Artigo de método

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

6.5K vistas

⸱

DOI:

10.3791/55297

⸱

26 de junho de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, Università degli Studi di Milano, 2Department of Neuroscience; Department of Cell Biology, Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, 3Program in Cellular Neuroscience, Neurodegeneration and Repair, Yale University School of Medicine, 4Department of BioSciences, Università degli Studi di Milano

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Os protocolos descritos aqui permitem o estudo das propriedades elétricas de células excitáveis nas condições fisiológicas mais não invasivas, empregando embriões de peixe-zebra em um sistema in vivo, juntamente com um indicador de voltagem geneticamente codificado (GEVI) baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) seletivamente expresso no tipo de célula de interesse.

Resumo

Os protocolos descritos aqui são projetados para permitir que os pesquisadores estudem a comunicação celular sem alterar a integridade do ambiente em que as células estão localizadas. Especificamente, eles foram desenvolvidos para analisar a atividade elétrica de células excitáveis, como os neurônios espinhais. Nesse cenário, é crucial preservar a integridade da célula espinhal, mas também é importante preservar a anatomia e a forma fisiológica dos sistemas envolvidos. De fato, a compreensão da maneira como o sistema nervoso - e outros sistemas complexos - funciona deve ser baseada em uma abordagem sistêmica. Por esse motivo, o embrião vivo de peixe-zebra foi escolhido como sistema modelo, e as alterações de voltagem da membrana do neurônio espinhal foram avaliadas sem interferir nas condições fisiológicas dos embriões.

Aqui, é descrita uma abordagem que combina o emprego de embriões de peixe-zebra com um biossensor baseado em FRET. Os embriões de peixe-zebra são caracterizados por um sistema nervoso muito simplificado e são particularmente adequados para aplicações de imagem graças à sua transparência, permitindo o emprego de indicadores de voltagem baseados em fluorescência na membrana plasmática durante o desenvolvimento do peixe-zebra. A sinergia entre esses dois componentes permite analisar a atividade elétrica das células em organismos vivos intactos, sem perturbar o estado fisiológico. Finalmente, essa abordagem não invasiva pode coexistir com outras análises (por exemplo, registros de movimento espontâneo, como mostrado aqui).

Introdução

A análise de componentes sistêmicos in vivo permite que os cientistas investigem o comportamento celular da maneira mais confiável. Isto é particularmente verdadeiro quando a atividade sob escrutínio é fortemente influenciada pelas interações célula-célula (dependentes de contato e não contato), como no sistema nervoso, onde as mudanças de tensão da membrana conduzem a comunicação entre células excitáveis. A compreensão das informações codificadas por esses sinais elétricos é a chave para entender o funcionamento do sistema nervoso em estados fisiológicos e de doenças.

Para estudar as propriedades elétricas das células nas condições fisiológicas mais não-invasivas, vários indicadores de voltagem codificados geneticamente foram desenvolvidos recentemente 1 . Ao contrário das gerações anteriores de sensores de tensão óptica (principalmente corantes sensíveis à voltagem) 2 , os GEVIs permitem análises in vivo do sistema neural intacto eSua expressão pode ser limitada a tipos ou populações específicas de células.

O embrião de peixe-zebra é o "substrato" in vivo de escolha para aproveitar o grande potencial atribuído aos GEVIs. De fato, graças à sua clareza óptica e seu sistema nervoso simplificado mas evolutivamente conservado, o modelo zebrafish permite a identificação e manipulação direta de cada componente celular em uma rede. De fato, o emprego da GEVI Mermaid 3 baseada em FRET levou à identificação de alterações pré-sintomáticas no comportamento do neurônio motor espinhal em um modelo de esclerose lateral amiotrófica (ALS) 4 .

O seguinte protocolo in vivo descreve como monitorar as propriedades elétricas dos neurônios motores da coluna vertebral em embriões de peixe-zebra intactos que expressam a Sereia de maneira específica neuronal. Além disso, demonstra como chan induzido farmacologicamenteEssas propriedades elétricas podem ser associadas a alterações na freqüência de bobinas espontâneas embrionárias, a atividade motriz estereotípica que caracteriza o comportamento do movimento do peixe zebra em estágios de desenvolvimento muito iniciais.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. pHuC_Mermaid Plasmid Generation

