Análises celular linhagem e estudos da função de genes utilizando marcm Twin-ponto

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica de marcação de mosaico que permite a visualização dos neurónios derivados de uma célula progenitora comum em duas cores distintas. Isso facilita a análise de linhagem neural com a capacidade de neurônios individuais-datando de nascimento e função do gene estudar nos mesmos neurônios de diferentes indivíduos.

Resumo

M osaic uma nálise com um r epressible c ell m arker (marcm) é um sistema de rotulagem mosaico positivo que tem sido amplamente aplicado em estudos neurobiológicos Drosophila para descrever morfologias intrincadas e de manipular a função de genes em subconjuntos de neurônios dentro de outra forma não marcado e imperturbável organismos. mosaicos genéticos gerados no sistema marcm são mediadas através de recombinação específica do local entre os cromossomas homólogos dentro de divisão de células precursoras para produzir ambos os clones (marcm) marcados e não marcados células filhas durante a mitose. Uma extensão do método marcm, chamado duplo-spot marcm (tsMARCM), etiquetas, tanto das células individuais derivadas de um antepassado comum com duas cores distintas. Esta técnica foi desenvolvida para permitir a recuperação da informação útil a partir de ambos os hemi-linhagens. Por abrangente análise de diferentes pares de clones tsMARCM, o sistema permite tsMARCM de alta resolução mappin linhagem neuralg para revelar o nascimento-ordem exacta dos neurónios marcados produzidos a partir de células progenitoras comuns. Além disso, o sistema também se estende tsMARCM estudos de função do gene, permitindo a análise fenotípica de neurónios idênticas de diferentes animais. Aqui, descrevemos como aplicar o sistema tsMARCM para facilitar estudos sobre o desenvolvimento neural em Drosophila.

Introdução

O cérebro, composta por um vasto número e diversos tipos de neurônios, dota animais com a capacidade de perceber, processar e responder aos desafios do mundo externo. Os neurónios do adulto de Drosophila cérebro central são derivados a partir de um número limitado de células estaminais neurais, chamados neuroblastos (RN), durante o desenvolvimento ^{1, 2.} A maioria dos RN participando de neurogênese cerebral em Drosophila sofrem divisão assimétrica para gerar RN auto-renovação e células-mãe gânglio (GMCS), e os GMCs seguida, passar por outra rodada de divisão para produzir duas células-filhas ....

Protocolo

1. Construir tsMARCM pronto Flies Usando o Requerido transgenes ^{11, 13}

1. Gerar a versão original de moscas tsMARCM-prontos de transgenes que são transportadas por moscas individuais ¹¹ (ver Tabela 1). Realizar esquemas de passagem padrão mosca genéticos, que foram descritas anteriormente, colocando vários transgenes nas mesmas populações de moscas ^13.
   1. Em uma linha progenitora, montar os transgenes de FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (o primeiro repórter, mCD8 :: GFP; a expressão do transgene está sob o cont....

Resultados

O sistema tsMARCM tem sido usado para facilitar a linhagem neural análises e estudos da função gênica por recuperar informações importantes sobre os neurônios derivados do RN comuns. O sistema tem sido utilizado para identificar a maioria (se não todos) os tipos neuronais, determinar o número de células de cada tipo neuronal, e determinar a ordem de nascimento desses neurônios ^{11, 12, 18} (ver a .......

Discussão

Passos críticos dentro do Protocolo

Passos 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, e 3.2 são críticos para a obtenção de bons resultados tsMARCM. Condutores -GAL4 específicos de tecidos que não expressam GAL4 em progenitores neurais são preferidos para os passos 1.1.1 e 1.2.1. Evitar o excesso de aglomeração dos animais cultivadas em frascos fly-alimentares no passo 2.3. Porque a latência de indução, o nível de expressão de FLP após a choque térmico, e o tempo médio de divisão de progenitores neuronai.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dióxido de carbono (CO2)	Fornecedor local	n.a.Anestesiar	moscas
CO2 almofada	Fornecedor local	n.a.Classificar	, cruzar e transferir
moscas 10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (ou outros fornecedores)	PBS001	Dissecar, enxaguar, lavar e imunocorar cérebros de moscas
Formaldeído	Sigma-Aldrich	252549	Corrigir cérebros de moscas
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Enxágue, lave e imunomarque cérebros de moscas
Cabra normal	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Imunocoloração de cérebros de moscas soro
Rato anti-rato anticorpo CD8	Invitrogen	MCD0800	Imunocoloração de cérebros de moscas
Coelho anti-DsAnticorpo vermelho	Clonetech	632496	Imunocoloração de cérebros de moscas
Anticorpo anti-Brp de camundongo	Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma	nc82	Imunocoloração de cérebros de moscas
Anticorpo IgG anti-rato de cabra conjugado com Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Cérebros de moscas imunocorantes
Anticorpo IgG anti-coelho de cabra conjugado com Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Cérebros de moscas imunocorantes
Anticorpo IgG anti-rato de cabra conjugado com Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Cérebros de moscas imunocorantes
Reagente antidesbotamento de ouro SlowFade	Sondas moleculares	S36936	Monte cérebros de moscas e proteja a extinção de fluorescência
Placa de vidro de depressão PYREX 9	Corning	7220-85	Dissecar, enxaguar, lavar e imunomanchar cérebros de moscas
Kit de elastômero de silicone Sylgard 184	World Precision Instruments	SYLG184	Faça pratos Sylgard pretos para proteger o fórceps durante a dissecção cerebral
Carvão ativado	Sigma-Aldrich	242276-250G	Faça pratos Sylgard pretos
Dumont #5 fórceps	Fine Science Ferramentas	11252-30	Dissecar e montar cérebros de moscas
Micro slide	Corning	2948-75x25	Montar cérebros de mosca
Micro vidro de cobertura nº 1.5	VWR International	48366-205	Montar cérebros de mosca
Esmalte de unhas	Fornecedor local	não disponível	Selar micro vidro de cobertura em micro lâminas
Incubadora	LTI603	Kansin Instruments	voa a 25 ° C
(ou outros fornecedores)
Banho-maria	Kansin Instruments	WB212-B2	Induz choque térmico em moscas a 37 &graus; C
(ou outros fornecedores)
Agitador orbital	Kansin Instruments	OS701	Lavagem e imunocoloração de cérebros de moscas
(ou outros fornecedores)
Microscópio de dissecação	Leica	EZ4	Classificar, cruzar e transferir moscas; Dissecar, enxaguar, lavar e imunocolorir cérebros de moscas
Microscópio confocal	Zeiss (ou outros fornecedores)	LSM 700 (ou outros modelos)	Imagem tsMARCM clones
software de processamento de imagem 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	não disponível	Pilhas de projetos de imagens confocais
Software de processamento de imagem 2 (e.g., ImageJ)	não disponível	não disponível	Contar o número de células de clones tsMARCM

A cultura da