Os métodos para a auto-integração da Megamolecular Biopolímeros na secagem ao ar-LC interface

Resumo

Um método para a secagem induzida por auto-integração de biopolímeros megamolecular na interface ar-líquido cristalino é fornecida aqui. Esta metodologia será útil não só para a compreensão dos potenciais macroscópicas de biopolímeros, mas também como um método de avaliação para materiais macios em campos biomédicos e ambientais.

Resumo

Os organismos vivos que usam a água está sempre propenso a secar no meio ambiente. As suas actividades são accionados por micro-com base de biopolímero e macro-estruturas, como pode ser visto nos casos de água em movimento em feixes vasculares e hidratação de água nas camadas da pele. Neste estudo, foi desenvolvido um método para avaliar o efeito das soluções aquosas líquidas cristalinas (LC) compostas de biopolímeros sobre secagem. Como biopolímeros de LC peso megamolecular, escolhemos estudar polissacarídeos, proteínas do citoesqueleto, e ADN. A observação de soluções de biopolímeros durante a secagem sob luz polarizada revela auto-integração milliscale começando a partir da interface ar-LC instável. A dinâmica das soluções aquosas de biopolímero LC pode ser monitorizada por evaporação de água a partir de uma célula de um lado aberto. Ao analisar as imagens tiradas usando a luz cross-polarizado, é possível reconhecer as mudanças espaço-temporais no parâmetro ordem de orientação. estemétodo pode ser útil para a caracterização de materiais artificiais, não só em vários campos, mas também tecidos vivos naturais. Nós acreditamos que ele irá fornecer um método de avaliação para materiais macios nas áreas biomédicas e ambientais.

Introdução

Ao concentrar-se nas estruturas rígidas, em forma de bastonete de biopolímeros, materiais macios dinâmicas têm sido usados para várias aplicações, incluindo matrizes de polissacárido biofilme ^1, "geles" activas compostas de proteínas do citoesqueleto ^2, e "origami de DNA" de ³ formas desejadas. Para esclarecer as propriedades estruturais, muitas estratégias têm sido exploradas, como a microscopia eletrônica de transmissão, microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica e microscopia de fluorescência confocal. No entanto, porque esses métodos são em sua maioria realizados em um estado seco ou estática, é difícil de explicar os comportamentos dinâmicos em escalas macroscópicas, como visto em sistemas vivos reais. Recentemente, observou-se com êxito o comportamento dinâmico de biopolímeros na interface ar-aquoso LC através da luz polarizada ^4. Durante a visualização da estrutura orientada durante a secagem do biopolimerosolução, as alterações temporais indicados auto-integração de biopolímeros na interface ar-LC instável.

Aqui, descrevemos um protocolo para a secagem de soluções LC biopolímeros na interface ar-LC utilizando instrumentos polarizadas. Ao contrário de outras análises da fase LC que não consideram secagem ^{5, 6,} a dinâmica de LC durante o processo de secagem foram investigados aqui, avaliando o parâmetro de orientação ordem na vista lateral da fase de fluido de uma célula de um lado aberto . A combinação da evaporação de células e o uso de instrumentos polarizados permitidos para monitorização macroscópico com uma direcção de evaporação controlada. Além disso, foi possível para validar os registos de secagem, concentrando-se nas estruturas cristalinas de microdomínios adsorvidas, que foram afectados pelo peso molecular, concentração, etc. Para demonstrar a eficácia do método, a pró secagemcessos de biopolímeros básicos com formas em vareta rígida tais como, polissacáridos, os microtúbulos (MTS), e ADN, foram investigados. Escolhemos estes biopolímeros porque eles são exemplos típicos de macromoléculas hierárquicos com pesos megamolecular, e as suas interacções intermoleculares lhes permitir formar estados de LC.

Protocolo

1. Instrumentos

1. dispositivo de polarização
   1. Para construir um dispositivo de polarização, proporcionar uma fonte de luz com uma lâmpada de halogéneo, um guia de luz, polarizadores, um estágio da amostra, um trilho óptico, haste está, e uma câmara digital de lente única reflexo (ver Figura 1C e Materiais Lista para a polarização peças do dispositivo).

