A Câmara customizáveis ​​para a migração celular de medição

Summary

Este protocolo detalha um método personalizada para medir a migração celular em resposta a quimioatractores, que também podem ser utilizados para determinar a taxa de difusão de um fármaco a partir de uma matriz de polímero.

Abstract

A migração celular é uma parte vital da resposta imune, crescimento e cicatrização de feridas. A migração celular é um processo complexo que envolve interacções entre células, a matriz extracelular e factores químicos solúveis e não solúveis (por exemplo, quimioatractores). Métodos padrão para medir a migração de células, tais como o ensaio de câmara de Boyden, trabalho por contagem de células em ambos os lados de uma divisória. Estas técnicas são fáceis de utilizar; no entanto, eles oferecem pouca modificação geométrica para diferentes aplicações. Em contraste, os dispositivos microfluidicos podem ser utilizados para observar a migração de células com gradientes de concentração personalização de factores solúveis ^{1, 2.} No entanto, os métodos para fazer os ensaios com base microfluidos pode ser difícil de aprender.

Aqui, nós descrevemos um método fácil para criar câmaras de cultura de células para medir a migração celular em resposta a gradientes de concentração química. Nossos mi celularesmétodo câmara gração pode criar diferentes gradientes de concentração linear de modo a estudar a migração de células para uma variedade de aplicações. Este método é relativamente fácil de usar e é normalmente realizada por alunos de graduação.

A câmara de microcanais foi criado por colocação de uma inserção de acrílico na forma da câmara de microcanais finais bem em uma placa de Petri. Depois disso, o poli (dimetilsiloxano) (PDMS) foi deitada no topo da inserção. O PDMS foi deixada endurecer e, em seguida, a inserção foi removida. Isto permitiu a criação de cavidades em qualquer forma ou tamanho desejado. As células podem ser posteriormente adicionado à câmara de microcanais, e agentes solúveis podem ser adicionados a um dos poços por imersão de um bloco de agarose, o agente desejado. O bloco de agarose é adicionado a um dos poços, e as imagens de lapso de tempo pode ser feita da câmara de microcanal, a fim de quantificar a migração celular. Variações deste método pode ser feita para uma dada aplicação, tornando este método highly personalizável.

Introduction

Para que processos vitais, como cicatrização de feridas, respostas imunes e desenvolvimento embrionário, ocorram, a migração celular. A migração celular envolve a interação entre as células e as células vizinhas, a matriz extracelular e pistas químicas solúveis (atrativos ou repelentes). Por exemplo, no processo de cicatrização de feridas, os fibroblastos desempenham um papel fundamental na fibrogênese e na contração da ferida, onde as células são recrutadas para o local da lesão para sintetizar colágeno a fim de formar a matriz extracelular³. Numerosos mecanismos por trás da migração de fibroblastos para o local da ferida foram estudados e incluem diferentes fatores mecânicos, físicos, elétricos e quimiotáticos⁴. Os fibroblastos respondem especialmente bem a diferentes gradientes de concentração de fatores de crescimento. Esses diferentes fatores de crescimento trabalham juntos para otimizar a regeneração tecidual⁵. Ao observar a resposta quimiotática dos fibroblastos às concentrações de fatores de crescimento, pode-se estudar o padrão de migração direcional dos fibroblastos e como eles se orientam em torno de obstáculos físicos para chegar ao seu destino. Portanto, os objetivos deste estudo foram, em primeiro lugar, desenvolver um sistema no qual o crescimento de fibroblastos pudesse ser rastreado sob orientação por barreiras físicas e, em segundo lugar, modelar o crescimento de fibroblastos à medida que navegam pelo sistema.

Atualmente, o ensaio de câmara de Boyden é o sistema mais utilizado para medir a migração de células⁶. A câmara de Boyden consiste em uma placa de vários poços de duas câmaras, onde cada poço pode conter meio com ou sem quimioatraentes⁷. Uma membrana filtrante fornece uma interface porosa entre as duas câmaras em cada poço; Isso cria uma barreira para que as células não possam passar, a menos que seja por migração ativa. Normalmente, para a câmara de Boyden, um quimioatraente é adicionado à câmara inferior e o sistema pode se equilibrar para formar um gradiente entre os poços superior e inferior⁴. Um problema com o ensaio da câmara de Boyden é que gradientes íngremes acabam se formando ao longo de um único eixo perpendicular à superfície da membrana. Isso faz com que a diferença na concentração de quimioatraente entre os poços superior e inferior seja menor do que o esperado originalmente. Devido a essa restrição, o ensaio da câmara de Boyden dificulta a correlação de respostas celulares específicas com características específicas de gradiente, como a inclinação e a diferença de concentração. Sem essas medições, é difícil estudar a integração de sinais multigradientes.

