Bioluminescência e Near-infrared imagem de neurite óptica e Cérebro Inflamação no modelo de EAE de esclerose múltipla em ratinhos

A esclerose múltipla é causada pelo ataque autoimune e destruição da bainha de mielina no cérebro e na medula espinhal¹. Com uma incidência geral de cerca de 3,6 casos por 100.000 pessoas por ano em mulheres e cerca de 2,0 em homens, a EM é a segunda causa mais comum de incapacidade neurológica em adultos jovens, depois de lesões traumáticas^2,3. A patologia da doença é contribuída por fatores genéticos e ambientais⁴, mas ainda não é completamente compreendida. Os linfócitos T autorreativos entram no sistema nervoso central e desencadeiam uma cascata inflamatória que causa infiltrados focais na substância branca do cérebro, medula espinhal e nervo óptico. Na maioria dos casos, esses infiltrados são inicialmente reversíveis, mas a persistência aumenta com o número de recidivas. Vários modelos de roedores foram desenvolvidos para estudar a patologia da doença. O EAE remitente-recorrente em camundongos SJL / J e o EAE primário-progressivo em camundongos C57BL6 são os modelos mais populares.

Os escores clínicos de EAE, que descrevem a extensão dos déficits da função motora e o peso corporal, são os padrões-ouro para avaliar a gravidade do EAE. Esses sinais clínicos concordam com a extensão da infiltração de células imunes e destruição de mielina na medula espinhal e predizem moderadamente a eficácia do tratamento medicamentoso em humanos⁵. No entanto, esses sinais refletem principalmente a destruição dos tratos de fibras ventrais na medula espinhal. Atualmente, não existe um método fácil, não invasivo, confiável e reprodutível para avaliar a infiltração cerebral in vivo e a neurite óptica em camundongos vivos.

A imagem in vivo concorda com os 3 princípios "R" de Russel e Burch (1959), que reivindicam uma colocação de R, Redução e refinamento de Respecização de experimentos com animais⁶, porque a imagem aumenta as leituras de um animal em vários pontos de tempo e permite uma redução dos números gerais. Atualmente, a inflamação ou o estado de mielina são avaliados principalmente ex vivo por meio de imuno-histoquímica, análise FACS ou diferentes métodos biológicos moleculares⁷, todos exigindo camundongos eutanasiados em pontos de tempo específicos.

Várias sondas de sistema de imagem in vivo foram desenvolvidas para avaliar a inflamação na pele, articulações e sistema vascular. As técnicas dependem da ativação de substratos fluorescentes bioluminescentes ou infravermelhos próximos por peroxidases teciduais, incluindo mieloperoxidase (MPO), metaloproteinases de matriz (MMPs)⁸ e catepsinas⁹ ou ciclooxigenase². Essas sondas foram validadas principalmente em modelos de artrite ou aterosclerose^9,10. Uma sonda sensível à catepsina também tem sido usada para imagens tomográficas moleculares de fluorescência de EAE¹¹. As MMPs, particularmente MMP2 e MMP9, contribuem para a interrupção da BHE mediada por protease na EAE e são reguladas positivamente em locais de infiltração de células imunes¹², sugerindo que essas sondas podem ser úteis para imagens de EAE. O mesmo vale para sondas à base de peroxidase ou catepsina. Tecnicamente, a imagem da inflamação no cérebro ou na medula espinhal é substancialmente mais desafiadora porque o crânio ou a coluna absorvem sinais bioluminescentes e infravermelhos próximos.

Além dos indicadores de inflamação, foram descritos produtos químicos fluorescentes, que se ligam especificamente à mielina e podem permitir a quantificação da mielinização¹³. Descobriu-se que uma sonda fluorescente de infravermelho próximo, iodeto de 3,3'-dietiltiatricarbocianina (DBT), liga-se especificamente a fibras mielinizadas e foi validada como uma ferramenta quantitativa em modelos de camundongos de defeitos primários de mielinização e em desmielinização evocada por cuprizona¹⁴. Na EAE, o sinal DBT estava bastante aumentado, refletindo a inflamação das fibras de mielina⁵.

