulares e funcionais, seja necessária para estabelecer sua pluripotência, a avaliação rotineira da manutenção da pluripotência pode ser alcançada de forma mais simples e eficaz por meio de técnicas imunocitoquímicas. Aqui, apresentamos um protocolo sistemático para a cultura de hiPSCs, de forma reduzida, para facilitar particularmente a verificação de seu estado pluripotente usando imunocitoquímica. Mais especificamente, essa metodologia abrange um meio eficiente e econômico de cultivar iPSCs em condições livres de soro e plaqueá-las em pequenas lâminas de câmara ou lamínulas de vidro ideais para imunocitoquímica.

Introdução

Reprogramação de células somáticas adultas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) fornece uma maneira de obter uma fonte potencialmente ilimitada de células específicas do paciente para estudar a doença 1, 2. Recapitulando um fenótipo da doença in vitro, que tornam plausível para examinar os mecanismos celulares e moleculares associadas com a doença, e melhorar a descoberta da droga e da medicina personalizada 3. Além disso, iPSCs humanos (hiPSCs) oferecem a possibilidade de derivar tipos de células específicas que podem ser usadas como um recurso único para substituir as células mortas ou disfuncionais e restaurar a função no contexto de várias desordens 4, 5.

Um pré-requisito importante para usando iPSCs nas aplicações acima é garantir que a sua pluripotentes e indiferenciado estado é mantido durante a expansão em cultura. Tipicamente, techniqUEs, tais como citometria de fluxo, Western blotting, reacção em cadeia com polimerase e os ensaios funcionais, que requerem grandes quantidades de células e equipamento especializado, são utilizados para a análise detalhada de iPSC pluripotência 6, 7, 8, 9, 10. No entanto, a avaliação de rotina do estado indiferenciado das iPSCs pode efetivamente ser alcançado através da propagação limitada destas células especificamente para imunocitoquímica (ICC), envolvendo, assim, tempo e recursos reduzidos.

Recentes avanços permitir o crescimento de iPSCs em condições isentas de soro definidas, o que é uma melhoria significativa em relação aos sistemas de cultura convencionais que requerem camadas alimentadoras de fibroblastos murinos e meio de soro contendo. No entanto, a literatura atual não inclui protocolos passo a passo claras que descrevem como fazer a transição iPSCs de alimentadorcamada para sistemas sem alimentação.

Neste contexto, o presente protocolo sistematicamente detalha como hiPSCs cultivadas em ratinho irradiado fibroblasto embrionário (IMEF) camadas alimentadoras podem ser (1) adaptado para propagar em meio isento de soro, e (2) em cultura em pequena escala para apoiar especificamente robusta análise imunocitoquímica. No geral, esta metodologia representa um procedimento oportuna e rentável para a propagação iPSCs humanos em condições isentas de soro para confirmar a sua pluripotência em uma base de rotina usando imunocitoquímica.

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Protocolo

hiPSCs foram obtidos a partir de fibroblastos dérmicos humanos isolados a partir de 4 mm biópsias de pele e reprogramadas em casa através de Sendai reprogramação mediada por vírus 11. A Universidade do Arizona Institutional Review Board aprovou todos os procedimentos para o recrutamento assunto e coleta de biópsia.

1. Preparação de Matriz Extracelular superfície revestida para cultura iPSC

  1. Um dia antes da confluência de culturas hiPSC que crescem em iMEFs, preparar placas revestidas matriz extracelular (Matrigel).
  2. degelo lento uma alíquota da matriz extracelular (muito dependentes, siga as instruções sobre a folha de especificações) em gelo em 4 ° C durante 2 h.
  3. Num capuz segurança biológica, utilizando pontas de pipeta frio (armazenada a -20 ° C), adicione uma aliquota de matriz extracelular para Modified Eagle Médium / Nutrient mistura fria da Dulbecco F-12 (DMEM / F12 / HEPES) de acordo com o factor de diluição do lote específico .
  4. Dispense ~ 60081; L de matriz extracelular por poço de cada nova cultura de células tratadas com placa de 12 poços necessários.
  5. Incubar a placa a temperatura ambiente durante várias horas. Aqui, utilizar um tempo de incubação de 3 h.
    NOTA: As placas podem ser utilizadas imediatamente ou armazenadas a 4 ° C durante até duas semanas.

