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Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular

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DOI:

10.3791/55273

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5 de abril de 2017

 , 
1Department of Medicine, University of British Columbia

Neste artigo

Resumo

Nós desenvolvemos um sistema de rastreio de alto rendimento modular para descobrir novos compostos contra o Mycobacterium tuberculosis, direccionamento intracelular e em caldo de crescimento de bactérias, bem como a citotoxicidade contra a célula hospedeira de mamífero.

Resumo

Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose (TB), é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Com o aumento da disseminação da TB multirresistente (TB-MDR), há uma urgência real de desenvolver novas estratégias terapêuticas contra infecções por M. tuberculosis. Tradicionalmente, os compostos são avaliados com base em sua atividade antibacteriana em condições de crescimento in vitro em caldo; no entanto, os resultados são frequentemente enganosos para patógenos intracelulares como M. tuberculosis, uma vez que as condições de triagem fenotípica em caldo são significativamente diferentes das condições reais da doença no corpo humano. A triagem de inibidores que atuam dentro de macrófagos tem sido tradicionalmente difícil devido à complexidade, variabilidade na infecção e lenta taxa de replicação de M. tuberculosis. Neste estudo, relatamos uma nova abordagem para avaliar rapidamente a eficácia dos compostos na viabilidade de M. tuberculosis em um modelo de infecção por macrófagos. Usando uma combinação de um ensaio de citotoxicidade e um ensaio de viabilidade de M. tuberculosis em caldo, fomos capazes de criar um sistema de triagem que gera uma análise abrangente dos compostos de interesse. Este sistema é capaz de produzir dados quantitativos a um baixo custo que está ao alcance da maioria dos laboratórios e, no entanto, é altamente escalável para se adequar a grandes ambientes industriais.

Introdução

Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose (TB), é uma das principais causas de morbilidade e mortalidade em todo o mundo. TB sensível a drogas é uma doença tratável que requer múltiplos antibióticos durante um período de 6 meses. Apesar de ser uma doença tratável da taxa de mortalidade foi estimada em 1,5 milhões em 2015 um. Nos últimos 10 anos, tem vindo a aumentar as preocupações com a prevalência de fármaco-resistentes de M. tuberculosis. Multirresistente tuberculose (TB-MR) é definida como a tuberculose que é resistente a pelo menos isoniazida (INH) e Rifampicina (RMP), e a maioria das estirpes de MDR-TB são também resistentes para seleccionar fármacos para a tuberculose de segunda linha, o que limita as opções de tratamento . Os efeitos da resistência à droga criar um maior desafio para o tratamento de pacientes co-infectados com o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV); 400.000 doentes em todo o mundo morreu de tuberculose associada ao HIV em 2015 um. Lamentavelmente, os Estados Unidos Food and Drug Administração aprovou apenas uma nova droga TB contra a MDR-TB, bedaquilina, nos últimos 40 anos 2. Avanços em encontrar melhores e mais curtas terapias de tuberculose são urgentemente necessários, a fim de permanecer à frente na luta contra a TB e MDR-TB.

Tradicionalmente, as telas de drogas de TB são realizadas sob condições de crescimento in vitro em meio de crescimento, através do qual os compostos são adicionados a uma cultura em crescimento e a sua eficácia na erradicação dos microrganismos são determinadas pela contagem de unidades formadoras de colónias (CFU) em meio sólido. Como contagens de UFC é trabalho intensivo, demorado, e caro, vários métodos indiretos foram desenvolvidos para aliviar este problema. Tais métodos incluem o ensaio de viabilidade Alamar Blue 3, a determinação da fluorescência a partir de 4 proteína verde fluorescente (GFP) ou luminescência 5 a partir de bactérias que expressam luciferase, e a estimativa do trifosfato de adenosina total de (ATP) 6, 7.