2. Preparação da Solução Biopolymer

1. soluções de polissacarídeos
   1. Dissolver sacran ⁷ (0,5 g) em água pura (100 ml) por agitação a ~ 80 ° C durante mais de 12 h. Durante a dissolução, cobrir o recipiente com película de plástico para evitar a evaporação. Prepara-se uma solução aquosa de goma de xantano da mesma maneira.
   2. Arrefecer as soluções a ~ 25 ° C para se obter soluções aquosas a 0,5% em peso.
   3. Centrifugar a solução para remover impurezas sacran (48400 xg, 4 ° C, 1 h, 3 times).
2. solução MT
   1. Prepara-se uma solução de tubulina de 0,5% em peso (1 ml) em um tampão de Britton-Robinson (80 mM de piperazina-N, N'-bis (ácido 2-etanossulfónico) (PIPES), etileno glicol-bis (éter 1 mM β-aminoetil) - N, N, N 'N' tetraacico (EGTA); e 5 mM _{de MgCl2,} pH 6,8) em gelo ^8.
   2. Use solução tubulina 0,5% em peso (50 mL) e a guanosina-5' - [(α, β) -methyleno] trifosfato (GpCpp) (5 mL) para preparar uma solução de tubulina GpCpp contendo (50 mL). Incubar a 37 ° C durante 3 h para se obter um núcleo estável MT.
      NOTA: O papel do GpCpp é apoiar a formação de MT e para suprimir completamente a despolimerização de MT para tubulina.
   3. Misturar a solução de 0,5% em peso de tubulina (950 mL) e a solução tubulina GpCpp contendo (50 mL) a ~ 25 ° C durante um dia para se obter uma solução estável MT de 0,5% em peso.
3. solução de ADN
   1. Prepara-se uma solução de ADN de 0,5% em peso (1 ml) em solução tampão de Tris-EDTA (Tris 10 mM, pH 8,0, com EDTA 1 mM).
4. Manter as soluções de amostra biopolímero 0,5% em peso a 25 ° C durante a experiência de secagem.

3. Experiências de secagem e Observação sob luz Cross-polarizada

1. Soluções em uma célula de um lado aberto (Figura 1A)
   1. Cortar uma folha de silício (ver Lista de Materiais) em uma forma apropriada com uma espessura de 1 mm (dimensão interna de 5-15 mm, de 1 mm, e ~ 20 mm; Figura 1A).
      1. Montar uma célula de um lado aberto composto por um espaçador de silício com dimensão interna de 5-15 mm, de 1 mm, e ~ 20 mm e duas lâminas de vidro não-modificada (76 mm × 1 mm × 26 mm). Fixar ambos os lados da célula com os grampos duplos com antecedência para manter a solução de amostra de vazar para fora.
   2. Lentamente adicionar cada da solução do biopolímero 0,5% em peso (100-300 uL) utilizando uma pipeta de 1 mm de tamanho de poro de ~te ponta para cada célula a ~ 25 ° C. Retirar as bolhas de ar a partir das culas utilizando uma agulha de seringa.
   3. Colocar as células em um forno com um circulador de ar a 60 ° C sob pressão atmosférica durante a evaporação; a direcção evaporação é oposto ao da gravidade.
2. Observações sob luz polarizada cruzada (Figura 1B-1C)
   1. Fornecer luz linear visível através de uma lâmpada de halogéneo de 100 W com uma fonte de luz de superfície plana sobre uma vasta área (80 mm x 80 mm). Ajustar os polarizadores para 45 ° e 135 °, utilizando os detentores (Figura 1C).
   2. Fixar as posições da fonte de luz, polarizadores, estágio da amostra, e a câmara utilizando um trilho óptico e bancadas haste (Figura 1C). Coloque a fase de amostra entre os dois polarizadores (a distância entre os polarizadores deve ser ~ 5 centímetros). Coloque a câmara ~ 20 cm de altura a partir da fase da amostra para permitir focar.
   3. Em determinados momentos, colocar as amostras a partir do passo 3.1.3 entre a polarizers na fase paralela ao plano xz e cobrir o dispositivo com uma cortina preta; o próprio dispositivo é mostrado na Figura 1C.
   4. Fotografar as amostras através de polarizadores lineares cruzou usando uma câmera digital reflex de lente única com uma lente de zoom standard (ver Lista de Materiais). Controlar as configurações da câmera, como a distância focal, utilizando software de computador (ver Lista de Materiais).
3. Análise espácio-temporal da intensidade da luz transmitida (Figura 1C)
   1. Para avaliar a mudança do parâmetro de orientação ordem no processo de secagem, recolha fotografias de hora em hora, durante 24 h.
   2. Medir a intensidade da luz transmitida ao longo do eixo na direcção Z como um valor de cinzento, utilizando um programa de processamento de imagem (por exemplo, ImageJ).
   3. Traçar um gráfico do valor de cinza como uma função da distância a partir do lado superior aberto.
4. Observações microscópicas sob ligh polarizado-cruzt (Figura 1D)
   1. Para verificar os métodos, fazer observações microscópicas com um microscópio de polarização equipado com uma câmara CCD ^9. Mantenha uma placa retardo de primeira ordem no caminho da luz. Controlar as condições para as fotos usando um software de PC.

