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Artigo de método

Desenvolvimento de

21.1K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/55272

⸱

30 de julho de 2017

 ,  , 
1Biochemical Sciences Division, CSIR-National Chemical Laboratory

Neste artigo

Resumo

Aqui, relatamos os diferentes estágios envolvidos no desenvolvimento baseado no conhecimento de um efetivo microssecticida, incluindo o isolamento, identificação, triagem e seleção do fungo entomopatogênico "melhor ajustado", Metarhizium anisopliae , para controle de pragas de insetos na agricultura .

Resumo

Uma grande preocupação no desenvolvimento de micoesecticidas comerciais é a velocidade de morte em comparação com a de inseticidas químicos. Portanto, isolamento e rastreio para a seleção de um fungo entomopatogênico de ação rápida e altamente virulenta são etapas importantes. Os fungos entomopatogênicos, como Metarhizium, Beauveria e Nomurea , que atuam por contato, são mais adequados do que o Bacillus thuringiensis ou o vírus da nucleopolicardia (NPV), que deve ser ingerido pela praga de insetos. No presente trabalho, isolamos 68 cepas de Metarhizium de insetos infectados usando uma diluição do solo e um método de isca. Os isolados foram identificados pela amplificação e seqüenciamento da região do rDNA ITS1-5.8S-ITS2 e 26S. A cepa mais virulenta de Metarhizium anisopliae foi selecionada com base na concentração letal média (LC 50 ) e no tempo (LT 50 ) obtida em bioensaios de insetos contra larvas do estadio III de Helicoverpa armigera.A produção em massa de esporos pela cepa selecionada foi realizada com fermentação em estado sólido (SSF) usando arroz como substrato por 14 dias. Os esporos foram extraídos da biomassa esporulada usando 0,1% de interpolação-80 e foram preparadas diferentes formulações dos esporos. Os ensaios de campo das formulações para o controle de uma infestação de H. armigera em ervilhas foram realizados por delineamento de blocos ao acaso. Os níveis de controle de infestação obtidos com formulações de óleo e aquosas (78,0% e 70,9%, respectivamente) foram melhores do que os 63,4% obtidos com pesticida químico.

Introdução

Da introdução de pesticidas organoclorados na década de 1940 na Índia, o uso de pesticidas aumentou muitas vezes 1 , com as pragas das culturas ainda custando bilhões de rupias 2 anualmente em termos de perda de rendimento na produção agrícola. O uso generalizado e não judicioso de pesticidas sintéticos é uma ameaça contínua para o meio ambiente e a saúde humana 1 . O uso indiscriminado de pesticidas leva a resíduos no solo e à depleção de predadores naturais de pragas. Também serve como uma poderosa pressão de seleção para alterar a composição genética de uma população de pragas, levando ao desenvolvimento da resistência 1 . Apesar dos enormes benefícios da revolução verde, que exigiu insumos altos, como fertilizantes e pesticidas, as pragas continuam sendo uma grande restrição biótica. Uma estimativa geral das perdas registradas de culturas anuais na Índia e no mundo são de US $ 12 bilhõesEf>> 2 e USD 2.000 bilhões 3 , respectivamente.

Quando os pesticidas químicos têm efeitos prejudiciais quando usados ​​para controle de pragas de insetos, torna-se imperativo procurar métodos alternativos ecologicamente sólidos, confiáveis, econômicos e sustentáveis. O controle biológico oferece uma alternativa adequada e inclui o uso de parasitas, predadores e patógenos microbianos 4 . Os fongos, por exemplo, são conhecidos por infectar uma ampla gama de pragas de insetos, incluindo lepidópteros, himenópteros, coleópteros e dipteranos, muitas vezes resultando em epizootias naturais. Além disso, ao contrário de outros agentes de controle de insetos bacterianos e virais, o modo de ação dos fungos patogênicos de insetos é pelo contato 5 . Estes fungos compreendem um grupo heterogêneo de mais de 100 gêneros, com aproximadamente 750 espécies relatadas entre diferentes insetos. Os importantes patógenos fúngicos são: Metarhizium sp., Beauveria sP. Nomuraea rileyi , Lecanicillium lecanii e Hirsutella sp., Para citar alguns 6 . M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin é o segundo fungo entomopatogênico mais utilizado no biocontrole. Sabe-se que ataca mais de 200 espécies de insetos 7 .

