Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose (TB), é uma das principais causas de morbilidade e mortalidade em todo o mundo. TB sensível a drogas é uma doença tratável que requer múltiplos antibióticos durante um período de 6 meses. Apesar de ser uma doença tratável da taxa de mortalidade foi estimada em 1,5 milhões em 2015 ^um. Nos últimos 10 anos, tem vindo a aumentar as preocupações com a prevalência de fármaco-resistentes de M. tuberculosis. Multirresistente tuberculose (TB-MR) é definida como a tuberculose que é resistente a pelo menos isoniazida (INH) e Rifampicina (RMP), e a maioria das estirpes de MDR-TB são também resistentes para seleccionar fármacos para a tuberculose de segunda linha, o que limita as opções de tratamento . Os efeitos da resistência à droga criar um maior desafio para o tratamento de pacientes co-infectados com o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV); 400.000 doentes em todo o mundo morreu de tuberculose associada ao HIV em 2015 ^um. Lamentavelmente, os Estados Unidos Food and Drug Administração aprovou apenas uma nova droga TB contra a MDR-TB, bedaquilina, nos últimos 40 anos ^2. Avanços em encontrar melhores e mais curtas terapias de tuberculose são urgentemente necessários, a fim de permanecer à frente na luta contra a TB e MDR-TB.

Tradicionalmente, as telas de drogas de TB são realizadas sob condições de crescimento in vitro em meio de crescimento, através do qual os compostos são adicionados a uma cultura em crescimento e a sua eficácia na erradicação dos microrganismos são determinadas pela contagem de unidades formadoras de colónias (CFU) em meio sólido. Como contagens de UFC é trabalho intensivo, demorado, e caro, vários métodos indiretos foram desenvolvidos para aliviar este problema. Tais métodos incluem o ensaio de viabilidade Alamar Blue ^3, a determinação da fluorescência a partir de ⁴ proteína verde fluorescente (GFP) ou luminescência ⁵ a partir de bactérias que expressam luciferase, e a estimativa do trifosfato de adenosina total de (ATP) ^{6, 7.}

TB típica é caracterizada por uma infecção de M. tuberculosis do pulmão, onde residem as bactérias e replicar no interior das fagossomas de macrófagos alveolares ^8. A tela fenotípica simples no caldo pode atender patógenos extracelulares; no entanto, na perspectiva histórica, bateu compostos contra M. tuberculosis identificados usando este método muitas vezes não conseguem corresponder às expectativas durante as etapas de validação de transformação em modelos de infecção. Propomos que a droga TB é melhor executada em um modelo de infecção da célula hospedeira intracelular. No entanto, os modelos intracelulares possuem muitos obstáculos tecnológicos e biológicos para triagem (HTS) desenvolvimento de alto rendimento. Um grande obstáculo é a complexidade do processo de infecção, exemplificado por numerosos passos e a remoção de bactérias extracelulares elaborada por no meio de lavagem. Um segundo grande obstáculo é o longo tempo de requirements, como a detecção de crescimento, normalmente feito por contagem de CFU nas placas de cultura, é um processo que demora mais de 3 semanas para completar. Uma solução para substituir contagens de UFC foi fornecida por microscopia fluorescente automatizada em combinação com bactérias fluorescentes. No entanto, esta solução requer um investimento inicial equipamento que está fora do alcance de muitos laboratórios de pesquisa. Uma simples, de baixo custo, e método HTS doença relevante aumentaria grandemente o processo de descoberta de drogas.

