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Artigo de método

Bioluminescência e Near-infrared imagem de neurite óptica e Cérebro Inflamação no modelo de EAE de esclerose múltipla em ratinhos

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DOI:

10.3791/55321

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1 de março de 2017

 , 
1Institute of Clinical Pharmacology, University Hospital Frankfurt

Neste artigo

Resumo

Mostramos uma técnica para in vivo bioluminescência vivo e no infravermelho próximo de imagem de neurite óptica e encefalite no modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE) para a esclerose múltipla em ratinhos SJL / J.

Resumo

Encefalomielite auto-imune experimental (EAE) em murganhos SJL / J é um modelo para a esclerose múltipla recorrente-remitente (EMRR). pontuações de EAE clínica que descrevem os défices de função de motor são leituras básicas da inflamação mediada por imune da medula espinhal. No entanto, a pontuação e peso corporal não permitem uma avaliação in vivo de inflamação do cérebro e neurite óptica. O último é uma manifestação precoce e frequente em cerca de 2/3 dos pacientes com EM. Aqui, mostramos métodos para a bioluminescência e imagens ao vivo do infravermelho próximo para avaliar EAE evocado neurite óptica, inflamação do cérebro, e barreira sangue-cérebro interrupção (BBB) em ratos vivos utilizando um sistema de imagem in vivo. Um substrato bioluminescente activado por oxidases mostrou principalmente neurite óptica. O sinal foi específico e permitiu a visualização de efeitos da medicação e cursos tempo de doença, que em paralelo os escores clínicos. nanopartículas fluorescentes peguilados que permaneceram dentro da vasculature por períodos de tempo prolongados foram usadas para avaliar a integridade da BHE. No infravermelho próximo de imagem revelou uma fuga de certificação no pico da doença. O sinal foi mais forte em torno dos olhos. Um substrato de infravermelho próximo para metaloproteinases de matriz foi usada para avaliar a inflamação evocados-EAE. Auto-fluorescência interferiu com o sinal, o que requer a separação espectral para efeitos de quantificação. Em geral, imagem de bioluminescência foi um método fiável para avaliar a neurite óptica e efeitos de medicação associada a EAE e foi superior ao das técnicas de infravermelho próximo, em termos de especificidade do sinal, robustez, facilidade de quantificação, e custo.

Introdução

A esclerose múltipla é causada pelo ataque autoimune e destruição da bainha de mielina no cérebro e na medula espinhal1. Com uma incidência geral de cerca de 3,6 casos por 100.000 pessoas por ano em mulheres e cerca de 2,0 em homens, a EM é a segunda causa mais comum de incapacidade neurológica em adultos jovens, depois de lesões traumáticas2,3. A patologia da doença é contribuída por fatores genéticos e ambientais4, mas ainda não é completamente compreendida. Os linfócitos T autorreativos entram no sistema nervoso central e desencadeiam uma cascata inflamatória que causa infiltrados focais na substância branca do cérebro, medula espinhal e nervo óptico. Na maioria dos casos, esses infiltrados são inicialmente reversíveis, mas a persistência aumenta com o número de recidivas. Vários modelos de roedores foram desenvolvidos para estudar a patologia da doença. O EAE remitente-recorrente em camundongos SJL / J e o EAE primário-progressivo em camundongos C57BL6 são os modelos mais populares.

Os escores clínicos de EAE, que descrevem a extensão dos déficits da função motora e o peso corporal, são os padrões-ouro para avaliar a gravidade do EAE. Esses sinais clínicos concordam com a extensão da infiltração de células imunes e destruição de mielina na medula espinhal e predizem moderadamente a eficácia do tratamento medicamentoso em humanos5. No entanto, esses sinais refletem principalmente a destruição dos tratos de fibras ventrais na medula espinhal. Atualmente, não existe um método fácil, não invasivo, confiável e reprodutível para avaliar a infiltração cerebral in vivo e a neurite óptica em camundongos vivos.

A imagem in vivo concorda com os 3 princípios "R" de Russel e Burch (1959), que reivindicam uma colocação de R, Redução e refinamento de Respecização de experimentos com animais6, porque a imagem aumenta as leituras de um animal em vários pontos de tempo e permite uma redução dos números gerais. Atualmente, a inflamação ou o estado de mielina são avaliados principalmente ex vivo por meio de imuno-histoquímica, análise FACS ou diferentes métodos biológicos moleculares7, todos exigindo camundongos eutanasiados em pontos de tempo específicos.