Neste estudo, são apresentados diferentes estágios envolvidos no desenvolvimento do conhecimento de um mcopesticiado com M. anisopliae . Isso inclui: 1) a identificação de uma fonte ( ou seja, solos ou insetos micoscos) para entomopatógenos virulentos, 2) identificação e seleção de entomopatógenos, 3) estratégias para manter sua natureza e eficácia virulentas no bioensaio laboratorial e no campo, 4 ) A formulação econômica dos propágulos infecciosos, 5) o desenvolvimento de parâmetros únicos de controle de qualidade para preparação virulenta e 6) bioprospecção e adição de valor.

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Protocolo

1. Isolamento de fungos entomopatogênicos

  1. Método de diluição do solo
    1. Colecione amostras de solo e insetos micoses de diferentes campos de cultivo ( Tabela 1 ). Isolar os fungos entomopatogênicos de amostras de solo usando o método de revestimento de diluição do solo 8 .
      Nota: Neste estudo, as amostras foram coletadas da Pune (18 ° 31'13''N, 73 ° 51'24''E) e Buldhana (19 ° 58'36''N 76 ° 30'30''E ) Distritos, Maharashtra, Índia.
    2. Pesar 10 g de cada amostra de solo e adicioná-las separadamente a 90 mL de Tween-80 estéril 0,1% (p / v).
    3. Misturar completamente as amostras usando um agitador magnético durante 60 min para liberar os esporos aderidos às partículas do solo.
    4. Após a mistura, espalhe alíquotas de 100 a 200 μL de cada amostra para meio seletivo contendo (g / L): peptona, 10; Glucose, 20; Ágar, 18; Estreptomicina, 0,6; Tetraciclina, 0,05; CycLohexamida, 0,05; E dodina, 0,1 mL; PH 7,0 9 . Incubar as placas a 28 ° C durante 3-7 dias.
    5. Selecione e subculte as colônias esporulantes individuais no mesmo meio para obter culturas puras.
  2. De insetos micoscos
    1. Recolher os insetos micoscos do campo.
      Nota: Um corpo larval duro provavelmente será infectado com fungo entomopatogênico. Com infecção bacteriana ou viral, o corpo de inseto morto é macio.
    2. Recolher insetos vivos com comportamento anormal, coordenação fraca e movimentos bruscos.
    3. Mantenha os insetos até a morte e depois transfira-os para câmaras húmidas para mósse e esporulação, se houver, a 28 ° C e 70-80% de HR.
    4. Ralase os esporos dos cadáveres esporulantes no meio seletivo acima mencionado e obtenha culturas puras por subcultivação adicional 2-3 vezes no mesmo meio.
  3. Método da isca
    1. Em umUm frasco (3.85 x 6.0 cm) contendo 60 g de amostra de solo, adicione 4 larvas de traça de arroz ( Corcyra cephalonica ) e mantenha os frascos a 25 ± 2 ° C por um período de 14 dias.
    2. Vire os frascos de cabeça para baixo todos os dias. Após 14 dias, verifique as amostras de solo para a presença de larvas de traça de arroz micoescrito. Isolar o fungo entomopatogênico através da varredura de esporos de cadáveres esporulados em meio seletivo.
    3. Após a obtenção de culturas puras, transferir os isolados para adereços de agar de dextrose de batata (PDA) e incubar a 28 ° C e 70-80% de HR durante 7 dias para permitir a esporulação. Após a esporulação, mantenha as culturas da mãe a 8 ° C até o uso.