2. Transferência de hiPSCs crescido em células alimentadoras IMEF na Matriz Extracelular para Propagação

  1. No dia da Passaging, remover a placa revestida com matriz de 4 ° C e deixar que a placa se adapte à temperatura ambiente durante 1 h na capa de cultura de tecido.
  2. Aspirar o meio a partir de um poço de uma placa de 6 poços de cultura hiPSC crescente em iMEFs e substituir com 500 ul de reagente de dissociação com colagenase (1 mg / mL em meio de cultura basal).
  3. Incubar a 37 ° C durante ~ 10 - 30 minutos até as bordas das colónias IPSC parecem levantar ligeiramente.
    NOTA: O tempo de incubação é a linha dependente e irá variar. Monitorar dissociação sob um microscópio.
  4. Carroefully aspirar o reagente de dissociação e lavar cuidadosamente 2 vezes com salino tamponado com fosfato (PBS, pH 7,4).
  5. Adicionar 1 mL de temperatura ambiente mTeSR1 meio completo com 10 ng / mL de Rho-associado inibidor de proteína quinase (Y-27632 inibidor ROCHA) para o poço.
    NOTA: utilizando uma mistura 50:50 de meio condicionado e IMEF mTeSR1 durante esta passagem inicial é sugerida e pode ser benéfico para a sobrevivência dos hiPSCs durante esta transição meios.
  6. Usando um pequeno microscópio de contraste de fase colocado parcialmente no interior do exaustor, marcar manualmente e escolher 1 - 2 colónias hiPSC (~ 700 - 1000 um de diâmetro) utilizando uma seringa e uma agulha (25 g, em 1 ½). Empurrar as peças marcados da colônia no meio com uma ponta de pipeta P200.
  7. Aspirar e eliminar a matriz da nova placa, tomando cuidado para não perturbar o revestimento.
  8. Transferir 1 ml da suspensão de células a partir da velha cavidades contendo as iPSCs marcados para a nova matriz bem revestido.
  9. Place a placa na incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2. Balançar a placa em vários, vai-e-vem rápido, e lado-a-lado movimentos para espalhar uniformemente as células. Não perturbe a placa durante 24 h.
  10. Realizar mudanças de mídia diários completos com mTeSR1 meio completo (adição de Y-27632 ROCHA inibidor não é necessário após o plaqueamento inicial no passo 2.5).

Passaging 3. pequena escala de hiPSCs em placas revestidas de Matrix

NOTA: De um modo geral, após a transferência inicial dos hiPSCs à matriz placas revestidas, as células devem ser passadas mais uma vez de um modo semelhante para assegurar que todos iMEFs ter sido eliminado e as células foram adaptadas para Alimentador livre condições.

  1. Um dia antes da iPSC confluência preparar as placas de matriz recém-revestida como discutido na seção 1.
  2. No dia da passagem, remover a placa revestida com matriz de 4 ° C de incubação e permitir que a placa se adapte à temperatura ambiente durante 1 h no tecido culhood ture.
  3. Aspirar o meio a partir de um poço de uma placa de 6 poços de hiPSCs (inicialmente transferida a partir do alimentador de matriz) e substituir com 500 ul de tampão de dissociação de células.
    NOTA: O tampão de dissociação celular comercial usado aqui (ver Tabela Materiais) é mais adequada para utilização com o meio mTeSR1 comparação com colagenase.
  4. Incubar à temperatura ambiente durante 3-7 min, até que os bordos das colónias IPSC parecem levantar ligeiramente. Como mencionado anteriormente, o tempo de incubação é de linha dependente e variável. Por isso, monitorizar a dissociação celular sob um microscópio para determinar o tempo óptimo.
  5. Aspirar cuidadosamente o tampão de dissociação e lavar suavemente 2 vezes com PBS.
  6. Adicionar 500 mL de temperatura ambiente mTeSR1 meio completo com 10 ng / mL Y-27632 inibidor ROCHA para o bem.
  7. Em vez de colônias de pontuação como no Passo 2.6, pressione o número desejado de colônias na mídia usando uma ponta P200 e gentilmente triturar a suspensão de células 2 vezes against um canto do poço para quebrar as colónias hiPSC em aglomerados de ~ 50-200 uM de tamanho. Por exemplo, para uma placa de 12 poços, escolher 1 - 2 colónias de transferir para cada um novo poço. Transferir a suspensão de células a partir do antigo bem em um único poço de uma nova placa de 12 poços.
  8. Balance a placa em vários rápida, para trás e para a frente, e os movimentos de lado-a-lado para espalhar uniformemente as células, e deixar o resto da placa durante 24 h num banho a 37 ° C, 5% de CO2.
  9. Realizar mudanças de mídia diários completos com mTeSR1 meio completo. Como mencionado anteriormente, não é necessário adicionar Y-27632 ROCHA inibidor após o revestimento inicial.
    NOTA: não utilizadas colónias IPSC do Passo 3.7 pode ser facilmente criopreservados neste momento.