Várias sondas de sistema de imagem in vivo foram desenvolvidas para avaliar a inflamação na pele, articulações e sistema vascular. As técnicas dependem da ativação de substratos fluorescentes bioluminescentes ou infravermelhos próximos por peroxidases teciduais, incluindo mieloperoxidase (MPO), metaloproteinases de matriz (MMPs)8 e catepsinas9 ou ciclooxigenase2. Essas sondas foram validadas principalmente em modelos de artrite ou aterosclerose9,10. Uma sonda sensível à catepsina também tem sido usada para imagens tomográficas moleculares de fluorescência de EAE11. As MMPs, particularmente MMP2 e MMP9, contribuem para a interrupção da BHE mediada por protease na EAE e são reguladas positivamente em locais de infiltração de células imunes12, sugerindo que essas sondas podem ser úteis para imagens de EAE. O mesmo vale para sondas à base de peroxidase ou catepsina. Tecnicamente, a imagem da inflamação no cérebro ou na medula espinhal é substancialmente mais desafiadora porque o crânio ou a coluna absorvem sinais bioluminescentes e infravermelhos próximos.

Além dos indicadores de inflamação, foram descritos produtos químicos fluorescentes, que se ligam especificamente à mielina e podem permitir a quantificação da mielinização13. Descobriu-se que uma sonda fluorescente de infravermelho próximo, iodeto de 3,3'-dietiltiatricarbocianina (DBT), liga-se especificamente a fibras mielinizadas e foi validada como uma ferramenta quantitativa em modelos de camundongos de defeitos primários de mielinização e em desmielinização evocada por cuprizona14. Na EAE, o sinal DBT estava bastante aumentado, refletindo a inflamação das fibras de mielina5.

Uma característica adicional da EAE e da EM é a quebra da BHE, resultando em aumento da permeabilidade vascular e extravasamento de células sanguíneas, fluido extracelular e macromoléculas para o parênquima do SNC. Isso pode levar a edema, inflamação, danos aos oligodendrócitos e, eventualmente, desmielinização15,16. Portanto, a visualização do vazamento de BHE usando sondas fluorescentes, como albumina de soro bovino marcada com fluorocromo5, que normalmente se distribuem muito lentamente do sangue para o tecido, pode ser útil para avaliar EAE.

No presente estudo, avaliamos a utilidade de diferentes sondas em EAE e mostramos o procedimento para a técnica bioluminescente mais confiável e robusta. Além disso, discutimos os prós e contras das sondas de infravermelho próximo para a atividade de MMP e integridade BBB.

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Protocolo

1. EAE Indução em SJL / J Mice

  1. Ratos
    1. Use camundongos 11 semanas de idade SJL Mulher / J e permitir-lhes para se habituar à sala experimental durante cerca de 7 dias. Utilize n = 10 ratos por grupo.
    2. Para a avaliação dos efeitos da medicação, administrar a droga e placebo para o grupo de controlo continuamente através da água de beber ou através de peletes alimentares a partir de 3 ou 5 dias após a imunização (n = 10 por grupo). Durante o pico da doença, administrar medicação ou placebo com leite ou 3% flocos de milho-embebidas água com açúcar.
  2. material de imunização
    1. Utilizado um kit de indução de EAE que compreende o antigénio (péptido da proteína proteolipídica, PLP139-151, 1 mg / ml de emulsão) em uma emulsão com adjuvante de Freund completo (CFA, morta pelo calor de Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) e 2 frascos para injectáveis ​​(5 ug cada) de toxina da tosse convulsa liofilizado (PTX).
    2. Dissolve-se a PTX (2 ug / ml) em solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS; isto é, </ Em> adicionar 1,5 mL de PBS a cada tubo de PTX, misturar bem, remover com a mesma ponta de pipeta, e adicionar a 1 mL de PBS num tubo de 50 mL); misture bem.
  3. Imunização
    1. Injectar PLP / CFA por via subcutânea em 2 porções, cada uma de 100 ul, tanto na base da cauda. Não injectar na parte de trás do pescoço, porque quaisquer reacções imunitárias na pele na parte superior das costas ou no pescoço vai perturbar a imagem da cabeça e da medula espinhal.
    2. Injectar 100 uL de PTX por via intraperitoneal (IP), duas vezes por ratinho, o primeiro 1-2 h após a imunização e a segunda a 24 h.
    3. Para os ratos de controlo, injectar CFA sem PLP (2 porções de 100 mL) mais PTX, sem PLP.
  4. Rato manuseamento após a imunização
    1. Pesar os ratos a cada dois dias até ao dia 7, e, em seguida, pesá-los diariamente.
      NOTA: Ratos perder cerca de 1-2 g de peso corporal durante a EAE. O declínio marca o início de EAE.
    2. Avaliar os sintomas clínicos diariamente desde o dia 7 de acordoing aos sistemas de pontuação padrão (ou seja, a pontuação 0: sem mudanças óbvias em funções motoras; marcar 0,5: paralisia distal da cauda; marcar 1: paralisia da cauda completa; marcar 1,5: paralisia leve de uma ou ambas as patas traseiras; marcar 2: grave paralisia das patas posteriores; marcar 2,5: paralisia completa uma perna; marcar 3: paralisia completa das duas patas traseiras; marcar 3.5:. paralisia completa dos membros posteriores e paresia de uma perna dianteira Euthanize camundongos com dezenas de 3.5 ou superior para > 12 h.
  5. Claro e hora da imagem EAE
    1. Realizar a primeira imagem no início da doença, quando os ratinhos atingir pontuações> 1, que vai ocorrer por volta do dia 10-12 após a imunização.
    2. Realizar a segunda imagem no pico, que vai ser atingido 1 ou 2 dias após os sintomas iniciais desenvolver e vai durar durante 1 - 3 dias.
      Nota: Subsequentemente, os ratos recuperar totalmente dentro de 7 a 10 dias. De imagem durante os intervalos ainda pode mostrar fugas vasculares,mas os indicadores de inflamação deve ser negativo.