NOTA: Mermaid é um biossensor desenvolvido emparelhando o domínio de detecção de tensão (VSD) do Ciona intestinalis (agora Ciona robusta ) 5 sensores de tensão contendo fosfatase (Ci-VSP) com os fluoróforos associados FRET Umi-Kinoko Green (mUKG: doador) e uma versão monomérica da proteína fluorescente emanada de laranja Kusabira Orange (mKOk: aceitadora). Para este biossensor, as mudanças conformacionais do domínio VSD, induzidas pela despolarização da membrana, aumentam a proximidade das proteínas fluorescentes doadoras e aceitadoras, aumentando assim a transferência de energia entre elas (aumentando a relação FRET) 3 . O VSD assegura a localização eficiente do biossensor na membrana plasmática. A expressão neuronal do biossensor (na medula espinhal, o sinal é detectável em interneurônios e neurônios motores) é conseguida pela clonagem da Mermaid opNa estrutura de leitura (ORF) sob o promotor pan-neural zebrafish HuC 6 .

  1. Amplificar através da reação em cadeia da polimerase (PCR) a ORF da sereia a partir do plasmídeo de sementes pCS4 + 3 com polimerase de DNA de Pfu (revisão) utilizando o iniciador de DNA T3 e o iniciador Mermaid Sma I (5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) de modo a inserir um sítio de restrição Sma I a montante Da Sirena ORF.
    1. Utilize a seguinte mistura de PCR: 0,5 μL de polimerase de Pfu, 7,5 μL do tampão 10x específico, 1 μL de dNTP 10 mM, 2,5 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), 0,5 μL (50 ng) da preparação do plasmídeo e 1 ΜL de soluções de estoque de 20 μM de cada iniciador num volume total de 50 μL.
    2. Aqueça a mistura de PCR durante 15 s a 95 ° C, prima-a durante 15 s a 50 ° C e alonge-a durante 4 minutos a 72 ° C durante um total de 35 ciclos.
  2. Gel-purifique o espancamento específicoProduto de PCR utilizando um kit comercial de purificação de gel, seguindo o protocolo do fabricante.
  3. Clone o fragmento de DNA no vetor macio pCMV-SC seguindo o protocolo do fabricante.
  4. Linearize o plasmídeo positivo da Sereia (chamado pCMV-SC_Mermaid) com a enzima de restrição Sma I para a seguinte inserção do promotor HuC.
    1. Configure a reação de restrição como se segue: 0,5 μL (10 U) de enzima de restrição Sma I, 2 μL do kit 10x tampão e 5 μg de DNA plasmídico num volume total de 20 μL. Incubar a reacção a 25 ° C durante 1 h.
  5. Gel-purificar o plasmídeo digerido usando um kit comercial de purificação de gel seguindo o protocolo do fabricante.
  6. PCR-amplificar o promotor de HuC (pHuC), com polimerase de ADN de Pfu e DNA genômico de peixe-zebra como modelo, usando um par de primers específicos de HuC (HuCprom-forw1_SalI: 5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA e HuCproM-rev1: 5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) e abrangendo uma região de 3.150 pb a montante do ATG.
    1. Configure a mistura de PCR utilizando o seguinte esquema: 0,5 μL de polimerase de Pfu, 7,5 μL do tampão 10x específico, 1 μL de dNTP 10 mM, 2,5 μL de DMSO, 200 ng de ADN genómico e 1 μL de 20 μM Soluções de estoque de cada iniciador em um volume total de 50 μL.
    2. Após um passo inicial de 2 minutos a 95 ° C, aqueça a mistura de PCR durante 15 s a 95 ° C, prima-a durante 15 s a 50 ° C e alonge-a durante 4 min a 72 ° C durante um total de 35 ciclos .
  7. Gel-purifique o produto de PCR sem corte específico usando um kit comercial de purificação de gel seguindo o protocolo do fabricante.
  8. Ligar uma quantidade equimolar da pCMV-SC_Mermaid purificada (passo 1.5) e do ADN de pHuC (passo 1.7) utilizando 1 μL de ligase de ADN T4 e 1 μL do tampão específico 10X num volume total de 10 μL. Incube a reação por 16 h em4 ° C.
  9. Transforme uma alíquota de células competentes com 5 μL da reação de ligação (etapa 1.8) seguindo as instruções do fabricante.
  10. Selecione os clones pHuC-positivos (pHuC_Mermaid) com o promotor inserido na orientação apropriada por uma digestão dupla Sal I- Eco RV (o local de restrição Sal I foi inserido a montante do fragmento promotor no passo 1.6, enquanto o site de restrição Eco RV Está posicionado a jusante da região de poliadenilação, PolyA, do plasmídeo pCMV-SC).
    1. Configure a reação de restrição da seguinte maneira: 0,5 μL (10 U) das enzimas de restrição Sal I e Eco RV, 2 μL do tampão kit10X e 1 μg de DNA pHuC_Mermaid em um volume total de 20 μL. Incubar a reacção a 37 ° C durante 1 h. Execute as reações em um gel de agarose.