2. Identificação de fungos entomopatogênicos

  1. Identificar fungos entomopatogênicos observando características morfológicas ( ou seja, tamanho e forma de esporos assexuados e disposição dos esporos em conidióforos); Isolados de 3 gêneros principais, Metarhizium , Beauv Eria e Nomuraea , podem ser identificados.
  2. Para a identificação molecular de cepas de Metarhizium , extrair o DNA genômico da biomassa micelial usando um kit de isolamento de DNA; Siga as instruções do fabricante (veja a Tabela de Materiais ). Verifique a qualidade do DNA genômico realizando eletroforese em um gel de agarose a 0,8%.
    1. PCR-amplificar a região do rDNA ITS1-5.8S-ITS2 e 26S. Use o DNA genômico como um modelo, com primers ITS1 para frente (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 reverso (TCCTCCGCTTATTGATATGC) 10 .
    2. Gel-elute e purifique os amplicões de tamanho esperado usando um kit de extração de gel; Siga as instruções do fabricante (veja a Tabela de Materiais ). Quantifique o amplicão e a sequência purificados.
    3. Leia e edite as sequências usando o software e realize uma busca BLAST das seqüências de nucleotídeos na biblioteca de dados NCBI GenBank para analisar a homologia próxima= "Xref"> 11.
    4. Deposite as sequências de isolados entamopatogênicos identificados na base de dados NCBI GenBank para recuperar os números de acesso.

3. Rastreio de isolados de Metarhizium contra H. armigera

  1. Criação de insetos
    1. Estabeleça a cultura inicial de H. armigera coletando larvas saudáveis ​​e pupas do inseto do campo.
    2. Para a criação, cultivar as larvas individualmente em frascos de polipropileno estéreis (3.85 x 6.0 cm, capacidade de 50 mL) contendo pedaços de quiabo desinfectados com hipoclorito de sódio a 0,5% (v / v) durante 10 min 12 .
    3. Recolher os ovos de insetos colocados durante a criação e esterilizar a superfície com 0,5% (v / v) de hipoclorito de sódio.
    4. Manter as larvas a 25 ± 2 ° C e 65 ± 5% de HR.
  2. Bioensaio de insetos
    Nota: Para o bioensaio do inseto, a produção de esporos,E estudos de desempenho em campo, foram utilizadas as primeiras subculturas de cepas de Metarhizium de larvas de H. armigera misturadas, salvo indicação em contrário.
    1. Para os bioensaios de insetos, use larvas de III-instar de H. armigera .
    2. Dip um conjunto de 30 larvas em triplicado individualmente em uma suspensão de esporos de 10 mL de isolados Metarhizium (1 x 10 7 esporos / mL, a menos que seja mencionado de outra forma, viabilidade> 90%) durante 5 s.
    3. Após o tratamento, transfira cada larva individualmente para um frasco esterilizado separado para evitar o canibalismo. Para cada frasco, adicione o papel de filtro Whatmann úmido Nº 1 e um pedaço de quiabo desinfectado como alimentação. Altere o papel e alimente-se em dias alternados.
    4. Mantenha as larvas a 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% de HR e 16: 8 de luz: escuras durante 14 dias ou até morrerem.
    5. Transfira as larvas mortas para placas de Petri estéreis contendo cotonete de algodão úmido e mantê-las a 28 ° C e 70-80% de HR por 3-7 dias para permitir micelio e esporosFormação sobre os cadáveres.
    6. Para um controle, trate um conjunto de 30 larvas em triplicado com Tween-80 a 0,1% (p / v) em água destilada estéril.
    7. Conduza todas as experiências em triplicado usando suspensões de esporos recém-preparadas. Coletar e agrupar os dados sobre porcentagem de mortalidade de três experimentos para obter valores médios. Calcule a porcentagem de porcentagem corrigida usando a fórmula 13 de Abbott.
    8. Execute as experiências utilizando um layout de design de blocos completos (RCBD), com cada tratamento contendo um conjunto de 30 larvas em triplicado. Com base na percentagem de mortalidade contra H. armigera , selecione os isolados de Metarhizium para posterior rastreio do melhor isolado para produção comercial.
    9. Selecione os isolados que demonstram> 90% de mortalidade contra larvas de H. armigera III-instar.
      Nota: Aqui, foram selecionados 12 isolados.
    10. Determine o LT 50 destes isolados e selecione os isolados demonstClassificando a morte mais rápida (em menos tempo).
      Nota: Aqui, foram selecionados 5 isolados dos 12 isolados mais potentes.
    11. Determine os valores de LC 50 dos isolados selecionados usando quatro concentrações diferentes (ie 1 × 10 3 , 1 × 10 5 , 1 × 10 7 e 1 × 10 9 esporos / mL) de suspensão de esporos.
    12. Determine a LC 50 dos isolados Metarhizium contra larvas III-instar de H. armigera para aumentar a possibilidade de identificar a diferença de virulência de isolados com altos valores de mortalidade que podem não ser detectados se apenas uma única dose for utilizada.