2. Bioluminescent and Imaging Near-infrared de neurite óptica e Cérebro Inflamação

  1. Configuração do sistema de imagem
    1. Realiza-se em imagiologia in vivo com qualquer equipamento que permite a análise de bioluminescência e sinais do infravermelho próximo.
    2. Manter os ratos com menos de 2 - anestesia isoflurano 2,5% durante todos os procedimentos de imagem.
    3. Posição um ou dois ratos ao lado do outro no aparelho usando os fornecimentos de gás média. Posicionar a parte superior da coluna no centro.
    4. Use dois ratos simultaneamente, um por grupo, para a avaliação dos efeitos de medicação para comparar pares. Isto é importante para a imagiologia bioluminescente.
    5. Proteger o local da imunização com um pano preto e tomar uma imagem de fotografia e de linha de base para avaliar o posicionamento correto do mouse / mice. Use o foco B com um 6,5-cm de distância da câmera para todas as imagens.
  2. Injeção e imagem da sonda inflamação bioluminescente
    1. Use in vivo configurações do sistema de imagem: Epi-BLI, Em filtrar aberta, Ex bloco de filtro, fstop 1, binning 8, o foco B = 6,5 cm, anúncio de exposição 120 s; dar uma imagem de linha de base.
    2. Injectar 100 uL IP do reagente quimioluminescente pronto-para-uso (40 mg / mL). Misture bem antes de encher a seringa.
    3. Capturar imagens bioluminescência 5, 10, e 15 minutos após a injeção. O decurso de tempo do pico bioluminescente difere entre animais.
      NOTA: O pico ocorrerá 5 - 10 minutos após a injecção; um declínio de 15 min indica que não há imagens adicionais são necessários. Utilize pares de ratos com grupos de controle e tratamento para eliminar preconceitos menores devido a diferentes intervalos de tempo.
    4. Preencher descrições relevantes para o experimento. Observar uma caixa de diálogo pop-up automaticamente; que inclui informações, como estirpe de ratinhos, sexo, ponto de tempo, o tempo de injeção de sonda, o grupo, etc. Salve os arquivos de todos em One pasta; eles vão ter marcas de tempo e todas as descrições.
  3. Injeção e imagem de nanopartículas fluorescentes do infravermelho próximo para a integridade BBB
    1. Use imagens de epifluorescência infravermelho próximo no foco B (distância de 6,5 cm). Os máximos de excitação / emissão das nanopartículas fluorescentes peguilados são 675/690 nm. Capturar duas imagens em diferentes comprimentos de onda, em Ex640 / Em700 e Ex675 / Em720; usar a 2 s de exposição, binning 8 e fstop 2. Tome uma imagem de linha de base.
    2. Injectar 70 mL de nanopartículas infravermelhos fluorescentes peguilados IV através da veia da cauda e imaginar os ratos 3 h e 24 h após a injecção utilizando as definições acima. Misture bem a solução, antes de encher a seringa.
    3. Injectar cloreto de sódio a 0,9% em ratinhos de controlo, que irá ser necessário para avaliar a especificidade do sinal.
  4. Injeção e de imagem da sonda de infravermelho próximo fluorescente para a atividade MMP
    1. Barbear ou depilar a cabeça e uregião da coluna pper cautela um dia antes de tomar a imagem de linha de base. A pele não deve ser ferido.
    2. Use imagens de epifluorescência infravermelho próximo no foco B (distância de 6,5 cm). Os máximos de excitação / emissão da sonda activ�el MMP são 680/700 nm. Capturar duas imagens em diferentes comprimentos de onda, em Ex640 / Em700 e Ex675 / Em720; usar um 1-s de exposição, binning 8 e fstop 2. Tome uma imagem de linha de base.
    3. Adicionar 200 ul de 1x PBS para o tubo de 1,5 ml da solução de pronto-a-usar (20 nmol / 1,5 ml em PBS 1x), de modo que vai ser suficiente para 10 ratinhos; misturar bem antes de encher a seringa.
      NOTA: O volume fornecido não leva em conta que algum volume é perdido durante o enchimento de seringa e injeção.
    4. Injectar 150 mL da sonda IV através da veia da cauda 24 horas antes da imagiologia. Injectar PBS apenas em animais de controlo para avaliar a especificidade do sinal.
    5. Às 24 h após a injeção, tome imagens Epi-FL, pelo menos, em dois comprimentos de onda, Ex640 / Em700 e Ex 675 / EM720, com as configurações explicado acima (1-s exposição, a focagem B, binning 8 e fstop 2).
      NOTA: O uso de dois comprimentos de onda permite a separação espectral subtraindo o sinal não específico.