2. Microinjecção de embriões

  1. Transferir fertilizado, por exemplo,Gs obtidos de tipo selvagem (AB) ou peixe-zebra adulto Sod1-G93R 4 para uma placa de Petri de 10 mm usando uma pipeta de plástico.
  2. Enxaguar os embriões em água de peixe fria (4 ° C) e imediatamente microinjetá-los na gema com 200 pg de plasmídeo pHuC_Mermaid usando um microinjetor (para uma descrição geral e detalhada do procedimento de microinjeção, ver Referências 7 e 8).
  3. Usando uma pipeta de plástico, transfira os embriões para uma placa de Petri e incuba-os em água dos peixes a 28 ° C até atingir o estágio de desenvolvimento desejado (20-24 h pós-fertilização, hpf) para as seguintes análises.

3. Análise Espontânea de Coelagem

NOTA: Avalie o comportamento espontâneo do enrolamento da cauda em embriões de 20-24 hpf com ou sem a droga riluzol.

  1. Transfira um embrião para uma placa de Petri redonda de 90 mm, cheia de água de peixe contendo 0,2% de DMSO (veículo de riluzole) e remova-a manualmente usando doisPinça de joalheiro com pontas afiadas. Incubar o embrião durante 5 min.
  2. Detectar o enrolamento da cauda na RT durante uma gravação de vídeo de 1 min usando uma câmera digital montada em um estereomicroscópio. Adquira séries temporais em uma resolução de tempo de 30 quadros / s.
  3. Calcule a frequência das bobinas de cauda espontâneas contando o número de curvas (ambos contralateral e ipsilateral) por unidade de tempo.
  4. Para avaliar o efeito da droga riluzole, utilize com cuidado uma pipeta Pasteur de plástico para transferir o embrião para uma nova placa de Petri de 90 mm preenchida com água de peixe contendo 5 μM de riluzole.
    1. Incube o embrião durante 5 minutos antes de gravar um vídeo de 1 minuto e realizando a análise comportamental como acima.

4. Configuração de imagem para a Visualização de Biossens da Sereia em Embriões Vivos: Detecção Simultânea de Sinais do Doador e do Aceitador