Resultados

Utilizando o dispositivo, como mostrado na Figura 1, o auto-integração de microdomínio para macrodomain sobre uma secagem interface ar-LC foi avaliada (Figura 2A). Como a primeira demonstração da experiência de secagem, dois tipos de polissacáridos, megamolecular sacran (M _w = 1,9 x 10 ⁷ g ^mol-1) e goma de xantano (4,7 x 10 ⁶ g ^mol-1), foram comparados. A Figura 2B mostra fo...

Discussão

Às vezes era difícil para a câmara focar a amostra devido à intensidade de luz transmitida ser demasiado baixo. Nesses casos, colocar um filme plástico transparente estendida no palco ajudou a organizar o foco. A limitação da resolução observável era dependente da lente da câmara, ~ 10 um, neste caso. A limitação observável da espessura da amostra, Ay, era dependente da intensidade de luz máxima da lâmpada, ~ 10 mm neste caso.

A vantagem do dispositivo mostrado na Figura 1B ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
sacran	Green Science Materials Inc., Japão		De Aphanothece sacrum. Mw = 1,9 × 107 g mol-1
xanthan goma	Taiyo Kagaku Co., Japão	Neosoft XC	De Xanthomonas campestris. Mw = 4,7 × 106 g mol-1
tubulina	Citoesqueleto, Inc., EUA	T240	Do cérebro suíno.
GpCpp	Jena Bioscience, Alemanha	NU405L
piperazina-N,N′ -bis(ácido 2-etanossulfônico)	Sigma-Aldrichi, Co. LLC.	P6757-500G	TUBOS
etilenoglicol-bis(β-éter aminoetílico)-N,N,N',N'-tetraacético	ácido Dojindo Molecular Technologies, Inc.	342-01314	EGTA
MgCl2-6H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	135-15055
KOH	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	162-21813	pellet
DNA	Sigma-Aldrich, Co. LLC.	D1626	De testes de salmão. Mw = 1,3 &vezes; 106 Da (~2.000 pb)
Solução tampão Tris-EDTA	Sigma-Aldrich, Co. LLC.	T9285-100ML	10 mM Tris, pH 8,0, com vidro deslizante EDTA de 1 mM
	Matsunami Glass Ind., Ltd., Japão	S1111
	Asone Co.	6-611-32	Espessura:
centrífuga	Beckman-Coulter, Inc., EUA	Avanti J-25	equipada com uma fonte de luz de rotor JA-20
	Sumita Optical Glass, Inc., Japão	Guia de luz LS-LHA
	Sumita Optical Glass, Inc., Japão	GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)	80 mm e vezes;
lâmpada halógena	Ushio Inc., Japão	JCR 15V150WBN
titular	Sigmakoki, Co., Ltd.	Estágio de amostra KMH-80
	Sigmakoki, Co., Ltd.	Suporte de amostra TARW-25503L
	Sigmakoki, Co., Ltd.	Haste SHA-25RO
	Sigmakoki, Co., Ltd.	Porta-postes ROU-12-40
	Sigmakoki, Co., Ltd.	Porta-postes RS-6-40
	Sigmakoki, Co., Ltd.	RS-12-60
postes titular	Sigmakoki, Co., Ltd.	RS-12-80
postes titular	Sigmakoki, Co., Ltd.	Portadora RS-12-130
	Sigmakoki, Co., Ltd.	Suporte de câmera CAA-25LS
	Sigmakoki, Co.,Ltd.	CMH-2
	Sigmakoki, Co.,Ltd.	Tubo de lente OBA-500SH
	Tomytech, tubo	lente BORG BK	80φ, L25 mm
tubo de lente	Tomytech, tubo	lente BORG BK	80φ, L50 mm
	multibanda Tomytech, BORG		80φ
Placa em V	Tomytech, BORG	em V 60S
	Viexen, Co.,Ltd.	suporte para prato SX
EOS Kiss X7i	Canon Inc., Japão	8594B001	com uma lente zoom padrão,  EFP 18-55 mm
software fotográfico	Canon Inc., Japão	EOS Utility
PC	Microsoft	Microscópio
	Olympus	BX51
placa de retardo de primeira ordem	Olympus	U-TP530	λ = 530 nm
CCD câmera	Olympus	DP80
software fotográfico	Olympus	cellSens Programa
	do National Institutes of Health	ImageJ