Para abordar algumas das restrições do ensaio tradicional de câmara de Boyden, ensaios microfluídicos foram desenvolvidos para formar gradientes de concentração personalizáveis¹. Os métodos padrão para a criação de sistemas microfluídicos requerem salas limpas para técnicas litográficas. Essas técnicas podem ser difíceis de aprender, especialmente em um ambiente de sala de aula padrão. Assim, projetamos um sistema de câmara para medir a migração celular que pode ser feito sem o uso de uma sala limpa. Usando nosso sistema, os poços do ensaio podem ser ajustados para um tamanho preferido e um gradiente de concentração linear de inclinação personalizada pode ser produzido. Isso permite a medição precisa da quimiotaxia a partir de movimentos aleatórios. O design é um sistema barato e fácil de usar para modelar o crescimento celular em resposta a diferentes estímulos químicos.

Protocol

1. Produzir uma Câmara MicroChannel criar um gradiente de concentração

1. Cortando uma peça de molde de acrílico
   1. Obter um pedaço de acrílico com a largura desejada. Normalmente, utilizam 1 placas de acrílico /-16 polegadas de espessura. folhas mais espessas são difíceis de cortar bem e muito finas folhas não têm a resistência mecânica, causando-lhes a quebrar ou deformar durante o processo.
   2. Criar um ficheiro CAD com a forma desejada da peça de acrílico para produzir uma cavidade no interior do polidimetilsiloxano (PDMS). Ajustar a largura do canal e comprimento para atingir o desejado gradiente relevantes para protocolos experimentais individuais.
      1. Aqui, utilizar uma peça de acrílico com as seguintes dimensões: dois quadrados (0,254 cm x 0,254 centímetros) ligada por um canal de largura 0,127 cm (0,254 cm de comprimento) (Figura 1).
   3. Importar o arquivo CAD para dentro do aparelho de corte a laser e coloque a peça de acrílico em um cortador de laser de acordo com a manuo protocolo do cante.
      NOTA: Como alternativa, 3D-imprimir a peça a partir do desenho CAD. A vantagem deste método é que os materiais alternativos podem ser usadas para o molde; No entanto, a resolução e a reprodutibilidade pode ser diminuída com impressão em 3D em comparação com o corte a laser.

Figura 1: (CAD) Representação Computer-Aided Design de microcanais Câmara. Esta imagem descreve o desenho CAD da inserção acrílico necessário para criar a câmara de microcanais. 1 A) Vista de cima do desenho CAD, 1B) Vista lateral do desenho CAD com dimensões em polegadas, 1C) Vista superior de desenho CAD com dimensões em polegadas Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Verter o polidimetilsiloxano (PDMS)
   1. Em um barco de pesagem, misturar 10 partes em peso de base de elastómero comercial (por exemplo, Sylgard 184) com 1 parte em peso de um elastómero comercial Agente de cura (por exemplo, Sylgard 194). Tipicamente, misturar 10 g de Elastómero de base para 1 g de Elastómero Agente de cura.
   2. Agita-se para combinar a base e o agente de cura com uma micropipeta durante 5 min.
   3. Defina-se um sino de vácuo e coloque o barco pesar com PDMS no vácuo durante 30 min para remover as bolhas de ar aprisionadas.
   4. Desligue o vácuo e remover o barco pesa. Despeje o PDMS em cima do acrílico cut-out em uma pequena placa de Petri. Certifique-se de que os PDMS cobre completamente a inserção.
   5. Permitir que o PDMS a curar durante a noite (pelo menos 18 h) à temperatura ambiente.
3. Removendo a inserção de PDMS
   1. Após a cura do PDMS, remova a inserção cortando cuidadosamente as PDMS ao redor do pedaço de acrílico com um bisturi.