Uma característica adicional da EAE e da EM é a quebra da BHE, resultando em aumento da permeabilidade vascular e extravasamento de células sanguíneas, fluido extracelular e macromoléculas para o parênquima do SNC. Isso pode levar a edema, inflamação, danos aos oligodendrócitos e, eventualmente, desmielinização^15,16. Portanto, a visualização do vazamento de BHE usando sondas fluorescentes, como albumina de soro bovino marcada com fluorocromo⁵, que normalmente se distribuem muito lentamente do sangue para o tecido, pode ser útil para avaliar EAE.

No presente estudo, avaliamos a utilidade de diferentes sondas em EAE e mostramos o procedimento para a técnica bioluminescente mais confiável e robusta. Além disso, discutimos os prós e contras das sondas de infravermelho próximo para a atividade de MMP e integridade BBB.

1. EAE Indução em SJL / J Mice

1. Ratos
   1. Use camundongos 11 semanas de idade SJL Mulher / J e permitir-lhes para se habituar à sala experimental durante cerca de 7 dias. Utilize n = 10 ratos por grupo.
   2. Para a avaliação dos efeitos da medicação, administrar a droga e placebo para o grupo de controlo continuamente através da água de beber ou através de peletes alimentares a partir de 3 ou 5 dias após a imunização (n = 10 por grupo). Durante o pico da doença, administrar medicação ou placebo com leite ou 3% flocos de milho-embebidas água com açúcar.
2. material de imunização
   1. Utilizado um kit de indução de EAE que compreende o antigénio (péptido da proteína proteolipídica, PLP139-151, 1 mg / ml de emulsão) em uma emulsão com adjuvante de Freund completo (CFA, morta pelo calor de Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) e 2 frascos para injectáveis ​​(5 ug cada) de toxina da tosse convulsa liofilizado (PTX).
   2. Dissolve-se a PTX (2 ug / ml) em solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS; isto é, </ Em> adicionar 1,5 mL de PBS a cada tubo de PTX, misturar bem, remover com a mesma ponta de pipeta, e adicionar a 1 mL de PBS num tubo de 50 mL); misture bem.
3. Imunização
   1. Injectar PLP / CFA por via subcutânea em 2 porções, cada uma de 100 ul, tanto na base da cauda. Não injectar na parte de trás do pescoço, porque quaisquer reacções imunitárias na pele na parte superior das costas ou no pescoço vai perturbar a imagem da cabeça e da medula espinhal.
   2. Injectar 100 uL de PTX por via intraperitoneal (IP), duas vezes por ratinho, o primeiro 1-2 h após a imunização e a segunda a 24 h.
   3. Para os ratos de controlo, injectar CFA sem PLP (2 porções de 100 mL) mais PTX, sem PLP.
4. Rato manuseamento após a imunização
   1. Pesar os ratos a cada dois dias até ao dia 7, e, em seguida, pesá-los diariamente.
      NOTA: Ratos perder cerca de 1-2 g de peso corporal durante a EAE. O declínio marca o início de EAE.
   2. Avaliar os sintomas clínicos diariamente desde o dia 7 de acordoing aos sistemas de pontuação padrão (ou seja, a pontuação 0: sem mudanças óbvias em funções motoras; marcar 0,5: paralisia distal da cauda; marcar 1: paralisia da cauda completa; marcar 1,5: paralisia leve de uma ou ambas as patas traseiras; marcar 2: grave paralisia das patas posteriores; marcar 2,5: paralisia completa uma perna; marcar 3: paralisia completa das duas patas traseiras; marcar 3.5:. paralisia completa dos membros posteriores e paresia de uma perna dianteira Euthanize camundongos com dezenas de 3.5 ou superior para > 12 h.
5. Claro e hora da imagem EAE
   1. Realizar a primeira imagem no início da doença, quando os ratinhos atingir pontuações> 1, que vai ocorrer por volta do dia 10-12 após a imunização.
   2. Realizar a segunda imagem no pico, que vai ser atingido 1 ou 2 dias após os sintomas iniciais desenvolver e vai durar durante 1 - 3 dias.
      Nota: Subsequentemente, os ratos recuperar totalmente dentro de 7 a 10 dias. De imagem durante os intervalos ainda pode mostrar fugas vasculares,mas os indicadores de inflamação deve ser negativo.

