Artigo de método

Um método completo para avaliar o

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DOI:

10.3791/55271

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4 de março de 2017

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1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Translational and Molecular Imaging Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Neste artigo

Resumo

A má compreensão do desempenho in vivo dos nanomedicamentos impede sua tradução clínica. Procedimentos para avaliar o comportamento in vivo de nanomedicamentos contra o câncer em níveis sistêmicos, teciduais, unicelulares e subcelulares em camundongos imunocompetentes portadores de tumor são descritos aqui. Essa abordagem pode ajudar os pesquisadores a identificar nanomedicamentos promissores contra o câncer para tradução clínica.

Resumo

Inspirado pelo sucesso de nanomedicamentos câncer anteriores na clínica, os pesquisadores têm gerado um grande número de novas formulações na última década. No entanto, apenas um pequeno número de nanomedicamentos foram aprovados para uso clínico, ao passo que a maioria dos nanomedicamentos sob desenvolvimento clínico têm produzido resultados decepcionantes. Um grande obstáculo para a tradução clínica bem sucedida de novas nanomedicamentos câncer é a falta de uma compreensão exata do seu desempenho in vivo. Este artigo apresenta um procedimento rigoroso para caracterizar o comportamento in vivo de nanomedicamentos em ratinhos portadores de tumor em sistémica, de tecido, de uma única célula, e níveis sub-celulares através da integração da emissão de positrões tomografia computadorizada de tomografia (PET-CT), métodos de radioactividade quantificação , citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Usando essa abordagem, os pesquisadores podem avaliar com precisão novas formulações em nano-escala em modelos de ratos relevantes do cancer. Estes protocolos podem ter a capacidade de identificar os nanomedicamentos câncer mais promissores com alto potencial translacional ou para ajudar na otimização de nanomedicamentos cancerosas para tradução futuro.

Introdução

Nanomedicine está mudando o paradigma do desenvolvimento tratamento do câncer 1. Inspirado pelo impacto clínico enorme de nanomedicamentos câncer anteriores, como liposome- e nanotherapies à base de albumina 2, 3, muitas formulações inovadoras foram produzidas na última década. No entanto, estudos recentes do sucesso clínico tradução destes nanomedicamentos cancerosas indicam que apenas alguns deles têm sido aprovadas para o uso clínico de 4, 5. Um grande obstáculo para a tradução clínica de novas nanomedicamentos câncer é a sua melhoria limitada do índice terapêutico em comparação com a administração direta dos compostos terapêuticos livre 6. Como tal avaliação, exacta do comportamento in vivo de nanomedicamentos em sistémica, tecido, e níveis celulares em modelos animais pré-clínicos é essencial para identify aqueles com índices terapêuticos ideais para futura tradução clínica.

Nanomateriais podem ser radiomarcados para a caracterização quantitativa em animais vivos com a tomografia por emissão de pósitrons de imagem (PET), que tem excelente sensibilidade e reprodutibilidade entre todas as modalidades de imagem clínicos 7. Por exemplo, 89 Zr-marcado de longa circulação nanomedicamentos foram caracterizadas em modelos de ratinho para o cancro 8, 9, 10, bem como em outros modelos de doenças 11. Além disso, a semi-vida no sangue e a biodistribuição dos nanomedicamentos pode ser extensivamente avaliada pela utilização ex vivo medições de radioactividade em tecidos individuais 8. Portanto, a marcação radioactiva permite a avaliação quantitativa de nanomedicamentos em níveis sistémicos e tecidos.

Importante, radiolabeled nanomedicamentos geralmente não podem ser analisados ​​no unicelular ou níveis subcelulares devido à limitada resolução espacial do sinal radioactivo. Assim, a rotulagem fluorescente revela-se uma modalidade complementar para a avaliação de nanopartículas com técnicas de imagiologia óptica, tais como citometria de fluxo e microscopia de fluorescência 12. Para este fim, as nanopartículas marcadas com radioisótopos e marcadores fluorescentes podem ser quantitativamente avaliado in vivo por imagiologia nuclear e ex vivo por contagem de radioactividade, e que também pode ser amplamente caracterizada a nível celular por imagiologia óptica.

