A Câmara customizáveis ​​para a migração celular de medição

Resumo

Este protocolo detalha um método personalizada para medir a migração celular em resposta a quimioatractores, que também podem ser utilizados para determinar a taxa de difusão de um fármaco a partir de uma matriz de polímero.

Resumo

A migração celular é uma parte vital da resposta imune, crescimento e cicatrização de feridas. A migração celular é um processo complexo que envolve interacções entre células, a matriz extracelular e factores químicos solúveis e não solúveis (por exemplo, quimioatractores). Métodos padrão para medir a migração de células, tais como o ensaio de câmara de Boyden, trabalho por contagem de células em ambos os lados de uma divisória. Estas técnicas são fáceis de utilizar; no entanto, eles oferecem pouca modificação geométrica para diferentes aplicações. Em contraste, os dispositivos microfluidicos podem ser utilizados para observar a migração de células com gradientes de concentração personalização de factores solúveis ^{1, 2.} No entanto, os métodos para fazer os ensaios com base microfluidos pode ser difícil de aprender.

Aqui, nós descrevemos um método fácil para criar câmaras de cultura de células para medir a migração celular em resposta a gradientes de concentração química. Nossos mi celularesmétodo câmara gração pode criar diferentes gradientes de concentração linear de modo a estudar a migração de células para uma variedade de aplicações. Este método é relativamente fácil de usar e é normalmente realizada por alunos de graduação.

A câmara de microcanais foi criado por colocação de uma inserção de acrílico na forma da câmara de microcanais finais bem em uma placa de Petri. Depois disso, o poli (dimetilsiloxano) (PDMS) foi deitada no topo da inserção. O PDMS foi deixada endurecer e, em seguida, a inserção foi removida. Isto permitiu a criação de cavidades em qualquer forma ou tamanho desejado. As células podem ser posteriormente adicionado à câmara de microcanais, e agentes solúveis podem ser adicionados a um dos poços por imersão de um bloco de agarose, o agente desejado. O bloco de agarose é adicionado a um dos poços, e as imagens de lapso de tempo pode ser feita da câmara de microcanal, a fim de quantificar a migração celular. Variações deste método pode ser feita para uma dada aplicação, tornando este método highly personalizável.

Introdução

Para que processos vitais, como cicatrização de feridas, respostas imunes e desenvolvimento embrionário, ocorram, a migração celular. A migração celular envolve a interação entre as células e as células vizinhas, a matriz extracelular e pistas químicas solúveis (atrativos ou repelentes). Por exemplo, no processo de cicatrização de feridas, os fibroblastos desempenham um papel fundamental na fibrogênese e na contração da ferida, onde as células são recrutadas para o local da lesão para sintetizar colágeno a fim de formar a matriz extracelular³. Numerosos mecanismos por trás da migração de fibroblastos para o local da ferida foram estudados e inc....

Protocolo

1. Produzir uma Câmara MicroChannel criar um gradiente de concentração

1. Cortando uma peça de molde de acrílico
   1. Obter um pedaço de acrílico com a largura desejada. Normalmente, utilizam 1 placas de acrílico /-16 polegadas de espessura. folhas mais espessas são difíceis de cortar bem e muito finas folhas não têm a resistência mecânica, causando-lhes a quebrar ou deformar durante o processo.
   2. Criar um ficheiro CAD com a forma desejada da peça de acrílico para produzir uma cavidade no interior do polidimetilsiloxano (PDMS). Ajustar a largura do canal e comprimento para atingir o desejado gradiente relevantes para protocolos ex....

Resultados

A Figura 2 mostra o movimento da parte dianteira da célula através do canal em resposta a um gradiente de soro fetal de bovino colocado na extremidade oposta do canal, de onde as células são plaqueadas. A parte dianteira da célula é mostrada em 48 h (Figura 2A), 72 h (Figura 2B), 96 h (Figura 2C), e 120 h (Figura 2D) pós chapeamento. O movimento da frente de celular foi rastreado com estas imagens de lap.......

Discussão

A nossa câmara de microcanal pode ser utilizado para uma variedade de fins, incluindo a determinação da taxa de migração celular em resposta a factores de crescimento e quimioatractores e medindo a taxa de difusão de um fármaco a partir de uma matriz de polímero. É possível utilizar a câmara de microcanais para crescer as células e colocar um quimioatractor numa extremidade da câmara. As células crescem em resposta ao quimioatraente, e a migração de células pode ser quantificada tomando imagens de lapso de tempo que pod.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Elastômero de Silicone Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761036	poli(dimetilsiloxano) kit de 2 partes incluindo base de elastômero de silicone e agente de cura de elastômero de silicone
Folhas de Acrílico	US Plastic	44200
Placas de Petri Descartáveis	Falcão	25373-041
isotiocianato de fluoresceína– dextrano	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
Agarose, Tipo I, Baixo EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Fisher	Scientific	11965092	Componentes de mídia celular
Fetal Bovine Serium	Fisher Scientific	16000036	Componentes de mídia celular
Penicilina-estreptomicina	Fisher Scientific	15140148	Componentes de mídia celular
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP24384
EVOS XL Cell Imaging System	Thermo Fisher Scientific	AME3300	Instrumento usado para tirar imagens de lapso de tempo
Versa Laser	Universal Laser Systems, Inc.	Número do modelo VLS2.30	Cortador a laser usado para cortar plástico