4. Produção de esporos de um isolado de metarízio para estudos de desempenho em campo

  1. Produção de esporos de Metarhizium por SSF
    1. Para SSF, prepare o inóculo adicionando 2 x 10 7 esporos dos isolados Metarhizium para200 mL de YPG (0,3% de extracto de levedura, 0,5% de peptona e 1,0% de glucose) médio. Incubar os frascos a 28 ° C com agitação (180 rpm) durante 48 h.
    2. Para a produção em massa de esporos por SSF, use arroz como substrato a menos que seja observado de outra forma.
    3. Para SSF, preencha os sacos de autoclave (tipo / 14 com um único filtro microvalorado de 0,5 μm, 2 kg de capacidade, 64 × 36 cm) com 2 kg de arroz. Adicione 1000 mL de água destilada ao arroz nos sacos e remova durante a noite 14 . Autoclave os sacos com o arroz embebido a 121 ° C durante 45 minutos 15 .
    4. Inocule os sacos com inóculo micélico de 48 horas (inóculo a 10%, 200 mL para 2 kg de arroz) e incube a 28 ° C e 70-80% de HR por 14 dias.
    5. Colher os esporos por extração líquida usando 0,1% de Tween-80. Para isso, adicione o conteúdo do saco a 0,1% de Tween-80 (3 L por 1 kg de arroz), misture bem, separe os esporos do líquido por centrifugação e secar a 37 ° C por 2 dias. < / Li>
    6. Alternativamente, secar os sacos contendo arroz com os esporos e alguns micelios a 37 ° C por 2 dias para reduzir o teor de umidade (<20%). Colher os esporos usando um mico-colhedor ou vibro-sifter.
  2. Estudos de viabilidade
    1. Determine a percentagem de viabilidade dos esporos colhidos utilizando diferentes métodos 15 . Para isso, prepare as suspensões de esporas em Tween-80 a 0,1% (p / v) e ajuste a contagem para 1 × 10 3 esporos / mL.
    2. Espalhe as suspensões de esporos (0,1 mL) em placas de PDA em triplicado e incube a 28 ° C e 70-80% de HR por 72 h.
    3. Contar manualmente as colônias isoladas e determinar a contagem total viável para a respectiva amostra.
  3. Taxa de sedimentação de esporos
    1. Para uma dosagem uniforme, é necessária a suspensão homogênea de esporos; Determinar as taxas de sedimentação de esporos para isolados Metarhizium como descrito"Xref"> 16. Verifique as taxas de sedimentação de esporos em sulfato de amônio 0,2 M e 0,1% de Tween-80.
    2. Ajuste a contagem da suspensão de esporos para ~ 7 × 10 7 esporos / mL para obter uma absorvância inicial de 0,6 a 540 nm. Permita que as cubetas permaneçam sem perturbação durante 6 h para os esporos para se instalarem.
    3. Registre a absorvância por até 6 h. Expressar a taxa de sedimentação em por cento e calcular o tempo necessário para que 50% de sedimentação (50 ST). Repita o experimento três vezes usando suspensões de esporos recém-preparadas.