2. Bioluminescent and Imaging Near-infrared de neurite óptica e Cérebro Inflamação

1. Configuração do sistema de imagem
   1. Realiza-se em imagiologia in vivo com qualquer equipamento que permite a análise de bioluminescência e sinais do infravermelho próximo.
   2. Manter os ratos com menos de 2 - anestesia isoflurano 2,5% durante todos os procedimentos de imagem.
   3. Posição um ou dois ratos ao lado do outro no aparelho usando os fornecimentos de gás média. Posicionar a parte superior da coluna no centro.
   4. Use dois ratos simultaneamente, um por grupo, para a avaliação dos efeitos de medicação para comparar pares. Isto é importante para a imagiologia bioluminescente.
   5. Proteger o local da imunização com um pano preto e tomar uma imagem de fotografia e de linha de base para avaliar o posicionamento correto do mouse / mice. Use o foco B com um 6,5-cm de distância da câmera para todas as imagens.
2. Injeção e imagem da sonda inflamação bioluminescente
   1. Use in vivo configurações do sistema de imagem: Epi-BLI, Em filtrar aberta, Ex bloco de filtro, fstop 1, binning 8, o foco B = 6,5 cm, anúncio de exposição 120 s; dar uma imagem de linha de base.
   2. Injectar 100 uL IP do reagente quimioluminescente pronto-para-uso (40 mg / mL). Misture bem antes de encher a seringa.
   3. Capturar imagens bioluminescência 5, 10, e 15 minutos após a injeção. O decurso de tempo do pico bioluminescente difere entre animais.
      NOTA: O pico ocorrerá 5 - 10 minutos após a injecção; um declínio de 15 min indica que não há imagens adicionais são necessários. Utilize pares de ratos com grupos de controle e tratamento para eliminar preconceitos menores devido a diferentes intervalos de tempo.
   4. Preencher descrições relevantes para o experimento. Observar uma caixa de diálogo pop-up automaticamente; que inclui informações, como estirpe de ratinhos, sexo, ponto de tempo, o tempo de injeção de sonda, o grupo, etc. Salve os arquivos de todos em One pasta; eles vão ter marcas de tempo e todas as descrições.
3. Injeção e imagem de nanopartículas fluorescentes do infravermelho próximo para a integridade BBB
   1. Use imagens de epifluorescência infravermelho próximo no foco B (distância de 6,5 cm). Os máximos de excitação / emissão das nanopartículas fluorescentes peguilados são 675/690 nm. Capturar duas imagens em diferentes comprimentos de onda, em Ex640 / Em700 e Ex675 / Em720; usar a 2 s de exposição, binning 8 e fstop 2. Tome uma imagem de linha de base.
   2. Injectar 70 mL de nanopartículas infravermelhos fluorescentes peguilados IV através da veia da cauda e imaginar os ratos 3 h e 24 h após a injecção utilizando as definições acima. Misture bem a solução, antes de encher a seringa.
   3. Injectar cloreto de sódio a 0,9% em ratinhos de controlo, que irá ser necessário para avaliar a especificidade do sinal.
4. Injeção e de imagem da sonda de infravermelho próximo fluorescente para a atividade MMP
   1. Barbear ou depilar a cabeça e uregião da coluna pper cautela um dia antes de tomar a imagem de linha de base. A pele não deve ser ferido.
   2. Use imagens de epifluorescência infravermelho próximo no foco B (distância de 6,5 cm). Os máximos de excitação / emissão da sonda activ�el MMP são 680/700 nm. Capturar duas imagens em diferentes comprimentos de onda, em Ex640 / Em700 e Ex675 / Em720; usar um 1-s de exposição, binning 8 e fstop 2. Tome uma imagem de linha de base.
   3. Adicionar 200 ul de 1x PBS para o tubo de 1,5 ml da solução de pronto-a-usar (20 nmol / 1,5 ml em PBS 1x), de modo que vai ser suficiente para 10 ratinhos; misturar bem antes de encher a seringa.
      NOTA: O volume fornecido não leva em conta que algum volume é perdido durante o enchimento de seringa e injeção.
   4. Injectar 150 mL da sonda IV através da veia da cauda 24 horas antes da imagiologia. Injectar PBS apenas em animais de controlo para avaliar a especificidade do sinal.
   5. Às 24 h após a injeção, tome imagens Epi-FL, pelo menos, em dois comprimentos de onda, Ex640 / Em700 e Ex 675 / EM720, com as configurações explicado acima (1-s exposição, a focagem B, binning 8 e fstop 2).
      NOTA: O uso de dois comprimentos de onda permite a separação espectral subtraindo o sinal não específico.