TB típica é caracterizada por uma infecção de M. tuberculosis do pulmão, onde residem as bactérias e replicar no interior das fagossomas de macrófagos alveolares 8. A tela fenotípica simples no caldo pode atender patógenos extracelulares; no entanto, na perspectiva histórica, bateu compostos contra M. tuberculosis identificados usando este método muitas vezes não conseguem corresponder às expectativas durante as etapas de validação de transformação em modelos de infecção. Propomos que a droga TB é melhor executada em um modelo de infecção da célula hospedeira intracelular. No entanto, os modelos intracelulares possuem muitos obstáculos tecnológicos e biológicos para triagem (HTS) desenvolvimento de alto rendimento. Um grande obstáculo é a complexidade do processo de infecção, exemplificado por numerosos passos e a remoção de bactérias extracelulares elaborada por no meio de lavagem. Um segundo grande obstáculo é o longo tempo de requirements, como a detecção de crescimento, normalmente feito por contagem de CFU nas placas de cultura, é um processo que demora mais de 3 semanas para completar. Uma solução para substituir contagens de UFC foi fornecida por microscopia fluorescente automatizada em combinação com bactérias fluorescentes. No entanto, esta solução requer um investimento inicial equipamento que está fora do alcance de muitos laboratórios de pesquisa. Uma simples, de baixo custo, e método HTS doença relevante aumentaria grandemente o processo de descoberta de drogas.

Neste estudo, são descritos um novo sistema de HTS, modular que visa proporcionar uma rápida e altamente flexível, mas económica, ensaio adequado para a determinação da actividade de compostos contra intracelular de M. tuberculosis. Este sistema é composto por três módulos: (i) intracelular, (ii) da citotoxicidade, e (iii) Ensaios in-caldo. O resultado final combinada fornece uma descrição detalhada das propriedades do composto, com a informação adicional quanto ao modo de potencial de acção. este screening sistema tem sido utilizado em vários projectos com várias bibliotecas de compostos, o modo de acção que têm como alvo, incluindo a análise de sinergia droga 9, a estimulação de autofagia 10, e a inibição de M. tuberculosis -secreted factor de virulcia (não publicado). Os compostos de modo desconhecido de ação também foram estudados 11. Uma versão modificada deste método foi também adoptada pelo nosso parceiro industrial como o método de rastreio primário de identificar novos compostos contra intracelular de M. tuberculosis 11.

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Protocolo

1. Estirpe bacteriana e Meio de Crescimento

  1. Adicione de dextrose e albumina de solução de estoque de sal (ADS) por solubilização de 25 g de albumina de soro bovino, 10,0 g de dextrose, e 4,05 g de cloreto de sódio em 460 mL de água desionizada. Filtro-esterilizar a ADS e armazenar a 4 ° C.
  2. Adicione 7H9 pela adição de 4,7 g de 7H9 em pó e 2 ml de glicerol a 900 mL de água purificada. Autoclave o 7H9 a 121 ° C durante 10 min e permita que arrefeça para a temperatura ambiente antes de continuar. Adicione 7H9ADST por adição de 100 mL de ADS e 0,5 ml de Tween 80 a 900 mL de caldo 7H9. Armazenar a 4 ° C.
  3. Pesar 50 mg de sulfato de canamicina e dissolver em 1 ml de água desionizada; a concentração final é de 50 mg / mL. Filtro-esterilizar e armazenar a -20 ° C. Adicionar 0,5 mL de canamicina solução estoque por 1 L de 7H9ADST.
    NOTA: Este meio deve ser feita, de modo dimensionar os volumes apropriadamente de acordo com o tamanho da cultura.
  4. Crescer M. tuberculosis em 7H9ADST suplementado com canamicina em pé cultura. Agite a cultura diariamente e dilui-lo antes da DO600 atinge 1,0 para evitar aglomeração.
    NOTA: A estirpe de M. tuberculosis utilizado para o desenvolvimento deste método foi H37Rv transformada com o plasmídeo pJAK2.A 12. pJAK2.A é um plasmídeo integrativo baseado no vector pMV361, que permite a expressão de alto nível do gene luciferase de pirilampo do promotor hsp60 e pode ser seleccionado utilizando canamicina.

2. THP-1 e Meio de Manutenção

  1. Adicionar 50 mL de soro inactivado por calor de bovino fetal (FBS) e 5 mL de 200 mM de L-glutamina e 500 mL de meio RPMI 1640 para fazer meio RPMI incompleta (cerca de 10% de FBS e glutamina 2 mM).
  2. Manter uma cultura de células THP-1 de acordo com o protocolo padrão 13. Resumidamente, crescer as células THP-1 em meio RPMI incompleta mantendo ao mesmo tempo uma densidade celular de 0,2 a 1 milhão por ml de meio entre passábios.