Neste estudo, são descritos um novo sistema de HTS, modular que visa proporcionar uma rápida e altamente flexível, mas económica, ensaio adequado para a determinação da actividade de compostos contra intracelular de M. tuberculosis. Este sistema é composto por três módulos: (i) intracelular, (ii) da citotoxicidade, e (iii) Ensaios in-caldo. O resultado final combinada fornece uma descrição detalhada das propriedades do composto, com a informação adicional quanto ao modo de potencial de acção. este screening sistema tem sido utilizado em vários projectos com várias bibliotecas de compostos, o modo de acção que têm como alvo, incluindo a análise de sinergia droga ^9, a estimulação de autofagia ^10, e a inibição de M. tuberculosis -secreted factor de virulcia (não publicado). Os compostos de modo desconhecido de ação também foram estudados ^11. Uma versão modificada deste método foi também adoptada pelo nosso parceiro industrial como o método de rastreio primário de identificar novos compostos contra intracelular de M. tuberculosis ^11.

1. Estirpe bacteriana e Meio de Crescimento

1. Adicione de dextrose e albumina de solução de estoque de sal (ADS) por solubilização de 25 g de albumina de soro bovino, 10,0 g de dextrose, e 4,05 g de cloreto de sódio em 460 mL de água desionizada. Filtro-esterilizar a ADS e armazenar a 4 ° C.
2. Adicione 7H9 pela adição de 4,7 g de 7H9 em pó e 2 ml de glicerol a 900 mL de água purificada. Autoclave o 7H9 a 121 ° C durante 10 min e permita que arrefeça para a temperatura ambiente antes de continuar. Adicione 7H9ADST por adição de 100 mL de ADS e 0,5 ml de Tween 80 a 900 mL de caldo 7H9. Armazenar a 4 ° C.
3. Pesar 50 mg de sulfato de canamicina e dissolver em 1 ml de água desionizada; a concentração final é de 50 mg / mL. Filtro-esterilizar e armazenar a -20 ° C. Adicionar 0,5 mL de canamicina solução estoque por 1 L de 7H9ADST.
   NOTA: Este meio deve ser feita, de modo dimensionar os volumes apropriadamente de acordo com o tamanho da cultura.
4. Crescer M. tuberculosis em 7H9ADST suplementado com canamicina em pé cultura. Agite a cultura diariamente e dilui-lo antes da DO600 atinge 1,0 para evitar aglomeração.
   NOTA: A estirpe de M. tuberculosis utilizado para o desenvolvimento deste método foi H37Rv transformada com o plasmídeo pJAK2.A ^12. pJAK2.A é um plasmídeo integrativo baseado no vector pMV361, que permite a expressão de alto nível do gene luciferase de pirilampo do promotor hsp60 e pode ser seleccionado utilizando canamicina.

2. THP-1 e Meio de Manutenção

1. Adicionar 50 mL de soro inactivado por calor de bovino fetal (FBS) e 5 mL de 200 mM de L-glutamina e 500 mL de meio RPMI 1640 para fazer meio RPMI incompleta (cerca de 10% de FBS e glutamina 2 mM).
2. Manter uma cultura de células THP-1 de acordo com o protocolo padrão ^13. Resumidamente, crescer as células THP-1 em meio RPMI incompleta mantendo ao mesmo tempo uma densidade celular de 0,2 a 1 milhão por ml de meio entre passábios.