3. As análises da imagem

1. Análise de bioluminescência (BLI)
   1. Clique duas vezes no software para abri-lo.
   2. Na barra de menu superior, clique no ícone do navegador de arquivos, vá para o diretório da pasta do experimento, e selecione-o; isso vai abrir todos os arquivos na pasta em uma tabela.
   3. Configurar as colunas mostram as descrições relevantes para o experimento.
   4. Para controle de qualidade, clique duas vezes em um arquivo de um rato não responder, sem sintomas de EAE e / ou um rato naïve para verificar a especificidade dos sinais de EAE.
      NOTA: Não deve haver nenhum sinal em camundongos ingênuos e sinal mínimo em ratos não responderam.
      1. Verifique a imagem de linha de base antes da injeção do proser para cada rato como um controlo posterior da especificidade do sinal; ele deve ser negativo.
   5. Para selecionar uma imagem, clique duas vezes no primeiro arquivo do primeiro rato EAE e verificar a intensidade bioluminescente (LUT gama bar) e localização. Verifique todas as imagens uma a uma. Feche o arquivo com a menor intensidade para cada rato (ou seja, mantenha 2 de 3 imagens para cada mouse).
   6. ajuste de imagem e exportação
      1. Clique duas vezes no primeiro arquivo a ser quantificado. Observar uma nova janela pop-up. Em "Opções" (menu superior), personalizar os rótulos para exibir em cada imagem.
      2. Na paleta ferramenta certa, ir para "ajuste de imagem." Por padrão, as intensidades mínimas e máximas estão definidas para "auto" e exibido em pseudo arco-íris. Selecione "manual" para alterar as configurações, se necessário.
         NOTA: Por exemplo, todas as imagens exportadas pode ter barras de TUS idênticos (minima idênticos e maxima) para ser facilmente comparáveis.O ajuste dos mínimos e máximos não tem impacto sobre os resultados quantitativos.
      3. Clique na exportação de imagens, selecione png, o diretório e um nome de imagem
   7. Quantificação de regiões de interesse (ROI)
      1. Ir para a função "ROI" na paleta de ferramentas. Selecione o método de ROI (círculo, rectangular, auto, ou free-hand) eo número de ROIs. Observe a janela de ROI aparecer na janela da imagem.
      2. Usando o mouse, ajustar o tamanho e posição. Use limiares de ROI idênticos para todas as imagens se a ferramenta de auto-ROI é usado. Use áreas idênticas para todas as imagens se os tamanhos e posições de ROI são definidos manualmente (por exemplo, ROI circular).
      3. Clique em "medir RO.I. Observar uma nova janela pop-up. Personalize as colunas (por exemplo, nome do arquivo, o número de animais, o grupo, experiência, área, as contagens totais, contagens médias, contagens SD, min e max conta, área, tempo ponto, o tempo de injeção de sonda, etc.). Salve as configurações personalizadas. Quando reAdy, selecione tudo (Ctrl + A), e copiar e colar a tabela em uma planilha.
      4. Exportar a imagem como um png com as ROIs no lugar. Salve e feche o arquivo de imagem.
   8. Repita o procedimento (etapas 3.1.6 - 3.1.7) para todos os arquivos de imagem que precisam ser quantificados. Copie todos quantificações de ROI na planilha.
      NOTA: Aqui, os resultados podem ser classificados por grupo, ponto de tempo, etc. e analisados estatisticamente. Use as contagens totais de sinais de bioluminescência na ROIs para análises estatísticas.
2. Análise de infravermelho próximo (NIR) de nanopartículas fluorescentes
   1. Usando os controles no software, ajustar o limite da imagem.
      NOTA: Isto não tem qualquer impacto sobre o resultado quantitativo.
   2. comparar visualmente as imagens capturadas no Ex / Em 675/720 e Ex / Em 640/700 para avaliar a especificidade do sinal.
   3. Use as imagens capturadas pelo Ex / Em 675/720 para a análise quantitativa (máximo de excitação: 680 nm). Definir ROIs, para o qual pode ser utilizado a ferramenta de auto-ROI. Ajuste o limite auto-ROI e usá-lo para todas as imagens. Quantificar a eficiência radiante total na ROIs (veja o passo 3.1).
3. Análise de infravermelho próximo (NIR) da sonda sensível a protease
   1. Usando controles de software, ajustar o limite da imagem.
      NOTA: Isto não tem qualquer impacto sobre o resultado quantitativo. Realizar a separação espectral do auto-fluorescência. A ferramenta desmistura é implementado em Imagem estar. A auto-desmistura usa o Ex / Em 640/700 como o específico e 675/720 como a imagem auto-fluorescente.
   2. Seleccionar a imagem não misturados e definir os ROIs, como descrito acima. Use a eficiência radiante total na ROIs para as análises quantitativas e estatísticas.