Anteriormente, temos desenvolvido procedimentos modulares para incorporar marcadores radioactivos e fluorescentes em várias nanopartículas, incluindo a lipoproteína de alta densidade (HDL), 11, 9, 10 lipossomas, nanopartículas poliméricas, fragmentos de anticorpo, e nanoemulsions 10, 13. Estas nanopartículas marcadas têm permitido a caracterização quantitativa em modelos animais relevantes em diferentes níveis, que orientaram a otimização desses nanomateriais para suas aplicações específicas. No estudo atual, o objetivo é usar nanopartículas-lipossomal plataforma nanomedicina mais estabelecido 14 -como um exemplo para demonstrar os procedimentos abrangentes para gerar uma nanopartícula duplamente marcada e caracterizá-la completamente em um melanoma singênica rato modelo B16-F10 clássico 15 . A partir dos resultados, estamos confiantes de que essa abordagem caracterização de nanopartículas pode ser adaptado para avaliar outros nanomedicamentos cancerosas em modelos relevantes do mouse.

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Protocolo

O processo consiste na marcação radioactiva e dupla fluorescente de nanopartículas, in vivo imagiologia PET-CT, ex vivo de biodistribuição medições, e imunocoloração ex vivo e análises de citometria de fluxo. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal do Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

1. Preparação de lipossomas duplamente marcadas

NOTA: Os tumores de melanoma B16 singeneicas pode ser induzida por injecção de 300.000 células B16-F10 nos flancos traseiros de ratinhos C57BL / 6 sob anestesia de inalação 2% contendo -isoflurane oxigénio. Utilizar os reagentes e instrumentos esterilizados em um espaço de trabalho estéril durante a cirurgia. Após a cirurgia, observar cuidadosamente os animais até à sua recuperação da anestesia. Coloque os animais de volta em suas gaiolas apenas quando recuperar a plena consciência e mobilidade. Abrigá-los em salas estéreis para animais com tumores xenoenxerto. Os tumores com um tamanhode 300 mm a 3 são ideais para a caracterização de nanopartículas, devido aos seus efeitos de permeabilidade e retenção aumentadas pronunciadas (EPR), que podem aumentar a acumulação de nanopartículas. Os protocolos detalhados são fornecidos abaixo.