3. Apresentação de intracelular de alto rendimento usando-expressar luciferase M. tuberculosis H37Rv

1. Medir a densidade óptica de uma suspensão de bactérias em crescimento activo num espectrofotómetro a um comprimento de onda de 600 nm. Calcular a densidade bacteriana utilizando o factor de conversão de 0,1 OD ₆₀₀ = 3 x 10 ⁷ de bactérias por ml.
2. Pipetar as bactérias suficientes para uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10: 1 para um novo tubo de centrífuga. Sedimentar a 3000 xg durante 10 min e aspirar o líquido. Adicionar 50 ul de soro humano a 450 uL de RPMI 1640. Dimensionar o volume de se apropriar valores para a experiência.
3. Para opsonizar as bactérias, ressuspender o sedimento a uma densidade de 1 x 10 ⁸ de bactérias por 500 ul de RPMI1640 contendo 10% de soro humano. Deixar a mistura a incubar a 37 ° C durante 30 min. Determinar a densidade da cultura de células THP-1 por contagem com um hemocitómetro e um microsco invertidoPE.
4. Sedimentar as células em tubos de centrífuga estéreis, a 100 x g e 37 ° C durante 10 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em meio RPMI incompleta a uma densidade de 1 milh de culas por mL. Adicionar forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) para uma concentração final de 40 ng / mL.
   NOTA: Este será referido como o mix diferenciação.
5. Combinar opsonizado de M. tuberculosis com THP-1 mistura de diferenciação, a uma MOI de 10: 1 e alíquotas da mistura final em 100 ul por cavidade em uma placa branca de 96 pos de fundo plano. Regularmente agita-se a mistura para assegurar a uniformidade. Permitir que a diferenciação e a infecção prosseguir durante a noite a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO _2.
6. Lavam-se os poços duas vezes com 100 uL de meio RPMI cada. Adicionar compostos diluídos para as concentrações desejadas em RPMI incompleta e incubar durante 3 dias.
7. Aspirar o meio das cavidades. Adicionar 50 uL de reagente de ensaio de luciferase para cada cavidade. Selar as placas com transparent selantes de placas adesivas. Permitir 5 min de incubação a 22 ° C e, em seguida, obter uma leitura num luminómetro em 1 s por poço.

4. Análise de Citotoxicidade Usando um grupo 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) ¹⁴

1. Diferenciar células THP-1 em meio RPMI incompleto suplementado com 40 ng / ml de PMA, em placas de 96 poços claras. Manter uma densidade celular de 1 milhão por ml e alíquota de 100 uL por poço. Permitir diferenciação prosseguir durante a noite a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO _2.
2. Aspirar o meio dos poços e lava-se duas vezes com RPMI 1640. Adicionar compostos diluídos em RPMI incompletos para os poços. Incuba-se durante 3 dias.
3. Dissolve-se 0,5 g de MTT em 100 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para produzir uma solução stock de 5 mg / mL. Filtrar em condições estéreis e armazenar a -20 ° C, ao abrigo da luz; é melhor fazer esta solução fresca.
4. 2,5 horas antes da suae o fim do período de incubação de 3 dias, adicionar 25 ul de solução de MTT a cada poço e completar o período de incubação.
5. Prepare a 50% de N, N-dimetil formamida (DMF) por mistura de 250 mL de DMF com 250 mL de água desionizada.
6. Preparar tampão de extracção de MTT como se segue: Pesar 100 g de SDS em um frasco de 500 ml e adicionam-se 300 mL de 50% de DMF. Aplicar fogo baixo para permitir que o SDS para dissolver. Adicionam-se 10 mL de ácido acético puro e 12,5 mL de HCl 1M. Encha até à marca de 500 mL com 50% de DMF; a composição final do tampão de extracção é de 50% de DMF, 20% de SDS, ácido acético a 2,5%, e 2,5% de ácido clorídrico 1 M.
7. No final do período de tratamento, adiciona-se 100 uL de tampão de extracção (aquecida a 45 ° C para dissolver todos os cristais) para cada poço. Deixar a mistura a incubar durante a noite a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO _2. Leia a absorvância a 570 nm.
   NOTA: O ensaio de citotoxicidade é melhor realizado em paralelo com um intracelulartela ular usando mesmo lote e idade das células THP-1.