2. plaqueamento das células em uma Câmara MicroChannel

1. Esterilizar a câmara de células de plaqueamento.
   NOTA: Enquanto PDMS pode ser esterilizado usando óxido de etileno ou outras técnicas, um tratamento rápido de UV é rápido, barato, e suficiente para estudos de culturas celulares. A duração do tratamento UV curto não prejudicar a estrutura mecânica ou a integridade da peça de PDMS.
   1. Em um armário de cultura celular padrão, cobrir completamente a câmara com 70% de etanol.
   2. Coloque a placa de Petri na capela de fluxo laminar com as tampas fora.
   3. Feche a tampa e ligar a luz UV. Expor à luz UV durante 1-2 h.
   4. Abra a câmara de fluxo laminar e aguarde 15 minutos para restabelecer o fluxo.
   5. Remover o etanol a 70%.
   6. Lavam-se as câmaras duas vezes com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). Use 1 ml de PBS para cada lavagem. Remover PBS e permitir câmaras para secar durante a noite com as tampas fora.
      NOTA: Como alternativa, em vezda utilização de uma câmara de fluxo laminar, use uma caixa de câmara de UV para esterilização se estiver disponível. Adicione uma caixa de UV colocando uma fonte de luz UV na parte de trás de uma caixa de cartão revestida com folha de alumínio. A folha de alumínio reflecte a luz para permitir a iluminação uniforme da amostra.
2. Chapeamento de células em câmara
   1. Contagem de células utilizando azul tripano e um hemocitómetro.
      1. Adiciona-se 100 uL da suspensão de células de 400 uL de 0,4% de azul de Tripano e misturar suavemente. Adicionar 100 ul desta solução para o hemocitómetro preenchendo suavemente ambas as câmaras sob a lamela de vidro.
      2. Use um microscópio com uma objetiva de 10X para se concentrar na grelha no hemocitômetro. Use um contador de contagem mão para contar as células não coradas ao vivo dentro de um conjunto de 16 quadrados no hemocitômetro.
      3. Contagem de células em todas as 4 séries de 16 quadrados. Tome a contagem média de células a partir dos 4 conjuntos de 16 quadrados e multiplicar por 5x10 ^4. Este número final é o number de células / ml na suspensão de células.
   2. Adicionar 2500 células a uma cavidade em cada uma das câmaras. Isto traduz-se para uma densidade quase confluentes de células de ~ 30000 / cm ^2.
   3. Permitir que as células para se sentar na câmara durante 60 minutos antes de adicionar mídia (de Eagle Modificado por Dulbecco Médio, 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina).

3. Blocos de agarose Dextran Soaked

1. Criando um bloco de agarose
   1. Pour 3% de agarose em molde 3D impressa (2 mm x 2 mm x 2 mm).
   2. Permitir que a agarose solidificar em uma câmara de vácuo durante 30 min para remover quaisquer bolhas.
   3. Remover o bloco de agarose a partir do molde.
      NOTA: Como alternativa, derrame 3% de agarose em pequena placa de Petri com uma espessura de 2 mm. Corte um bloco de 2 mm x 2 mm x 2 mm, utilizando um bisturi ou outra ferramenta de corte. Este não é tão preciso como o sistema de molde mas pode ser um pouco mais fáceis de fazer.
2. completamente submerge o bloco de agarose numa solução com a concentração desejada do factor quimiotáctico. Para avaliar a formação de gradiente de concentração, lavar a câmara pela primeira vez com dextrano fluorescente. A concentração e peso molecular do dextrano deve coincidir com a de um factor solúvel ou droga de interesse.
3. Mergulhe a noite bloco de agarose.

4. Time-lapse of a difusão Dextran para avaliar o gradiente de concentração Solúvel Fator

1. Coloque o bloco de agarose dextrano embebido em um pequeno poço quadrado da câmara de microcanais.
2. Coloque a câmara de microcanais em um sistema de imagens de células ou utilizar outro microscópio de fluorescência com uma capacidade de lapso de tempo. Comece o lapso de tempo de acordo com as instruções do fabricante.
   Nota: Os resultados apresentados são tomadas com filtro GFP, 50% de luz, 4/10 pH, e uma ampliação de 4X.