  1. Monte os embriões de 20 a 24 hpf em 1% de agarose de baixo ponto de fusão em água de peixe em37 ° C dentro de um prato de imagem de fundo de vidro de 35 mm. Oriente os embriões em seus lados. Aguarde até que a agarose solidifique à temperatura ambiente.
  2. Transfira o prato de imagem para o estágio de um confocal invertido montado em um microscópio invertido. Identifique os neurônios motores que expressam o biossensor com um objetivo 20X (0,7 abertura numérica, NA) excitando o mUKG com a linha laser de argônio 488 nm e registrando sua emissão entre 495 e 525 nm.
  3. Para uma medição de FRET, excite mUKG, o doador do par de FRET, com a linha a laser de 488 nm. Detecta simultaneamente, com um scanner ressonante operando a 8.000 Hz no modo bidirecional, a fluorescência emitida pelo doador (entre 495 e 525 nm) e a fluorescência emitida pelo aceitador mKOk (entre 550 e 650 nm, canal FRET). Se disponível, use o laser de 473 nm.
    NOTA: A eficiência de excitação do doador será ligeiramente reduzida (85% em vez de 93% com 488 nm), mas a excitação cruzada do aceitador seráSeja reduzido também (de 17% com 488 nm a 9% com linha laser de 473 nm).
  4. Para reduzir a fototoxicidade e o branqueamento de fluoróforos, minimize a iluminação da amostra reduzindo a potência da linha laser (na janela do caminho do feixe do software de aquisição).
  5. Otimize a excitação para combinar os parâmetros de ganho e deslocamento que são definidos no início do experimento e mantidos constantes ao longo da sessão. Para definir o deslocamento, altere a cor da imagem para os valores de intensidade (usando a tabela de consulta Q) e, ao digitalizar com o laser desligado, gire o botão de deslocamento (deslocamento inteligente) para que os pixels de fundo tenham uma intensidade ligeiramente Superior a zero. Com a mesma tabela de pesquisa, ligue o laser enquanto estiver digitalizando, gire o botão de ganhos (ganhos inteligentes) para maximizar a relação sinal-ruído, com o cuidado de evitar pixels saturados.
  6. Usando um pinhole aberto (2 unidades arejadas), adquira imagens de 16 bits para fornecer um alcance dinâmico suficiente para quantitativE análises. Evite calcular a média para aumentar a velocidade de aquisição e para minimizar a fotovelagem.
  7. Na janela de aquisição de software, selecione um tamanho de campo de imagem de 512 x 64 pixels (tamanho de pixel: 605 nm) no menu suspenso.
  8. Na janela do modo de aquisição, selecione xyt (lapso de tempo em um único plano xy) do menu suspenso e registre as mudanças na tensão do neurônio da coluna vertebral embrionária ao adquirir um único plano xy, definindo os parâmetros de aquisição para gravar uma imagem a cada 30 Ms por 1 min.
  9. Para avaliar o efeito da administração de riluzol na despolarização da membrana no mesmo neurônio, adquira um novo conjunto de dados 5 min após a adição de água de peixe contendo 5 μM de riluzol.
  10. Para a análise de FRET, use a macro de ImageJ Biosensor_FRET (expressando biossensores de FRET de cadeia simples.
  11. Avalie a relação FRET da membrana basal de cada neurônio em t 1 como ((FRET mean - FRET background) / (Donor mean - Donor background)), onde FRET e DonOu intensidade média é a intensidade média de fluorescência calculada na mesma região de interesse (ROI) desenhada em torno da célula para cada canal adquirido e o fundo FRET e Donor é a intensidade média de fluorescência calculada em um ROI do campo de visão sem a amostra fluorescente.
    NOTA: Uma detalhada descrição passo a passo do uso do plugin pode ser encontrada no site www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret .
  12. Use um software gráfico para comparar a freqüência, amplitude e duração da despolarização entre diferentes paradigmas experimentais. Compare dois grupos usando um teste t de Student não compartilhado e considere os valores médios como estatisticamente diferentes quando P <0,05.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Um vetor de expressão que transporta a sequência de codificação de biossensor Mermaid baseada em FRET sob o controle do promotor pan-neuronal pHuC, que conduz a síntese da proteína exclusivamente no sistema nervoso, foi entregue em ovos fertilizados de uma única célula por meio de uma microinjeção em Para obter embriões transgênicos transitórios ( Figura 1 , Painel esquerdo). Depois de dominar a técnica de microinjecção, a porcentagem de embriões posit...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O protocolo aqui apresentado permitiu explorar a associação entre as propriedades elétricas dos neurônios motores da coluna vertebral do embrião zebra eo comportamento espiral espiral, a atividade motriz estereotípica mais antiga, que aparece em torno de 17 hpf de desenvolvimento embrionário e dura até 24 hpf 10 .

Nossa abordagem fornece aos pesquisadores uma ferramenta para estudar o sistema neural de embriões intactos, preservando plenamente a complexidade das inter...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Simona Rodighiero por seu apoio inestimável com a análise de imagens FRET.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Baixo ponto de fusão Agarose Sigma-AldrichA9414
DMSO Sigma-AldrichW387520
RiluzolSigma-AldrichR116
Pfu Ultra HQ DNA polimerase Agilent Technologies - Divisão de Produtos Stratagene600389
T3 Primer universal Sigma-Aldrich
Wizard SV Gel e PCR Clean-Up systemPromegaA9280
Universal SmaI primer Sistema de
StrataClone / pCMV-SC vetor rombudo Agilent Technologies - Divisão de Produtos Stratagene
SmaI New England BiolabsR0141S
T4 DNA ligasePromegaM1801
SalINew England BiolabsR0138S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
35 mm, prato de imagem com fundo de vidro Fórceps Ibidi81151
Sigma-AldrichF6521
EstereomicroscópioLeica MicrosystemsM10 F
Câmera digitalLeica MicrosystemsDFC 310 FX
Leica Application Suite 4.7.1 software Leica Microsystems
QuickTime Player, v10.4Apple
Microscópio confocal (invertido)Leica MicrosystemsTCS SP5
Microinjetor Eppendorf Femtojet
ImageJ macro Biosensor_FRET 
GraphPad Prism 6.0c GraphPad Software, Inc
Vetor de Expressão de Mamíferos Eurofins 240228

Referências

  1. Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
  2. Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
  3. Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
  4. Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515(2016).
  5. Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879(2015).
  6. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
  7. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
  8. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  9. Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
  10. Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
  11. Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
  12. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).
  13. Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566(2016).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Biossensor FRETNeur nios EspinaisMicroscopia ConfocalImagem de Fluoresc nciaCodifica o Gen ticaIndicadores de VoltagemTratamento com RiluzolAn lise de Enrolamento da Cauda

Artigos relacionados