Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

Resumo

Os protocolos descritos aqui permitem o estudo das propriedades elétricas de células excitáveis nas condições fisiológicas mais não invasivas, empregando embriões de peixe-zebra em um sistema in vivo, juntamente com um indicador de voltagem geneticamente codificado (GEVI) baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) seletivamente expresso no tipo de célula de interesse.

Resumo

Os protocolos descritos aqui são projetados para permitir que os pesquisadores estudem a comunicação celular sem alterar a integridade do ambiente em que as células estão localizadas. Especificamente, eles foram desenvolvidos para analisar a atividade elétrica de células excitáveis, como os neurônios espinhais. Nesse cenário, é crucial preservar a integridade da célula espinhal, mas também é importante preservar a anatomia e a forma fisiológica dos sistemas envolvidos. De fato, a compreensão da maneira como o sistema nervoso - e outros sistemas complexos - funciona deve ser baseada em uma abordagem sistêmica. Por esse motivo, o embrião vivo de peixe-zebra foi escolhido como sistema modelo, e as alterações de voltagem da membrana do neurônio espinhal foram avaliadas sem interferir nas condições fisiológicas dos embriões.

Aqui, é descrita uma abordagem que combina o emprego de embriões de peixe-zebra com um biossensor baseado em FRET. Os embriões de peixe-zebra são caracterizados por um sistema nervoso muito simplificado e são particularmente adequados para aplicações de imagem graças à sua transparência, permitindo o emprego de indicadores de voltagem baseados em fluorescência na membrana plasmática durante o desenvolvimento do peixe-zebra. A sinergia entre esses dois componentes permite analisar a atividade elétrica das células em organismos vivos intactos, sem perturbar o estado fisiológico. Finalmente, essa abordagem não invasiva pode coexistir com outras análises (por exemplo, registros de movimento espontâneo, como mostrado aqui).

Introdução

A análise de componentes sistêmicos in vivo permite que os cientistas investigem o comportamento celular da maneira mais confiável. Isto é particularmente verdadeiro quando a atividade sob escrutínio é fortemente influenciada pelas interações célula-célula (dependentes de contato e não contato), como no sistema nervoso, onde as mudanças de tensão da membrana conduzem a comunicação entre células excitáveis. A compreensão das informações codificadas por esses sinais elétricos é a chave para entender o funcionamento do sistema nervoso em estados fisiológicos e de doenças.

Para estudar as propriedades elétricas das células n....

Protocolo

1. pHuC_Mermaid Plasmid Generation

NOTA: Mermaid é um biossensor desenvolvido emparelhando o domínio de detecção de tensão (VSD) do Ciona intestinalis (agora Ciona robusta ) ⁵ sensores de tensão contendo fosfatase (Ci-VSP) com os fluoróforos associados FRET Umi-Kinoko Green (mUKG: doador) e uma versão monomérica da proteína fluorescente emanada de laranja Kusabira Orange (mKOk: aceitadora). Para este biossensor, as mudanças conformacionais do domínio VSD, induzidas pela despolarização da membrana, aumentam a proximidade das proteínas fluorescentes doadoras e aceitadoras, aumentando assim ....

Resultados

Um vetor de expressão que transporta a sequência de codificação de biossensor Mermaid baseada em FRET sob o controle do promotor pan-neuronal pHuC, que conduz a síntese da proteína exclusivamente no sistema nervoso, foi entregue em ovos fertilizados de uma única célula por meio de uma microinjeção em Para obter embriões transgênicos transitórios ( Figura 1 , Painel esquerdo). Depois de dominar a técnica de microinjecção, a porcentagem de embriões posit.......

Discussão

O protocolo aqui apresentado permitiu explorar a associação entre as propriedades elétricas dos neurônios motores da coluna vertebral do embrião zebra eo comportamento espiral espiral, a atividade motriz estereotípica mais antiga, que aparece em torno de 17 hpf de desenvolvimento embrionário e dura até 24 hpf ¹⁰ .

Nossa abordagem fornece aos pesquisadores uma ferramenta para estudar o sistema neural de embriões intactos, preservando plenamente a complexidade das inter.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Baixo ponto de fusão Agarose	Sigma-Aldrich	A9414
DMSO	Sigma-Aldrich	W387520
Riluzol	Sigma-Aldrich	R116
Pfu Ultra HQ DNA polimerase	Agilent Technologies - Divisão de Produtos Stratagene	600389
T3 Primer universal	Sigma-Aldrich
Wizard SV Gel e PCR Clean-Up system	Promega	A9280
Universal SmaI primer	Sistema de
StrataClone / pCMV-SC vetor rombudo	Agilent Technologies - Divisão de Produtos Stratagene
SmaI	New England Biolabs	R0141S
T4 DNA ligase	Promega	M1801
SalI	New England Biolabs	R0138S
EcoRV	New England Biolabs	R0195S
35 mm, prato de imagem com fundo de vidro	Fórceps Ibidi	81151
	Sigma-Aldrich	F6521
Estereomicroscópio	Leica Microsystems	M10 F
Câmera digital	Leica Microsystems	DFC 310 FX
Leica Application Suite 4.7.1 software	Leica Microsystems
QuickTime Player, v10.4	Apple
Microscópio confocal (invertido)	Leica Microsystems	TCS SP5
Microinjetor	Eppendorf	Femtojet
ImageJ macro Biosensor_FRET
GraphPad Prism 6.0c	GraphPad Software, Inc

Vetor de Expressão de Mamíferos Eurofins 240228