  1. Em um balão de fundo redondo, dissolver uma mistura de 20 mg de lípidos em 2 ml de clorofórmio contendo 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-phophocholine (DPPC), colesterol, 1,2-sn-glicero-disearoyl- 3-fosfoetanolamina-poli (etileno-glicol) 2000 (DSPE-PEG2000), DSPE-deferoxamina (DFO-DSPE) 8, e ácido 1,1-diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine-5,5-dissulfónico ( DiIC12 [5] -ds) em proporções molares de 61,3%, 33,4%, 5, 0,2% e 0,1%, respectivamente.
    NOTA: Esta composição de lípido é muito semelhante para a formulação lipossómica de doxorrubicina actualmente utilizado na clínica 2. Os lipossomas resultantes do nosso processo vai imitar de perto o desempenho in vivo do nanomedic clínicaine.
  2. Usar um evaporador rotativo para remover o solvente orgânico e formar uma película fina de lípidos, à temperatura ambiente. Adiciona-se 20 mL de PBS e sonicado durante 30 min para gerar nanopartículas de lipossomas utilizando uma ponta ultra-sons de 3,8 mm e uma amplitude de 30 W, com arrefecimento em gelo suficiente.
  3. Centrifugar a solução de lipossomas a 4.000 xg durante 10 minutos para remover os agregados e lavam as nanopartículas com PBS utilizando filtração centrífuga (peso molecular de corte (MWCO:. 100 kDa), para remover os lípidos livres e solvente orgânico residual Concentra-se a lipossomas, o que vai permanecem na câmara de topo, e transferi-las para um novo tubo. os lipossomas podem ser armazenados num frigorífico em PBS durante até 1 semana antes dos passos subsequentes.
  4. Para controle de qualidade, caracterizam os lipossomas por espalhamento dinâmico de luz (DLS). Especificamente, misturar 50 mL de lipossomas com 950 uL de PBS, e em seguida, transferir a mistura para a cuvete de dimensionamento. Colocar a cuba no analisador e medir a partículatamanhos e sua distribuição de tamanho. Os tamanhos das partículas e a sua distribuição de tamanho (índice de polidispersidade (PDI)) deverão ser 90-120 nm e 0,1-0,2, respectivamente.
  5. Para a marcação radioactiva, misturar os lipossomas purificados, o equivalente a 2 mg de lípidos, em PBS, a um pH entre 6,9 e 7,1 com 1 mCi de 89 Zr-oxalato a 37 ° C durante 2 h, num tubo de 1,5 ml, (volume total: ~ 100 mL). Remover o livre, que não reagiu, 89 Zr-se por filtração centrífuga (MWCO = 100 kDa), semelhante ao passo 1.3. Lavar o retentado com PBS estéril e diluir até ao volume desejado. O rendimento de marcação deve ser de 80 - 95%.
    CUIDADO! Trabalhando com materiais radioativos é altamente regulado. As instituições devem ser certificadas e proporcionar as facilidades necessárias, treinamento de pessoal, e um controlo rigoroso do uso de radioatividade. Os pesquisadores precisam receber treinamento adequado e usar equipamento de protecção pessoal e anéis de dosimetria / badges ao manusear radioatividade.
  6. Determinar a pureza radioquímica dos lipossomas marcados radioactivamente por exclusão de tamanho de rádio-HPLC, que normalmente deve ser superior a 98% 10. As purezas radioquímicas inferiores a 95% são indicativos de lavagem insuficiente no passo 1.5.
  7. Após a marcação radioactiva, determinar o tamanho das nanopartículas por dispersão dinâmica da luz. O tamanho e PDI Espera-se que esteja dentro da mesma gama que as medições no passo 1.4 10.
    NOTA: Se amostras radioactivas não são permitidos no citômetro de fluxo ou microscópio de fluorescência, nat não-radioativo Zr-oxalato pode ser usado para rotular lipossomas na etapa 1.5. Estes lipossomas não radioactivos tem características idênticas aos seus análogos radioactivos. Uma descrição deste procedimento é apresentada na Figura 2.