5. No caldo Análise Atividade Usando um resazurina Ensaio ³

1. Crescer M. tuberculosis em 7H9ADST à fase mid-log (~ 0,5-0,8 OD _600). Dilui-se a cultura com a 7H9ADST a 0,01 _OD600. Dilui-se os compostos em 7H9ADST 2x as concentrações de teste e alíquota de 100 ul de cada composto diluída para cada poço.
2. Transferir 100 ul da suspensão bacteriana diluída para cada poço. Permitir que as placas a incubar a 37 ° C num incubador humidif içado, durante 5 dias. Dissolve-se 10 mg de resazurina em 100 ml de água desionizada e o filtro esterilizado.
3. Adicionar 30 mL de solução de resazurina e controlar a mudança de cor após 48 h; o crescimento bacteriano é indicado por uma conversão de cor de azul para rosa.
   NOTA: A análise quantitativa também pode ser realizada medindo quer a fluorescência a 590 nm com excitação a 530-560nm ou a absorvência a 570 nm e 600 nm ^{de 15.}

Rastreio intracelular de alto rendimento usando M. tuberculosis expressando o gene da luciferase

A Figura 2A e na Tabela 1 contém os dados brutos recolhidos pelo luminómetro, expressa em unidades luminescentes relativas (RLU), mostrando o efeito de uma concentração crescente da droga rifampicina em M. tuberculosis TB no interior das células THP-1. A Figura 2A é um gráfico de dispersão da matéria-luminescência medida em RLU para várias concentrações de rifampicina. As barras de erro indicam o erro padrão da média (SEM). A Figura 2B mostra a redução percentual na luminescência em pos tratados em comparação com os poços não tratados. Os dados mostram que a rifampicina é capaz de reduzir> 99,9% de RLU de intracelular de M. tuberculosis, a uma concentração de 0,1 ug / mL. Isto está de acordo com o previously publicada MIC entre 0,1 e 0,4 ug / mL de 16. Luminescência produzida em cada poço é uma indicação da luciferase total expresso por M. tuberculosis e, portanto, é um indicador do estado metabólico de M. tuberculosis, no interior do poço. É normal para níveis luminescentes matérias a variar entre experiências. Como tal, a comparação dos dados brutos geraria conclusões confiáveis. Assim, os dados devem ser normalizado contra um controlo negativo definido, que seriam as amostras tratadas apenas com DMSO. Os valores resultantes podem ser expressos como a percentagem de redução de M. tuberculosis nos poços (Figura 2B).

análise de citotoxicidade utilizando o ensaio de MTT

O ensaio com MTT é um ensaio bem estabelecido para a citotoxicidade eucariótica. Este ensaio colorimétrico indica células vivas através da conversão de MTT (amarelo) deformazano de cor roxa. Este ensaio é realizado sem uma infecção por M. tuberculosis porque as bactérias são capazes de metabolizar o MTT, o que reduz a toxicidade observada dos compostos. Uma sugestão comum para o ensaio com MTT é a utilização de meios de comunicação sem o indicador de pH vermelho de fenol, devido à absorção a 570 nm 17. No entanto, o tampão de extracção acidificada descrito no presente método é capaz de minimizar a interferência causada pelo vermelho de fenol 17.

A Figura 3 ilustra a citotoxicidade causada por uma concentração crescente de um composto de teste codificada G1-1H. Normalmente, uma concentração inibidora em 50% (IC50) é empregue para indicar o nível de citotoxicidade. No caso de G1-1H, concentrações de 10 uM e 3 | iM são claramente abaixo da concentração IC50.

Em caldo análise da atividade nosção do ensaio resazurina

O ensaio de resazurina é comumente utilizado para a análise de citotoxicidade em células eucarióticas, mas também pode ser utilizado para monitorizar a bactérias vivas em caldo de 3. O ensaio de resazurina é um ensaio à base de redox semelhante ao ensaio MTT. Ele mede os níveis de actividade de desidrogenase de NADPH e NADPH através da conversão de resazurina em resorufina, um fluoróforo vermelho. A maneira mais fácil e mais rápido para determinar a eficácia do fármaco é olhar para a concentração mais baixa de tratamento onde os poços permanecer azul em cor. A Figura 4 mostra parte de uma placa de 96 poços que mostra os efeitos de várias concentrações dos antibióticos têm apramicina em resazurina conversão por M. tuberculosis. A MIC no caldo foi determinado para ser entre 2,5 e 5 ug / mL. Este valor é ligeiramente superior ao valor previamente publicada de 1,5 ug / mL de 18, mas ainda está bem dentro da acceptabgama le. Em muitos casos, a mudança de cor é bastante gradual, por isso é difícil fazer uma determinação confiante. Sob estas condições, é melhor para quantificar a quantidade real de resazurina conversão usando absorvância ou de fluorescência. Devido às características de absorvância semelhantes de resazurina e resorufina, a determinação de MIC utilizando absorvância requer medições usando dois comprimentos de onda diferentes e complexos cálculos 15. Por conseguinte, o melhor método é a de medir a fluorescência utilizando a 530- 560 nm de comprimentos de onda de excitação e um comprimento de onda de emissão de 590 nm, como descrito na literatura do fabricante 15.