5. Time-lapse do crescimento celular

1. células placa na câmara de microcanais em uma extremidade docâmara. Aqui, usar fibroblastos 3T3. Adicionar 2500 células a uma cavidade na câmara de microcanais. Contagem de células como descrito em 2.2.1.
   1. Permitir que as células para se sentar na câmara durante 60 minutos antes de adicionar mídia (de Eagle Modificado por Dulbecco Médio, 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina). Manter a câmara de microcanais com células plaqueadas a 37 ° C em 5% de CO _2. A migração celular através do canal pode ser vista com um microscópio.
   2. Adicionar um marcador ou utilização de um defeito microscópico na câmara como um marcador, a fim de servir como um ponto de partida para quantificar a distância que a célula move-se.
2. Estabelecer um gradiente por colocação de um gel de agarose (8 ^mm3 bloco) que contém o factor de crescimento concentrado, quimio-atractor, droga, ou outro factor a ser ensaiado (aqui, 40% de FBS está a ser utilizada como um exemplo), a uma extremidade do microcanal câmara.
3. Tome imagens de lapso de tempo de frente da célula em movimento. Aqui, os resultados mostram imagens da célula front que foram tomadas a cada 12 h, utilizando um sistema de imagem.
4. Use imagens de frente da célula para quantificar a taxa de crescimento celular. Calcula-se a taxa de crescimento utilizando primeiro a função polyfit MATLAB (roipoly) para criar uma máscara poligonal definido pela frente da célula, as paredes do canal, e o marcador de referência. As dimensões desta máscara se obter a distância de migração da frente a partir do qual a velocidade média frente célula é calculada. Outros estudos têm utilizado um método semelhante ^8.
   NOTA: Comparar a borda da frente de crescimento da célula em cada quadro para a concentração do factor solúvel naquela mesma distância. O gradiente de concentração factor solúvel é calculado utilizando um modelo de difusão 1D aproximação.
5. Tome imagens fluorescentes das células utilizando faloidina e DAPI coloração.
   1. Fix células antes da coloração com faloidina.
      1. Quente paraformaldeído a 4% a 37 ° C.
      2. Adicionar suficiente paraformaldeído a 4% para cobrir as células. Manter as células naparaformaldeído durante 10 min.
      3. Lavar duas vezes com PBS durante 15 min de cada vez. Use PBS suficiente para cobrir as células.
   2. Remover PBS a partir de células e adicionar solução de permeabilização suficiente (0,1% de Triton X-100 em PBS) para cobrir as células. Deixar solução durante 10 min.
   3. Lavar duas vezes com PBS durante 5 min de cada vez. Use PBS suficiente para cobrir as células.
   4. Remover PBS a partir de células e adicionar solução (1% de albumina de soro de bovino em PBS) de bloqueio durante 20 minutos.
   5. Remoção da solução de bloqueio e lavar 2 vezes com PBS durante 5 min de cada vez. Use PBS suficiente para cobrir as células.
   6. A partir deste ponto, a proteger as células da luz com folha de alumínio, quando não estiver sendo usado. Remover PBS a partir de células e adicionar 488 faloidina diluídas a 1:50 em PBS durante 1 h.
   7. Lavar 2 vezes em PBS durante 5 minutos para cada lavagem. Use PBS suficiente para cobrir as células. Em seguida, retire PBS a partir de células.
   8. Adicionar DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) diluído 1: 1000 em PBS às células durante 15 min.
   9. Remover DAPI elavar as células duas vezes com PBS durante 5 minutos para cada lavagem.
   10. Remover última lavagem e adicione o suficiente PBS para cobrir as células. As células podem agora ser visualizados com um microscópio de fluorescência.

Results

A Figura 2 mostra o movimento da parte dianteira da célula através do canal em resposta a um gradiente de soro fetal de bovino colocado na extremidade oposta do canal, de onde as células são plaqueadas. A parte dianteira da célula é mostrada em 48 h (Figura 2A), 72 h (Figura 2B), 96 h (Figura 2C), e 120 h (Figura 2D) pós chapeamento. O movimento da frente de celular foi rastreado com estas imagens de lap...

Discussion

A nossa câmara de microcanal pode ser utilizado para uma variedade de fins, incluindo a determinação da taxa de migração celular em resposta a factores de crescimento e quimioatractores e medindo a taxa de difusão de um fármaco a partir de uma matriz de polímero. É possível utilizar a câmara de microcanais para crescer as células e colocar um quimioatractor numa extremidade da câmara. As células crescem em resposta ao quimioatraente, e a migração de células pode ser quantificada tomando imagens de lapso de tempo que pod...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de Elastômero de Silicone Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761036	poli(dimetilsiloxano) kit de 2 partes incluindo base de elastômero de silicone e agente de cura de elastômero de silicone
Folhas de Acrílico	US Plastic	44200
Placas de Petri Descartáveis	Falcão	25373-041
isotiocianato de fluoresceína– dextrano	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
Agarose, Tipo I, Baixo EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Fisher	Scientific	11965092	Componentes de mídia celular
Fetal Bovine Serium	Fisher Scientific	16000036	Componentes de mídia celular
Penicilina-estreptomicina	Fisher Scientific	15140148	Componentes de mídia celular
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP24384
EVOS XL Cell Imaging System	Thermo Fisher Scientific	AME3300	Instrumento usado para tirar imagens de lapso de tempo
Versa Laser	Universal Laser Systems, Inc.	Número do modelo VLS2.30	Cortador a laser usado para cortar plástico