4. Preparação de Câmara Slides e Lamelas para a semeadura de hiPSCs para Imunocitoqu�ica

NOTA: O protocolo seguinte utiliza 4-bem lâminas de câmara de plástico e 12 lamelas mm de vidro com appropriate volumes de mídia nas multi-poços para apoiar imunocitoquímica rentável. No entanto, volumes de suporte pode ser aumentada, se for desejada a utilização de tamanhos maiores e bem lamela.

  1. Um dia antes da hiPSC confluência, preparar lâminas de câmara recém-revestidos com matriz extracelular como discutido na seção 1. Adicione solução de matriz suficiente (~ 300 - 500 L por cavidade de uma lâmina de câmara de 4 poços) para totalmente coat cada poço, sem qualquer preocupação de evaporação. Alternativamente, após a colocação de uma lamela limpa e esterilizada em cada poço de uma placa de 24 poços, 500 ul revestimento com matriz extracelular e garantir que a lamela não está a flutuar no topo da solução.
  2. No dia da passagem, remover as lâminas com câmara revestidos / lamelas de 4 ° C e permitir a aclimatação à temperatura ambiente durante 1 h no capuz de cultura de tecidos.
  3. Aspirar o meio a partir de um poço de uma placa de 12 poços de hiPSCs e substituir com 500 ul de tampão de dissociação.
  4. Incubar a tempe quartoratura durante ~ 3-7 min, até que os bordos das colónias IPSC parecem levantar ligeiramente.
  5. Aspirar cuidadosamente o tampão de dissociação e adicionar 1 mL de temperatura ambiente mTeSR1 meio completo com 10 ng / mL Y-27632 ROCHA inibidor para o bem.
  6. Usando um microscópio de contraste de pequena fase colocado dentro da capa de cultura de tecido, escolher manualmente uma colónia / novo poço de uma lâmina de câmara de 4 poços ou de uma nova lamela a ser revestida (~ 1.000 - 1.500 m de diâmetro) utilizando uma ponta P200 pipeta, empurrando -lo para fora da superfície da placa para o meio.
  7. Aspirar a matriz no novo slide câmara / lamela, tomando cuidado para não perturbar o revestimento.
  8. Com cuidado, tritura-se a suspensão de células 2 vezes contra um canto do poço para quebrar as colónias hiPSC em aglomerados de ~ 50-200 uM de tamanho. Transferir 250 uL da suspensão de células a partir do antigo bem em cada poço de uma nova 4-corrediça bem câmara / lamela.
  9. Traga o volume de cada novo poço até 500 mL com mTeSR1 containing 10 ng / mL de Y-27632 Inibidor ROCHA.
  10. Coloque a câmara de deslizamento / lamelas na incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2.
  11. Após 24 h, realizar alterações na mídia diários completos com mTeSR1 meio completo. Mais uma vez, como mencionado anteriormente, a adição de Y-27632 Inibidor ROCHA não é necessário, depois de o plaqueamento inicial.

5. Preparação de iPSCs para Imunocitoqu�ica

  1. Uma vez confluentes, preservar as colônias hiPSC através de fixação, removendo a mídia dos poços e adicionar pré-aquecido CUIDADO paraformaldeído a 4% (~ 300 mL / poço de uma 4-bem slides câmara / lamela). Incubar à temperatura ambiente durante 20 min.
  2. Descartar o paraformaldeído apropriadamente de acordo com risco biológico institucional e as diretrizes de segurança de produtos químicos.
  3. Lave as células 3 vezes durante 5 minutos cada, num agitador de bancada com PBS.
    NOTA: As células sobre lâminas de câmara / lamelas pode ser armazenado com um amplo PBS a 4 ° C indefinidamente nesta fase.Alternativamente, eles podem ser imediatamente utilizados para ICC.