3. Apresentação de intracelular de alto rendimento usando-expressar luciferase M. tuberculosis H37Rv

  1. Medir a densidade óptica de uma suspensão de bactérias em crescimento activo num espectrofotómetro a um comprimento de onda de 600 nm. Calcular a densidade bacteriana utilizando o factor de conversão de 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 de bactérias por ml.
  2. Pipetar as bactérias suficientes para uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10: 1 para um novo tubo de centrífuga. Sedimentar a 3000 xg durante 10 min e aspirar o líquido. Adicionar 50 ul de soro humano a 450 uL de RPMI 1640. Dimensionar o volume de se apropriar valores para a experiência.
  3. Para opsonizar as bactérias, ressuspender o sedimento a uma densidade de 1 x 10 8 de bactérias por 500 ul de RPMI1640 contendo 10% de soro humano. Deixar a mistura a incubar a 37 ° C durante 30 min. Determinar a densidade da cultura de células THP-1 por contagem com um hemocitómetro e um microsco invertidoPE.
  4. Sedimentar as células em tubos de centrífuga estéreis, a 100 x g e 37 ° C durante 10 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em meio RPMI incompleta a uma densidade de 1 milh de culas por mL. Adicionar forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) para uma concentração final de 40 ng / mL.
    NOTA: Este será referido como o mix diferenciação.
  5. Combinar opsonizado de M. tuberculosis com THP-1 mistura de diferenciação, a uma MOI de 10: 1 e alíquotas da mistura final em 100 ul por cavidade em uma placa branca de 96 pos de fundo plano. Regularmente agita-se a mistura para assegurar a uniformidade. Permitir que a diferenciação e a infecção prosseguir durante a noite a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO 2.
  6. Lavam-se os poços duas vezes com 100 uL de meio RPMI cada. Adicionar compostos diluídos para as concentrações desejadas em RPMI incompleta e incubar durante 3 dias.
  7. Aspirar o meio das cavidades. Adicionar 50 uL de reagente de ensaio de luciferase para cada cavidade. Selar as placas com transparent selantes de placas adesivas. Permitir 5 min de incubação a 22 ° C e, em seguida, obter uma leitura num luminómetro em 1 s por poço.

4. Análise de Citotoxicidade Usando um grupo 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) 14

  1. Diferenciar células THP-1 em meio RPMI incompleto suplementado com 40 ng / ml de PMA, em placas de 96 poços claras. Manter uma densidade celular de 1 milhão por ml e alíquota de 100 uL por poço. Permitir diferenciação prosseguir durante a noite a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO 2.
  2. Aspirar o meio dos poços e lava-se duas vezes com RPMI 1640. Adicionar compostos diluídos em RPMI incompletos para os poços. Incuba-se durante 3 dias.
  3. Dissolve-se 0,5 g de MTT em 100 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para produzir uma solução stock de 5 mg / mL. Filtrar em condições estéreis e armazenar a -20 ° C, ao abrigo da luz; é melhor fazer esta solução fresca.
  4. 2,5 horas antes da suae o fim do período de incubação de 3 dias, adicionar 25 ul de solução de MTT a cada poço e completar o período de incubação.
  5. Prepare a 50% de N, N-dimetil formamida (DMF) por mistura de 250 mL de DMF com 250 mL de água desionizada.
  6. Preparar tampão de extracção de MTT como se segue: Pesar 100 g de SDS em um frasco de 500 ml e adicionam-se 300 mL de 50% de DMF. Aplicar fogo baixo para permitir que o SDS para dissolver. Adicionam-se 10 mL de ácido acético puro e 12,5 mL de HCl 1M. Encha até à marca de 500 mL com 50% de DMF; a composição final do tampão de extracção é de 50% de DMF, 20% de SDS, ácido acético a 2,5%, e 2,5% de ácido clorídrico 1 M.
  7. No final do período de tratamento, adiciona-se 100 uL de tampão de extracção (aquecida a 45 ° C para dissolver todos os cristais) para cada poço. Deixar a mistura a incubar durante a noite a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO 2. Leia a absorvância a 570 nm.
    NOTA: O ensaio de citotoxicidade é melhor realizado em paralelo com um intracelulartela ular usando mesmo lote e idade das células THP-1.