5. Estudos de desempenho em campo sobre a capacidade do isolado M. anisopliae isolado para controlar H. armigera em Pigeon Peas

  1. Formulação em pó molhável de M. anisopliae M 34412 esporos
    1. Prepare a formulação em pó molhável a 2,5-5% misturando os esporos com talco.
    2. Ajuste a contagem viável final (TVC) para 1 x 10 12 ptsRes por kg de formulação.
  2. Estudos de desempenho de campo de esporos M. anisopliae M 34412
    1. Para estudos de campo sobre a capacidade do isolado de M. anisopliae selecionado para controlar a infestação de H. armigera em ervilhas, use um RCBD com quatro repetições.
      Nota: Aqui, realizada em Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927 ° N, 74.6488 ° E).
    2. Use duas formulações de pulverização diferentes, uma formulação de óleo de esporos (5 x 10 12 esporos / 3 L de diesel: óleo de girassol, 7: 3) e uma formulação aquosa em Tween-80 (0,1%). Pulverizar a formulação de óleo com um pulverizador de volume ultra-baixo (ULV) (70 min; 3 L / ha) a formulação aquosa com um pulverizador de mochila (5 x 10 12 esporos, 500 L / ha).
      Nota: Aqui, as populações de larvas foram registradas um dia antes da pulverização e 3 e 7 dias após a aplicação de cada spray a 5 plantas selecionadas aleatoriamente. A população total era tRedigida na raiz quadrada de n + 1 para a análise estatística.
      1. De acordo com as práticas agrícolas para a colheita de pombo, realize a primeira pulverização entre 10 e 15 dias após a colocação dos ovos e 2 vezes mais com um intervalo de 14 dias. Execute a pulverização entre as 16:00 e as 18:00 h IST. Monitore a direção do vento e, se necessário, use cortinas de tecido para evitar a deriva de esporos para parcelas vizinhas.
    3. Para comparação, pulverize os inseticidas químicos com um pulverizador de mochila de mão.
    4. Determine a persistência do inóculo no campo coletando larvas de H. armigera 0, 3, 5, 7 e 14 dias após a pulverização.
    5. Mantenha estas larvas sob observação por um período de 14 dias e após a morte, transfira-os para um frasco de plástico contendo papel de filtro úmido. Incubar a 25 ± 2 ° C e 70 ± 10% de HR para observar micoses.
    6. Determine a persistência do inóculo na população larval com base na p Dados de mortalidade contingente das larvas coletadas no campo após a pulverização.
    7. Avalie os estudos de campo com base na percentagem de eficácia 17 , percentagem de danos causados ​​e rendimento percentual 18 .
      Nota: Aqui, os dados para os parâmetros, como temperatura, umidade, velocidade do vento (km / h), luz do sol (h), precipitação (mm), dias chuvosos e evaporação (mm), foram registrados durante um teste em um Universidade de agricultura (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E).
  3. Programa participativo dos agricultores
    1. Selecione o número de agricultores para os testes de demonstração. Forneça as sementes de ervilhas (BSMR - 736) juntamente com fertilizantes para os agricultores.
      Nota: neste estudo, 20 agricultores estavam envolvidos. Aldeia: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E).
    2. Use as mesmas formulações de pulverização e o número de pulverizações como no passo 5.2.
"6. Efeito sobre organismos não visados

  1. Observe o efeito do spray de mycoinsecticida, se houver, nas folhas de ervilha-pombo.
  2. Recolher os artrópodes da habitação do solo e os insetos que habitem folhas 1 dia após cada tratamento nas parcelas não tratadas e nas parcelas tratadas com M. anisopliae .
  3. Recolher os artrópodes do solo com armadilhas de armadilha dentro de 24 h após o tratamento e coletar os insetos que habitam a folha com uma rede de varredura na manhã seguinte ao tratamento ( ou seja, cerca de 15-18 h após o tratamento).
  4. Mantenha-os individualmente em caixas cilíndricas de plástico com diâmetros de 3,5 cm e alturas de 4,0 cm. Verifique os insetos diariamente para infecção e alimente-os com o alimento apropriado.
  5. Registre a presença de M. anisopliae , se for o caso, e isolar o fungo.