6. A imunocoloração de hiPSCs com pluripotência Markers

NOTA: hiPSCs imunocoloração com anticorpos pluripotência padrão. Como exemplo, aqui estão as células duas vezes coradas com anticorpos alvo uma superfície e 1 1 antígeno intracelular de uma forma sequencial da seguinte forma: Anti-Stage-Specific Antigen Embryonic-4 (SSEA4) com proteína 4 (OCT- anti-oct�ero de ligação 4) e anti-Tra-1-60 com anti-SRY relacionados HMG BOX gene 2 (SOX2) (consulte a tabela Materiais para obter detalhes de anticorpos).

  1. Aspirar o PBS dos poços e adicionar 500 uL / ​​poço da solução de bloqueio, sem Triton-X-100. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
  2. Prepara-se uma concentração pré-determinada (aqui, usar 1: 200) de anticorpos de superfície, quer SSEA4 ou Tra-1-60, diluindo-se em Solução de Bloqueio, sem Triton X-100.
    1. Para lâminas com câmara, preparar a 300 uL / ​​poço de uma lâmina de câmara de 4 poçospor mistura de 298,5 mL de solução de bloqueio de cima e 1,5 mL de anti-anticorpo primário ou SSEA4 Tra-1-60.
    2. Para lamelas, preparar 40 mL / lamela misturando 199 mL de Solução de Bloqueio e 1 mL de anti-SSEA4 ou anticorpo primário Tra-1-60.
  3. Aspirar a solução de bloqueio a partir do slide câmara e dispensar o anticorpo primário nas cavidades apropriadas. Para lamelas, colocar uma folha de parafilme firmemente dentro de um prato Petri e dispensar 40 ul do anticorpo primário na parte superior como uma gotícula. Usando uma agulha de seringa dobrada e uma pinça, levantar cuidadosamente a lamela para fora do poço de cultura e coloque-o lado das células para baixo para a gota de anticorpo no parafilme. Incubar durante a noite a 4 ° C.
  4. Na manhã seguinte, lavar as células 3 vezes, 5 - 10 min cada, por remoção do anticorpo a partir da câmara de corrediça e adicionando em PBS. Para lamelas, levantar cada um fora do parafilme e colocá-lo de volta em um poço de uma placa de 24 poços, com o lado célula para cima. Adicione cuidadosamente PBS.
  5. Preparar anticorpos secundários adequados a 1: 500 em solução de bloqueio.
    1. Para lâminas com câmara, preparar a 300 uL / ​​poço de uma lâmina de câmara de quatro poços por mistura de 499 ul de solução de bloqueio e 1 ul de anticorpo de cabra anti-rato IgG 3 Alexa Fluor 488 (por SSEA4) ou 1 ul de anticorpo de cabra anti-IgM de ratinho Alexa Fluor 488 (para Tra-1-60).
    2. Para lamelas, preparar 40 mL / lamela por mistura de 499 ul de solução de bloqueio e 1 ul de anticorpo de cabra anti-rato Alexa Fluor 488 IgG3 (por SSEA4) ou 1 ul de anticorpo de cabra anti-IgM de ratinho Alexa Fluor 488 (por Tra-1-60 ).
  6. Aspirar o PBS a partir do slide câmara e dispensar o anticorpo secundário em poços apropriados. Para lamelas, a seguir ao Passo 6.2, inverter as lamelas na solução de anticorpo colocado em parafilme à temperatura ambiente durante 2 h.
    NOTA: Se fluorescente utilizando anticorpos secundários etiquetados, as células devem ser protegidas da luz. Colocar as lâminas de câmara e as lamelas em um env escuroironment durante incubações e lavagens.
  7. Lavam-se as células 3 vezes durante 5 - 10 minutos a cada por remoção do anticorpo a partir da câmara de corrediça e adicionando em PBS. Para lamelas, levante cuidadosamente cada uma delas a partir do parafilme e colocar de volta em um poço de uma placa de 24 poços, com o lado célula para cima. Delicadamente adicionar PBS durante a lavagem.
  8. Antes de sondagem para o segundo antigénio, Oct-4 intracelular ou SOX2, neste caso, novamente incubar em Solução de Bloqueio feita com o reagente de permeabilização (Triton-X-100) durante 1 h à temperatura ambiente.
  9. Para imunocoloração para OCT-4 ou SOX2, basta seguir a metodologia descrita nos Passos 6.1-6.6 para a aplicação dos anticorpos primário e secundário. Para os efeitos do presente protocolo, utilizar OCT-4 e SOX2 a uma concentração de 1: 200 e o anticorpo de cabra anti-coelho secundário IgG Alexa Fluor 594 a 1: 500.
  10. Após os tratamentos acima referidos anticorpos primários e secundários, lavar as células 3 vezes para 5 - 10 min cada com PBS e contracoloração com 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole, dicloridrato (DAPI), seguindo protocolos padrão se a visualização nuclear é desejada.

