Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando proteína morfogênica óssea 4 e inibidores das vias Activina/Nodal. Este método é adequado para a diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas e pode gerar grandes quantidades de células para manipulação genética.

Resumo

A placenta é o primeiro órgão a desenvolver-se durante a embriogénese e é necessária para a sobrevivência do embrião em desenvolvimento. A placenta é composto por várias células trofoblásticas que diferenciam a partir de células trofectoderma extra-embrionárias do blastocisto de pré-implantação. Como tal, a nossa compreensão dos eventos diferenciação precoce da placenta humana é limitada por causa das restrições éticas e legais sobre o isolamento e manipulação de embriogênese humana. As células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs) são um sistema modelo robusto para investigar o desenvolvimento humano e também podem ser diferenciadas in vitro em células trofoblásticas que expressam marcadores de vários tipos de células trofoblásticas. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar hPSCs em células trofoblásticas usando proteína morfogénica do osso 4 e inibidores das vias de sinalização / nodais Activina. Este protocolo gera vários tipos de células de trofoblasto que podem ser transfectadas com ARNsipara investigar fenótipos de perda de função ou podem ser infectados com patógenos. Além disso, hPSCs pode ser geneticamente modificado e, em seguida, diferenciaram em progenitores trofoblásticas de ganho-de-função análises. Este método in vitro de diferenciação para geração de trofoblastos humanos a partir de hPSCs supera as restrições éticas e legais de trabalhar com embriões humanos, e este sistema pode ser usado para uma variedade de aplicações, incluindo a descoberta da droga e pesquisa da célula estaminal.

Introdução

A placenta é necessário para o crescimento e sobrevivência do feto durante a gravidez e facilita a troca de gases, nutrientes, produtos residuais e hormônios entre a circulação materna e fetal. O primeiro órgão formado durante a embriogênese dos mamíferos é a placenta, que começa a desenvolver 6-7 dias pós-concepção em humanos e 3,5-4,5 dias em ratos ^{1, 2, 3, 4.} células trofoblásticas são as células mais importantes da placenta, e estas células representam um dos primeiros eventos de diferenciação linhagem de embrião de mamífero. Eles surge....

Protocolo

NOTA: Para a diferenciação de qualquer hESCs ou hiPSCs em progenitores trofoblásticas, hPSCs cultivadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) são a transição para Alimentador livre condições para duas passagens antes de iniciar a diferenciação com BMP4 / A / P. Este processo elimina a contaminação FAE de células diferenciadas. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a diferenciação de células estaminais embrionárias humanas, e o mesmo protocolo pode ser aplicado a hiPSCs.

1. Cultura e Recuperação de hESCs em irradiados embrionárias de camundongos Fibroblastos (MEFs) (Preparações)

1. A irradiação gama, de MEFs
   1. Adicione ....

Resultados

Visão geral de diferenciação in vitro de hPSCs

Este protocolo de diferenciação in vitro começa com hESCs indiferenciadas cultivadas em MEFs que estão a transição para Alimentador livre condições para uma passagem (Figura 1A). Enquanto nós descrevemos a diferenciação de hESCs neste protocolo, usamos esse protocolo para diferenciar com sucesso hiPSCs em células trofoblásticas. A transição para a m.......

Discussão

Nós apresentamos os passos básicos para a diferenciação de hESCs em progenitores trofoblastos. Este protocolo foi optimizado recentemente para diferenciar rapidamente hESCs com a adição de inibidores da Activina / Nodal sinalização, aumentar a diferenciação de células trofoblásticas e evitando a geração de células progenitoras da mesoderme, que são tipicamente observadas com o tratamento BMP4 sozinho. O sistema modelo BMP4 permite a análise das primeiras fases de especificação trophoblast linhagem humana e expansão. Alé.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
Knock Out Substituição do soro	Invitrogen	10828-028	Isso é chamado de "reposição de soro" neste protocolo.
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutamina	Invitrogen	10828-028
Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen	15140-155
2-Mercaptoetanol	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispase	Invitrogen	17105-041
Colagenase Tipo IV	Invitrogen	17104-019
Inibidor de rocha Y27632	Calbiochem	688000
Irradiado CF1 MEFs	GlobalStem	6001G	MEFs podem ser gerados a partir de embios embrionários de dia 13,5 e irradiados.
0,22 µ m		SLGS033SS de
baixa oxigenação Heracell	/VWR	89187-192	incubadora de cultura de tecidos com capacidade para regular as concentrações de oxigénio é suficiente.
BMP4	R& D Systems	314-BP-01M
A 83-01	R& D Systems	2939/10
PD173074	R& D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizol é usado para isolar o RNA total.
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning	356231	Isso é chamado de "matriz extracelular" neste protocolo.

incubadora Qualquer