7. Identificação dos parâmetros de controle de qualidade

  1. Verifique a viabilidade dos esporos medindo a germinação do esporo em PDA a 28 °C;
  2. Medir as atividades da enzima de degradação da cutícula, como a quitinase, a quitina desacetilase, a quitosanase, a protease e a lipase, produzidas nos meios YPG e quitina, conforme descrito anteriormente 15 .
  3. Determine a porcentagem de mortalidade de H. armigera em um bioensaio laboratorial 15 .
  4. Use marcadores moleculares, como um padrão PCR-RFLP de Chitinases ( Chit 1 , 2 e 4 ) e genes de protease ( Pr1A ), como atributos de virulência para M. anisopliae .
    1. Extraia o DNA genômico da biomassa do micélio usando um kit de isolamento de DNA 15 . Amplificar por PCR os fragmentos de genes e chit1 Chit2 utilizando ADN genómico como modelo, com os pares de iniciadores Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) e Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). Para Chit4 , use o par de iniciadores Chit4F / Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG).
    2. Para a amplificação do gene Pr1A, use o par de iniciadores METPR2 e METPR5 (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG).
    3. Executar a digestão de restrição do gene 19 chit1 com BsaJI, BstUI e ScrFI; do gene Chit2 com Alui, HpyCH4IV, e HpyCH4V, e do gene Chit4 com BstUI, HaelII, e Mbol. Para a digestão do gene Pr1A, usar Rsal, Ddel, e MspI 20.
    4. Observe o padrão de polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (RFLP) em 1,5% de gel de agarose por eletroforese para cada gene para estirpes mais virulentas (> 90% de mortalidade); Isso pode ser usado como um marcador de virulência para a seleção de M. anisopliae .

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Resultados

Durante as investigações, diferentes estirpes de Metarhizium, Beauveria e Nomuraea foram isoladas por vários métodos de isolamento (dados não mostrados) 6 , 14 Como as cepas de Metarhizium foram mais eficazes no controle de H. armigera , uma praga terrível em pulsos 6 , 14 , Outros isolamentos foram direcionados para isolar cepas de Metarhizium de diferentes c...

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Discussão

Durante a década de 1880, a primeira tentativa foi feita para usar o Metarhizium para controlar o escaravelho, Anisoplia austriaca e o curculio de beterraba, Cleonis punctiventris 21 . Neste protocolo, um dos pré-requisitos era isolar uma cepa virulenta, proveniente do solo ou de insetos infectados. De fato, outros parâmetros, como LC 50 , LT 50 e ST 50 , contribuíram significativamente para a relação custo-eficácia do produto

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o contributo dos colaboradores do programa de Colaboração Indo-Suíça em Biotecnologia (ISCB) do Departamento de Biotecnologia de Nova Deli e da Agência Suíça para o Desenvolvimento e Cooperação, Berna, Suíça. São reconhecidas as contribuições dos alunos e funcionários do projeto envolvidos no desenvolvimento do microssecticida, incluindo Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane e Abhijeet Lande. A EKP ea SGT agradecem a Comissão de Bolsas Universitárias, a Índia e o Conselho de Pesquisa Científica e Industrial (CSIR), Índia, respectivamente, para bolsas de pesquisa. MVD reconhece o apoio do Conselho de Pesquisa Industrial e Científica, New Delhi para o Emeritus Scientist Scheme. Os autores agradecem ao Departamento de Biotecnologia, Nova Deli, Índia, pelo apoio financeiro nos programas ISCB e SBIRI. Agradecemos aAvaliadores por suas insumos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AgarHi-MediaRM666Reagente
Sulfato de amônio Thomas Baker11645de reagente
 Prisma ABI biossistema aplicado3730   instrumento
Kit de islação de DNAQiagen69104Reagente
DodineSigma45466
Kit de extração de gelQiagen28604Reagente
GlicoseHi-MediaGRM077Reagente
Knapsac sparyerKaypeeHY-16L (1004)Instrumento
PeptonaHi-MediaRM006-500GFrascos de polipropileno reagente
 LaxbroSV-50Plasticware
Ágar Dextrose de Batata (PDA) Hi-MediaM096-500GReagent
Tween-80SRL28940Reagent
Ultra low volume sparyerMatabiINSECDISK
Instrument Unicorn-bags UnicórnioUP-140024-SMBAutoclavalbe saco para
extrato de leveduraHi-MediaRM027-500Greagente
Chromas 2.1software
Analisador de DNA reagente SSF

Referências

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