A Figura 4 ilustra uma potencial fonte de inconsistência associada com incubações multiday que podem alterar drasticamente resultados do rastreio. Devido a humidificação imprópria da incubadora a 37 ° C utilizada para esta experiência, os poços nas bordas do p lates sofreu significativamente mais evaporação. Todos os 15 poços tratados com DMSO são supostos ser idênticos, mas as cavidades ao longo das bordas esquerda e de topo tinha reduzido volume. Estas cavidades também parecem ter cores diferentes do que os outros poços tratados com DMSO no meio da placa. O mesmo inconsistência também pode ser observada em 2,5 ug / ml de poços tratados com apramicina. Neste caso, o volume reduzido levaria também a uma leitura quantitativa por um espectrofotômetro e fluorímetro. A evaporação torna-se significativo para todas as experiências com tempos de incubação prolongados, de modo que deve ser tomado cuidado para manter incubadoras bem humedecida para evitar esta fonte de inconsistência.

Figura 1: Esquema Método. Diagrama que descreve esquemas de ensaio durante 3 módulos separados do sistema de rastreio de alto rendimento. _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg" target = '_ blank'> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Os dados representativos a partir de uma intracelular para examinar a eficácia de rifampicina em M. tuberculosis Eliminando dentro THP-1 As células. (A) Representação gráfica da luminescência médio lendo (em unidades de luminescência relativa) para cada tratamento (rifampicina) concentração. As barras de erro indicam o erro padrão da média para cada triplicado. (B) O gráfico da redução percentual calculado em luminescência provocada por um tratamento de rifampicina, em que valores mais elevados indicam uma maior eficácia. A concentração inibidora de 90% (IC 90), neste caso, situa-se entre 0,01 e 0,1 ug / mL.nk "> Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Os dados representativos a partir de um ensaio de citotoxicidade (MTT) para examinar os efeitos tóxicos do composto no G1-1H Diferenciadas As células THP-1. Gráfico da "percentagem de controlo" valores calculados para cada concentração do composto de tratamento G1-1H, onde os valores mais elevados indicam células saudáveis ​​THP-1. O IC 50 neste caso se situa entre 10 e 30? M. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Os dados representativos a partir de uma Resazurina Ensaio para examinar o EFICÁCIA de AMP na inibição da M. tuberculosis em caldo. Somente os dados recolhidos qualitativa é nesse caso devido a limitações do equipamento do 3 (BSL3) laboratório nível de segurança biológica. A fotografia mostra parte de uma placa de 96 poços contendo M. tuberculosis tratados com DMSO ou de quantidades variáveis de apramicina. Os poços tratados com DMSO exibiu uma conversão de resazurina a resorufina, como indicado pela conversão de cor de azul para rosa. As amostras tratadas com apramicina foram submetidos claramente a conversão de cor abaixo de 5 ug / mL. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Os dados em bruto a partir do ensaio de luciferase para a determinação do IC90 intracelular de rifampicina.

Tabela 2: dados brutos do Ensaio MTT para a Determinação da Citotoxicidade do Composto de Teste em G1-1H DiffereConcentrações nt.

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes para este trabalho.