3. As análises da imagem

  1. Análise de bioluminescência (BLI)
    1. Clique duas vezes no software para abri-lo.
    2. Na barra de menu superior, clique no ícone do navegador de arquivos, vá para o diretório da pasta do experimento, e selecione-o; isso vai abrir todos os arquivos na pasta em uma tabela.
    3. Configurar as colunas mostram as descrições relevantes para o experimento.
    4. Para controle de qualidade, clique duas vezes em um arquivo de um rato não responder, sem sintomas de EAE e / ou um rato naïve para verificar a especificidade dos sinais de EAE.
      NOTA: Não deve haver nenhum sinal em camundongos ingênuos e sinal mínimo em ratos não responderam.
      1. Verifique a imagem de linha de base antes da injeção do proser para cada rato como um controlo posterior da especificidade do sinal; ele deve ser negativo.
    5. Para selecionar uma imagem, clique duas vezes no primeiro arquivo do primeiro rato EAE e verificar a intensidade bioluminescente (LUT gama bar) e localização. Verifique todas as imagens uma a uma. Feche o arquivo com a menor intensidade para cada rato (ou seja, mantenha 2 de 3 imagens para cada mouse).
    6. ajuste de imagem e exportação
      1. Clique duas vezes no primeiro arquivo a ser quantificado. Observar uma nova janela pop-up. Em "Opções" (menu superior), personalizar os rótulos para exibir em cada imagem.
      2. Na paleta ferramenta certa, ir para "ajuste de imagem." Por padrão, as intensidades mínimas e máximas estão definidas para "auto" e exibido em pseudo arco-íris. Selecione "manual" para alterar as configurações, se necessário.
        NOTA: Por exemplo, todas as imagens exportadas pode ter barras de TUS idênticos (minima idênticos e maxima) para ser facilmente comparáveis.O ajuste dos mínimos e máximos não tem impacto sobre os resultados quantitativos.
      3. Clique na exportação de imagens, selecione png, o diretório e um nome de imagem
    7. Quantificação de regiões de interesse (ROI)
      1. Ir para a função "ROI" na paleta de ferramentas. Selecione o método de ROI (círculo, rectangular, auto, ou free-hand) eo número de ROIs. Observe a janela de ROI aparecer na janela da imagem.
      2. Usando o mouse, ajustar o tamanho e posição. Use limiares de ROI idênticos para todas as imagens se a ferramenta de auto-ROI é usado. Use áreas idênticas para todas as imagens se os tamanhos e posições de ROI são definidos manualmente (por exemplo, ROI circular).
      3. Clique em "medir RO.I. Observar uma nova janela pop-up. Personalize as colunas (por exemplo, nome do arquivo, o número de animais, o grupo, experiência, área, as contagens totais, contagens médias, contagens SD, min e max conta, área, tempo ponto, o tempo de injeção de sonda, etc.). Salve as configurações personalizadas. Quando reAdy, selecione tudo (Ctrl + A), e copiar e colar a tabela em uma planilha.
      4. Exportar a imagem como um png com as ROIs no lugar. Salve e feche o arquivo de imagem.
    8. Repita o procedimento (etapas 3.1.6 - 3.1.7) para todos os arquivos de imagem que precisam ser quantificados. Copie todos quantificações de ROI na planilha.
      NOTA: Aqui, os resultados podem ser classificados por grupo, ponto de tempo, etc. e analisados estatisticamente. Use as contagens totais de sinais de bioluminescência na ROIs para análises estatísticas.
  2. Análise de infravermelho próximo (NIR) de nanopartículas fluorescentes
    1. Usando os controles no software, ajustar o limite da imagem.
      NOTA: Isto não tem qualquer impacto sobre o resultado quantitativo.
    2. comparar visualmente as imagens capturadas no Ex / Em 675/720 e Ex / Em 640/700 para avaliar a especificidade do sinal.
    3. Use as imagens capturadas pelo Ex / Em 675/720 para a análise quantitativa (máximo de excitação: 680 nm). Definir ROIs, para o qual pode ser utilizado a ferramenta de auto-ROI. Ajuste o limite auto-ROI e usá-lo para todas as imagens. Quantificar a eficiência radiante total na ROIs (veja o passo 3.1).
  3. Análise de infravermelho próximo (NIR) da sonda sensível a protease
    1. Usando controles de software, ajustar o limite da imagem.
      NOTA: Isto não tem qualquer impacto sobre o resultado quantitativo. Realizar a separação espectral do auto-fluorescência. A ferramenta desmistura é implementado em Imagem estar. A auto-desmistura usa o Ex / Em 640/700 como o específico e 675/720 como a imagem auto-fluorescente.
    2. Seleccionar a imagem não misturados e definir os ROIs, como descrito acima. Use a eficiência radiante total na ROIs para as análises quantitativas e estatísticas.

