Enquanto os macrófagos infiltrativos são continuamente recrutados para tecidos adultos a partir de precursores circulantes, os macrófagos residentes semeiam seu tecido durante o desenvolvimento, onde são mantidos sem mais entrada de progenitores. Os progenitores para macrófagos residentes foram identificados recentemente. Aqui, apresentamos métodos para o mapeamento do destino genético dos progenitores de macrófagos residentes.
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Artigo de método
Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os macrófagos são fagócitos profissionais do braço inato do sistema imunológico. Em estado estacionário, os macrófagos sésseis são encontrados em tecidos adultos, onde atuam como sentinelas de linha de frente e danos nos tecidos. Enquanto outras células imunes são continuamente renovadas a partir de células hematopoiéticas e progenitoras (HSPC) localizadas na medula óssea, uma linhagem de macrófagos, conhecida como macrófagos residentes, mostrou-se auto-mantida em tecidos sem a entrada de HSPC de medula óssea. Esta linhagem é exemplificada por microglia no cérebro, células de Kupffer no fígado e células de Langerhans na epiderme entre outros. A lâmina própria do intestino e do cólon são os únicos tecidos adultos desprovidos de macrófagos residentes independentes da HSPC. Pesquisas recentes identificaram que os macrófagos residentes são originários da hematopoiese do saco de gema extra-embrionária do (s) progenitor (es) distinto (s) das células estaminais hematopoiéticas do feto (HSC). Entre a hematopoiese definitiva do saco vitelino, eOs progenitores ritromoeloides (EMP) dão origem a células eritróides e mielóides, em particular macrófagos residentes. EMP só são gerados dentro do saco vitelino entre E8.5 e E10.5 dias de desenvolvimento e eles migram para o fígado fetal logo que a circulação está conectada, onde eles se expandem e diferenciam até pelo menos E16.5. Sua progênie inclui eritrócitos, macrófagos, neutrófilos e mastócitos, mas apenas os macrófagos derivados de EMP persistem até a idade adulta nos tecidos. A natureza transitória do surgimento do EMP e a sobreposição temporal com a geração de HSC tornam difícil a análise desses progenitores. Nós estabelecemos um protocolo de mapeamento de destino induzível por tamoxifeno com base na expressão do promotor Csf1r do receptor de citoquina de macrófagos para caracterizar células derivadas de EMP e EMP in vivo por citometria de fluxo.
Introdução
Existem várias ondas sucessivas mas sobrepostas de progenitores hematopoiéticos durante o desenvolvimento, cuja progenitura mielóide permanece na idade adulta. Em primeiro lugar, os progenitores "primitivos" unipotentes emergem no saco vitelino 1 , 2 entre E7.5-E8.25 e dão origem a macrófagos embrionários sem qualquer intermediário monocítico. Se os macrófagos derivados de progenitores primitivos persistem no cérebro adulto, uma vez que a microglia continua sendo objeto de investigação ativa. Em segundo lugar, os precursores eritemo-mieloides (EMPs) surgem no saco vitelino em E8.5, entram na corrente sanguíne....
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Protocolo
Os procedimentos em animais foram realizados de acordo com o comité institucional aprovado de cuidados e uso animal do Institut Pasteur (CETEA).
1. Na rotulagem de pulso Utero em embriões Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP
- Prepare a solução-mãe de 4-hidroxitoxifen (OH-TAM, 50 mg / mL).
- Sob a flexibilidade, abra o frasco de 25 mg de OH-TAM e adicione 250 μL de etanol (100%).
- Transfira a solução OH-TAM para um tubo de microcentrífuga de 2 mL com uma ponta truncada e vortex na velocidade máxima durante 10 min.
- Sonic....
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Resultados
O mapeamento do destino genético foi conseguido por administração em E8.5 de OH-TAM em fêmeas Csf1r-Mer-iCre-Mer acasaladas com machos portadores de um repórter Rosa26-LSL-eYFP. Na presença de OH-TAM, a excisão da cassete de parada leva à expressão permanente de YFP nas células que expressam Csf1r . Recolhemos dois tecidos hematopoiéticos: o saco vitelino e o fígado fetal e um tecido não hematopoiético, o neuroectoderma, dos embriões em E10.5. As suspensões de célula única foram.......
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Discussão
As diferentes ondas de células precursoras hematopoiéticas se sobrepõem parcialmente dentro de um curto período de tempo, o que torna a análise da contribuição de cada onda de hematopoiese de desenvolvimento para células imunes tecnicamente muito desafiadora.
Os sistemas Cre induzíveis de tamoxifeno oferecem a oportunidade de marcar células específicas de forma temporariamente indutível e realizar análises de linhagem em embriões ou adultos, sem a necessidade de cultura ou transplante ex.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Prof. Frederic Geissmann e ao Prof. Christian Schulz por discussões perspicazes; Dr. Hannah Garner para a leitura crítica do manuscrito, o Dr. Xavier Montagutelli e o Dr. Jean Jaubert e os funcionários da unidade animal do Instituto Pasteur para apoio à criação de camundongos; E Pascal Dardenne e Vytaute Boreikaite, um Amgen Scholar, por sua assistência técnica. A pesquisa no laboratório EGP é financiada pelo Instituto Pasteur, o CNRS, o Cercle FSER (FRM e um pacote de partida do Institut Pasteur e do consórcio REVIVE. LI é apoiado por uma bolsa de doutorado do consórcio REVIVE.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| #5 Pinça Reta | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Tesoura de Mola Pascheff-Wolff | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| Tesoura reta de 8,5 cm | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | diluição de 1/200 em FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | diluição de 1/100 em FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | Diluição de 1/100 em FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | diluição de 1/200 em FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | diluição de 1/100 em FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | Diluição de 1/200 em FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Soro Bovino | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Placa | de | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| Dutscher Dominique | 353046 | ||
| placa de cultura de tecidos de 12 poços | Dutscher Dominique | 353224 | |
| placa de cultura de tecidos de 24 poços | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 poços de cultura de tecidos de fundo em forma de U prato | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Seringa Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Grade de Nylon 100 µ filtros de células m | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Grade de nylon 70 µ filtros de células m | Dutscher Dominique | 352350 | |
| tubos Falcon de 15 ml | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Kit de filtração Millipore, 0.2 μ m | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG Deve-se | tomar cuidado especial ao preparar e trabalhar com tamoxifeno e seus derivados. Sempre use equipamento de proteção individual apropriado |
| Progesterona | Sigma | P3972 | Sempre use equipamento de proteção individual apropriado |
| Óleo de rícino PEG-35 (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Óleo de girassol | Sigma | S5007-250ML | |
| Etanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Sempre use equipamento de proteção individual adequado e use sob a capela |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML EM ÁGUA)Fischer | Scientific | 10116287 | |
| Citômetro de fluxo CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 | Beckman Coulter | B75408 | |
| Fluoroesferas Diárias CytoFLEX QC Beckman | Coulter | B53230 | |
| Kit de Esferas de Captura de Anticorpo VersaComp (2x5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | O laboratório Jackson | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | O laboratório Jackson | 6148 |
Referências
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embr....
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Reimpressões e permissões