Curso de tempo de bioluminescência de neurite óptica

O sinal da sonda de bioluminescência inflamação era a mais forte em torno dos olhos e ocorreu exclusivamente em ratinhos EAE com neurite óptica. Um sinal ocorreu em nenhum dos ratinhos não-EAE nem os ratinhos não injectados com a sonda de inflamação. O sinal desapareceu quando os ratos recuperaram. Assim, o sinal é específico para a neurite óptica, e o pico do sinal é paralelo ao pico das pontuações de EAE clínica. A Figura 1 mostra dois exemplos de ratinhos SJL / J fotografadas no dia 10 e 14 após a indução da EAE. O sinal bioluminescente foi o mais alto no dia 10 e desapareceu quando os murganhos começaram a recuperar. Os cursos de tempo das pontuações clínicas combinava com o desaparecimento do sinal bioluminescente (exemplo-1) ou precedido (exemplo-2) o declínio das pontuações.

Avaliação da Eficácia do Tratamento

sonda inflamação

Os efeitos da medicação (R-flurbiprofeno 5 mg / kg / d), 5 são mostrados na Figura 2. Cinco exemplos das imagens bioluminescentes em cada grupo são apresentados. As pontuações do grupo de veículo e de tratamento foram heterogénea, mas em todos os ratinhos, o sinal bioluminescente no olho mostrando a inflamação no nervo óptico era inferior no grupo medicamento (Figura 2A). A quantificação das contagens totais bioluminescentes em rois confirmada significativa a eficácia do tratamento (Figura 2B, com gráficos de caixas das contagens totais bioluminescentes, desemparelhado 2-tailed t-teste, P <0,05). Os resultados de imagem acordado com o efeito terapêuticos da medicação em termos de escores clínicos e manifestações histopatológicas de EAE na medula espinhal e nervo óptico 5.

Figura 2. A eficácia de medicamentos em ratos EAE-SJL / j utilizando Bioluminescent Imaging. ratinhos SJL / J receberam veículo ou medicamento (R-flurbiprofeno 5 mg / kg / d) a partir de 5 dias após a imunização. As imagens foram capturadas após a injecção da sonda inflamação (100 mL ip) no pico EAE 1 r, n = 10 por grupo. EAE desenvolvido em 7/10 em ambos os grupos, e EAE não-respondedores estavam sem sinal. A) bioluminescência imagens em ratos vivos capturado 5-15 min após a injecção ip de 100 ul do sonda inflamação são apresentados como sobreposições fotografia PseudoColor arco-íris. bares TUS variam de azul (baixo) ao vermelho (alta intensidade). Barra de escala: 1 cm. O pico indivíduodas contagens totais bioluminescentes em rois foi usada para quantificação. ROIs foram restritas à cabeça. Os locais de injecção PLP estavam protegidos com um pano preto. B) Os diagramas de caixa mostrando a quantificação das contagens totais em rois. A caixa representa o intervalo interquartil, a linha é a mediana, e os bigodes mostrar o mínimo ao máximo. As contagens totais diferiu significativamente entre os grupos (teste t de dois lados não emparelhado, P <0,05), demonstrando uma redução de neurite óptica e encefalite em ratinhos que receberam a medicação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nanopartículas fluorescentes peguilados