5. No caldo Análise Atividade Usando um resazurina Ensaio 3

  1. Crescer M. tuberculosis em 7H9ADST à fase mid-log (~ 0,5-0,8 OD 600). Dilui-se a cultura com a 7H9ADST a 0,01 OD600. Dilui-se os compostos em 7H9ADST 2x as concentrações de teste e alíquota de 100 ul de cada composto diluída para cada poço.
  2. Transferir 100 ul da suspensão bacteriana diluída para cada poço. Permitir que as placas a incubar a 37 ° C num incubador humidif içado, durante 5 dias. Dissolve-se 10 mg de resazurina em 100 ml de água desionizada e o filtro esterilizado.
  3. Adicionar 30 mL de solução de resazurina e controlar a mudança de cor após 48 h; o crescimento bacteriano é indicado por uma conversão de cor de azul para rosa.
    NOTA: A análise quantitativa também pode ser realizada medindo quer a fluorescência a 590 nm com excitação a 530-560nm ou a absorvência a 570 nm e 600 nm de 15.

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Resultados

Rastreio intracelular de alto rendimento usando M. tuberculosis expressando o gene da luciferase

A Figura 2A e na Tabela 1 contém os dados brutos recolhidos pelo luminómetro, expressa em unidades luminescentes relativas (RLU), mostrando o efeito de uma concentração crescente da droga rifampicina em M. tuberculosis TB no interior das células THP-1. A Figura 2A é ...

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Discussão

O objetivo deste estudo foi o de criar um método HTS simples e de baixo custo utilizando um modelo de infecção intracelular humano para o M. tuberculosis. A tuberculose é uma doença humana caracterizado pela infecção de macrófagos alveolares por M. tuberculosis. Devido a questões de biossegurança, pesquisa envolvendo modelos biológicos, tanto da bactéria e as células hospedeiras tem sido usado no passado. No entanto, foi demonstrado que o uso de bactérias substitutos e modelos não-humanos são pobres pr...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes para este trabalho.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela BC Lung Association e Mitacs.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RPMI 1640Sigma-AldrichR5886
L-glutaminaSigma-AldrichG7513
Soro fetal bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific12483020
Middlebrook 7H9Becton, Dickinson and Company271210
Tween80Fisher ScientificT164
Albumina, Bovino pH7Affymetrix10857
DextroseFisher ScientificBP350
Cloreto de SódioFisher ScientificBP358
sulfato de canamicinaFisher ScientificBP906
PMASigma-AldrichP8139
MTT Sigma-AldrichM2128
N,N- Dimetilformamida (DMF)Fisher ScientificD131
1 M Ácido hidroclorídrico (HCl)Fisher Scientific351279212
Ácido acéticoFisher Scientific351269
SDSFisher ScientificBP166
ResazurinAlfa AesarB21187
DMSOSigma-AldrichD5879
GlicerolFisher ScientificBP229
THP-1Type Culture CollectionTIB-202
M. tuberculosis H37Rv
Placa branca de fundo plano de 96 poçosCorning3917
Placa transparente de fundo plano de 95 poçosCorning3595
Selador de placa transparenteEspectrofotômetro Thermo Fisher ScientificAB-0580
Thermo Fisher ScientificBiomate 3
Microplate espectrofotômetroBiotekEpoch
luminômetro Applied BiosystemsTropix TR717
American

Referências

  1. WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
  2. USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
  3. Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
  4. Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
  5. Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
  6. Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
  7. Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57(2010).
  8. Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
  9. Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
  10. Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691(2012).
  11. Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
  12. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
  13. ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016).
  14. Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
  15. Invitrogen. AlamarBlue assay. , Invitrogen. (2008).
  16. Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
  17. Riss, T. L., et al. Cell Viability Assays. , (2004).
  18. Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
  19. Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
  20. Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
  21. Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
  22. Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
  23. Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).
  24. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960(2014).
  25. Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
  26. Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777(2010).
  27. Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114(2014).
  28. Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645(2009).
  29. Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).

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