2. In vivo de imagens PET-CT e biodistribuição de lipossomas duplamente marcada

  1. Injectar cerca de 100 ul de lipossomas duplamente marcadas wom cerca de 300 uCi de radioactividade em ratos melanoma impedido (C57BL / 6, fêmeas, de 10 - 16 semanas de idade), através das suas veias da cauda, a cerca de 10 mCi de 89 Zr / kg de peso corporal.
  2. Para determinar a meia-vida, a obtenção de sangue da veia da cauda de animais anestesiados com menos de 2% de isoflurano contendo oxigénio utilizando 28-G seringas de insulina. Recolhe-se o sangue (10-20 uL) em tubos pré-pesados ​​aos 2 min, 15 min, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h e 48 h após a injecção. Pesa-se o sangue por diferença, determinar o teor de radioactividade utilizando um contador gama, e calcular a concentração de radioactividade como percentagem de dose injectada por grama (% ID / g).
    NOTA: Execute o procedimento em uma sala equipada com um sistema de anestesia, gaiolas de recuperação, aquecimento, e um capuz de risco biológico. Certifique-se de que os animais se recuperar totalmente e ganhar mobilidade normal após o procedimento antes de transferi-los de gaiolas de recuperação para segurando gaiolas. Casa os animais portadores de tumor em salas designadas para os animais administrados commateriais radioativos.
  3. 24 ou 48 h após a injecção do lipossomas, a imagem dos camundongos em um pequeno animal MicroPET-CT scanner de 10. Coloque o animal anestesiado horizontalmente em sua barriga e mantê-lo anestesiado. Administrar 2% de isoflurano em oxigênio através de um cone do nariz. Aplicar pomada oftálmica aos seus olhos antes de a digitalização para impedi-los de secagem.
  4. Executar uma de corpo inteiro PET gravação verificação estática, pelo menos, 50 milhões eventos coincidentes, com uma duração aproximada de 15 minutos. Definir janela de tempo a energia ea coincidência 350-700 keV e 6 ns, respectivamente. Em seguida, execute uma varredura 5 min tomografia computadorizada (CT). Ajuste o tubo de raios-X para uma voltagem de 80 kV e uma corrente de 500 mA; a tomografia computadorizada usa 120 passos de rotação para um total de 220 graus, com cerca de 145 ms por fotograma 10.
  5. Após o exame PET-CT, sacrificar imediatamente os ratos por asfixia com dióxido de carbono e confirmar as mortes por pinching as patas dos animais. Uma vez confirmada, realizar luxações cervicais.
  6. Remover o sangue em tecidos de ratinho por primeiro corte aberto do átrio direito e, em seguida, injectando 20 mL de PBS para o ventrículo esquerdo, e posteriormente recolher os tecidos relevantes, tais como tumor, fígado, baço, pulmão, rim, músculo, e outros 16.
  7. Pesar os tecidos, medir o seu teor de radioactividade por contagem gama 8, 9, e calcular a acumulação de radioactividade do tecido como uma percentagem da dose injectada por grama (% ID / g).

3. Ex Vivo citometria de fluxo e imunocoloração

NOTA: Injectar cerca de 100? L de lipossomas fluorescentes de melanoma em ratinhos através da sua veia da cauda a uma dose de 0,5 mg de corante por kg de peso corporal. Se as amostras radioactivas não são permitidos no citômetro de fluxo e microscópio de fluorescência, deve ser utilizado lipossomas não-radioativos.

  1. Sacrificar o h pós-injecção ratos 24, como no passo 2.5, e recolher os tumores, que devem ser armazenados em PBS frio.
  2. Por citometria de fluxo, siga estas etapas 17:
    1. Prepara-se uma mistura de enzimas consiste de uma mistura de colagenase I purificada e II (4 U / mL), hialuronidase (60 U / mL), e a ADNase I (60 U / mL) em citometria de fluxo tampão (PBS com 0,5% de BSA e 1 mM de EDTA).
    2. Misturar 100 mg de tecido tumoral com 200 uL de tampão de cocktail de enzima num tubo de 1,5 mL e cortar o tecido em pequenos pedaços com uma tesoura fina. Adicione outro 1,3 ml de mistura de enzimas para dentro do tubo e transferir o seu conteúdo para um prato de 6 poços.
    3. Agitar a placa de 6 poços, num agitador horizontal colocado dentro de um forno de 37 ° C durante 60 min a 60 rpm.
    4. Lavar o tecido homogeneizado com tampão de citometria de fluxo de 3 vezes para se obter uma suspensão de célula única.
    5. Corar as células com um cocktail de anticorpos específicos para biomarcadores incluindo CD45, CD11b, Ly6C, CD11c,CD64, CD3, MHCII, e CD31 (diluição 1: 200 para todos os anticorpos; clone informação é fornecida na folha de cálculo materiais). Identificar tipos de células relevantes e determinar a sua intensidade de fluorescência média (MFI) de DiIC12 (5) -DS em cada população de células com um fluxo adequado citometria de software de análise.
  3. Para imunocoloração, siga estes passos:
    1. Coloque um tumor em uma cassete cheia com o meio de corte óptima (OCT) e congelá-lo em gelo seco.
    2. Faça 6 mícrons seções congeladas de tecido tumoral e colocá-los em lâminas de histologia de vidro; as secções deverão contemplar as maiores secções transversais do tumor, que fornecem as informações mais representativo no tecido.
    3. Manchar os biomarcadores (por exemplo, CD31 para células endoteliais) de interesse com os anticorpos correspondentes (por exemplo, anti-CD31, clone MEC13.3). Fixar as seções com paraformaldeído; bloqueá-las com soro correspondentes a origem das espécies de anticorpos secundários; incubcomeu com anticorpos primários durante 12 h a 4 ° C e, em seguida, com anticorpos secundários durante 2 h; e, finalmente, lavou-se com PBS e cobrir com lamelas. Imagem as lâminas coradas com uma Leica confocal na vertical SP5 microscópio 13, 16.