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Resultados

Curso de tempo de bioluminescência de neurite óptica

O sinal da sonda de bioluminescência inflamação era a mais forte em torno dos olhos e ocorreu exclusivamente em ratinhos EAE com neurite óptica. Um sinal ocorreu em nenhum dos ratinhos não-EAE nem os ratinhos não injectados com a sonda de inflamação. O sinal desapareceu quando os ratos recuperaram. Assim, o sinal é específico para a neurite óptica, e o pico ...

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Discussão

A presente vídeo mostra técnicas de bioluminescência e fluorescência no infravermelho próximo imagiologia in vivo de EAE em ratinhos SJL / J. Mostramos que imagem de bioluminescência utilizando uma sonda sensível à inflamação mostra principalmente a neurite óptica, e a quantificação está de acordo com a avaliação clínica da gravidade da EAE e os efeitos do medicamento. No entanto, o método de imagem de bioluminescência não foi capaz de detectar a inflamação da medula espinal lombar, que é um local principal de ...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) e do programa de financiamento da investigação "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) do Estado de Hessen, Centro de Pesquisa para Translational Medicine and Pharmacology TMP ea Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS), Research Training Group Translational Research Innovation - Pharma (TRIP).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AngioSpark-680Perkin Elmer, Inc., Waltham, EUANEV10149Sonda de imagem, nanopartículas peguiladas, útil para imagens da integridade da barreira hematoencefálica
MMP-sense 680Perkin Elmer, Inc., Waltham, EUANEV10126 Sonda de imagem, ativável por metaloproteinases de matriz, útil para imagens de inflamação Sonda de
inflamação XenoLight RediJectPerkin Elmer, Inc., Waltham, EUA760535Sonda de imagem, ativável por oxidases, útil para imagens de inflamação
PLP139-151/emulsão CFA Hooke Labs, St Lawrence, MAEK-0123Kit de indução EAE
Toxina de coquelucheHooke Labs, St Lawrence, MAEK-0123Kit de indução EAE
IVIS Lumina SpectrumPerkin Elmer, Inc., Waltham, EUASistema de Bioluminescência e Imagem Infravermelha
LivingImage 4.5 software Perkin Elmer, Inc., Waltham, EUACLS136334software de análise IVIS
IsofluranoAbbott Labs, Illinois, EUA26675-46-7Anestesico

Referências

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