7. Preparação para visualização

  1. Para lâminas de câmara, retire cuidadosamente a câmara superior do slide, seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, lavar em água destilada, e adicionar meio de uma lamela de montagem e para permitir microscopia.
  2. Para lamelas, inverter as lamelas para uma gota de meio de montagem colocada numa lâmina de vidro de microscópio.
  3. Imagem sob um microscópio de fluorescência padrão ou confocal.

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Resultados

Este protocolo fornece uma descrição passo a passo de como iPSCs humano pode ser transferido de camada alimentadora para Alimentador livre condições e, posteriormente propagada de forma limitada para permitir especificamente imunocitoquímica de custo eficaz para confirmar a manutenção da pluripotência. A Figura 1 mostra uma representação esquemática deste protocolo. A Figura 2A mostra que crescem em colónias hiPSC iMEFs em placas de 6 poços. Estas colóni...

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Discussão

O protocolo sistemática aqui apresentado oferece uma economia de tempo e método de custo-benefício, na forma de uma técnica de cultura em escala reduzida, projetado especificamente para apoiar a análise pluripotência eficaz através de imunocitoquímica.

As principais vantagens do método descrito são as seguintes. Tradicionalmente, mais de 3 a 4 passagens são necessários para a transição iPSCs de camadas alimentadoras para Alimentador livre condições de cultura, a fim de eliminar iMEFs residua...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Fontes de financiamento: Universidade do Arizona, Fundação Jim Himelic e Centro de Biologia de Doenças Complexas do Arizona.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEM-F12 / HEPESLife Technologies11330032
Knockout Serum ReplacementLife Technologies10828028
L-GlutaminaLife Technologies25030081
MEM-NEAALife Technologies11140050
2-mercaptoetanolLife Technologies21985023
Ciências celulares humanas recombinantes FGF-BasicCRF001B
Y-27632 inibidorR & D1254
Collagenase Tipo IVLife Technologies17104019
Matriz qualificada para hESC Corning354277
mTeSR1 Basal MediumStemCell Technologies05850
mTeSR1 5x SuplementoStemCell Technologies05850
Gentle Cell Dissociation BufferStemCell Technologies07174
0,1 M PO4 Tampãointernon/a
Paraformaldeído, prillCiências de Microscopia Eletrônica19202
1x Solução salina tamponada com fosfaton/an/a
Soro de cabra normalLife Technologies16210072
Albumina de soro bovinoSigma-AldrichA2153
Triton-X-100Sigma-AldrichX100
Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb,
Sox2 (D6D9) Rabbit mAb,
SSEA4 (MC813) Mouse mAb,
TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Sinalização celular mAb de camundongo
Sinalização celular
Sinalização celular
Sinalização celular		2840
3579
4755
4746		Alternativamente, uma combinação de 6 anticorpos primários de pluripotência pode ser adquirida em conjunto como um kit no Catálogo #9656
Cabra anti-Ms IgM Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21042
Cabra anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21151
Cabra anti-Rb IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11037
Placas de Cultura de Células MultipoçosFisher Scientific 0720080/0720081Disponível em tamanhos de 6, 12, 24, 48, 96 poços
Corrediças de CâmaraFisher Scientific 12 565 21Disponível em Vidro ou Plástico Permanox em tamanhos de poço de 1, 2, 4, 8, 16
Tampa de vidro para crescimentoFisher Scientific 12 545 82Disponível nos tamanhos de 12, 15, 18, 22 e 25 mm

Referências

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  2. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  3. Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
  4. Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
  5. Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
  6. Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118(2009).
  7. Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
  8. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
  9. Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
  10. Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
  11. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
  12. Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
  13. Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).

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