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Resultados

A Figura 1 mostra uma visão geral do procedimento. A Figura 2 apresenta o procedimento de síntese esquemática dos lipossomas duplamente marcadas descritas no passo 1 10. A Figura 3 exibe um representante de PET-CT imagem (Figura 3a), a quantificação de radioactividade a partir de imagens de PET (Figura 3b), uma meia-vida no sangue (Figura 3C), e biodistribuição

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Discussão

Passos críticos dentro do Protocolo:

A elevada qualidade dos lipossomas duplamente marcadas é a chave para a produção de resultados consistentes durante um longo período de tempo. Corantes fluorescentes livres ou 89 iões Zr pode gerar totalmente diferentes padrões de segmentação e tem de ser completamente removido durante o passo de purificação. Além disso, se o sistema imunológico afecta significativamente o desempenho experimental nanomedicina cancro, a utilização de modelos de rat...

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Divulgações

Os autores não têm divulgação a fazer.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Helene Salmon e Miriam Merad, da Icahn School of Medicine no Mount Sinai, por fornecer as células B16-F10-YFP e por seus conselhos especializados sobre modelos de camundongos melanoma. Os autores agradecem ainda ao Animal Imaging Core Facility, ao Radiochemistry and Molecular Imaging Probes Core Facility e ao Molecular Cytology Core Facility do Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) por seu apoio. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede NIH 1 R01 HL125703 (WJMM), R01CA155432 (WJMM), K25 EB016673 (TR) e P30 CA008748 (MSK Center Grant). Os autores também agradecem ao Centro de Imagem Molecular e Nanotecnologia (CMINT) da MSK por seu apoio financeiro (T.R.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DPPCAvantilipídeos850355
ColesterolSigma-AldrichC8667
DSPE-PEG2000Avantilipídios880120P
DSPE-DFOCaseiro110634Perez-Medina et al., JNM, 2014
DiIC12[5]-DSAAT Bioquest22051
Filtro centrífugoVivaproductsVS2061
Evaporador rotativoBuchiR-100
Radio-HPLCShimadzu HPLC com 2 bombas LC-10ATN/A
89Zr-oxalatoMSKCCSintetizado em casaTR19/9 ciclotron de feixe variável (Ebco Industries Inc.)
Micro PET-CTSiemensInveon Micro-PET/CT
Contador gamaPerkinElmer2470-0150
Citometria de fluxoBD BiosciencesFortessaQualquer analisador de citometria de fluxo multiparamétrico seria suficiente
C57BL/6 camundongosJackson Laboratories
B16-YFP células de melanomaHome madeN/ASalmão et al., Imunidade, 2016
Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7128025Biolegend
MHCII (M5/114/152)--APC107613Biolegend
CD45 (30-F11)--BV510103137Biolegend
CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7139313Biolegend
CD11b (M1/70)--BV605101237Biolegend
CD3 (17A2) - BV711100241Biolegend
CD31 (13,3) - PE561073Biolegend
CD11c (M418) - PerCP-Cy5.5117327BD Biosciences
CD31 (13,3) sem fluoróforo550274BD Biosciences

Referências

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