imagens de epifluorescência de nanopartículas do infravermelho próximo revelou fugas vasculares em torno dos olhos e no cérebro em ambos os grou tratamentoPS (Figura 3A, 2 exemplos). As partículas distribuir-se muito lentamente a partir do sangue para o espaço intersticial, excepto para os locais de inflamação, em que o corante se acumula, o que permite uma avaliação da integridade da BHE. O vazamento foi evidente em 3 h e 24 h após a injecção das nanoparticulas, mas foi mais forte no ponto de tempo posterior. Não havia nenhum sinal específico em ratinhos não EAE ou ratos não injectados com nanopartículas (painel da direita). Assim, o sinal era específica. A análise quantitativa da eficácia radiante em rois (Figura 3B) não revelou diferenças significativas entre os grupos de tratamento (n = 3 por grupo, desemparelhado 2-tailed t-teste, P <0,05).

Figura 3. Avaliação de Sangue barreira do cérebro Disruption com peguilado fluorescente nanopartículas. SJL / J ratinhos receberam veículo ou medicamento (R-flurbiprofPT 5 mg / kg / d) a partir de 5 dias após a imunização. As imagens foram capturadas 3 h e 24 h após a injecção de nanopartículas de próximo do infravermelho-marcado (70 ul iv) durante o pico de EAE 1, n = 3 por grupo. EAE não-respondedores estavam sem sinal. A ferramenta de auto-ROI foi usada para a quantificação da eficácia radiante. Os ROIs foram restritas à cabeça. Os locais de injecção PLP foram blindados. A) Exemplos de epifluorescência imagens de ratos vivos, capturado 3 h e 24 h após a injecção de nanopartículas. Imagens de ratos sem EAE ou sem a injecção de nanopartículas foram utilizados como controlos de imagem. Barra de escala: 1 cm. bares TUS variam de vermelho escuro (baixo) para amarelo (alta intensidade). B) Os gráficos de barras que mostram a quantificação da eficácia radiante em rois (média ± DP). Os grupos de tratamento não diferiram significativamente (2 lados teste t não emparelhado). Por favor clique aqui para v IEW uma versão maior desta figura.

Metaloproteinase de matriz-sensível da sonda

Depois de subtrair o auto-fluorescência, a sonda de imagens de protease MMP-activável revelou a inflamação no cérebro e a medula espinal em ratos EAE (Figura 4A, os exemplos de 4 ratinhos por grupo). Não havia nenhum sinal em ratos não injectados com a sonda, e um sinal fraco ocorreu em um rato sem sintomas clínicos de EAE (não-respondedor). Imagens na Figura 4 mostra o sinal em Ex / Em 640/700 subtraído pela imagem de Ex / Em 675/720. As diferenças entre os tratamentos foram revelados apenas após a análise quantitativa da eficácia radiante em auto-ROIs após a separação espectral (Figura 4B, desemparelhado 2-tailed t-teste, n = 6 e 4, P <0,05).

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Figura 4. Avaliação da metaloproteinase Atividade com sonda de imagem MMP-sensível Near-infrared. ratinhos SJL / J receberam veículo ou medicamento (R-flurbiprofeno 5 mg / kg / d) a partir de 5 dias após a imunização. As imagens foram capturadas em 24 h após a injecção da sonda (150 uL iv) pelo o primeiro pico de EAE, n = 6 e 4. Os locais de injecção foram de PLP blindado. EAE não respondedores e os ratos sem injecções sonda de MMP foram usadas como controlos. Cada 2 imagens foram capturadas pelo Ex / Em 640/700 nm (sinal específico) e 675/720 nm (auto-fluorescência). Usando a ferramenta de separação espectral, a auto-fluorescência foi subtraída e, subsequentemente, a ferramenta de auto-ROI foi utilizada para identificar os locais de actividade de MMP específica. A eficiência total de radiação foi usada para quantificação. A) imagens de epifluorescência exemplares em ratos vivos capturados 24 h após a injeção sonda. As imagens são o resultado de separação espectral (UMX). Barra de escala: 1 cm. bar LUTs gama de vermelho escuro (baixo) para amarelo (alta intensidade). B) Os diagramas de caixa que mostra a quantificação da eficácia radiante total na ROIs. A caixa representa o intervalo interquartil, a linha é a mediana, e os bigodes mostrar o mínimo ao máximo. O asterisco indica uma diferença significativa entre os grupos (teste t não pareado 2 faces, P <0,05). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.