Este protocolo descreve esfregaços massagem, uma técnica não-invasiva manual para coleta de sêmen de aves e extração de DNA de esperma aviária usando um kit de extração comercial com modificações.
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Artigo de método
Coleta de sêmen aviária por esfregaços massagem e isolamento do DNA de esperma
Neste artigo
Resumo
Resumo
Colheita de sémen pode ser útil para uma vasta gama de aplicações, incluindo estudos que envolvem a qualidade do esperma, esperma telômero dinâmica e epigenética. Pássaros são assuntos amplamente utilizados na investigação biológica e são ideais para estudos que envolvam amostras repetidas de esperma. No entanto, alguns recursos estão atualmente disponíveis para aqueles que desejam aprender a coletar e extrair DNA de esperma aviária. Aqui descrevemos esfregaços massagem, uma técnica manual suave, não-invasivo para a coleta de esperma aviária. Embora esta técnica é estabelecida na literatura, pode ser difícil de aprender com as descrições disponíveis. Nós também fornecemos informações para extrair DNA de sémen aviária usando um kit de extração comercial com modificações. Esfregaços massagem pode ser usada facilmente em qualquer pequeno para médio porte masculino ave condição reprodutiva. Após a coleta, o sêmen pode ser usado imediatamente para ensaios de motilidade ou congelado para extração de DNA, seguindo o protocolo descrito neste documento. Este protocolo de extração foi refinado por esperma aviária e tem sido utilizado com sucesso em amostras coletadas de diversas espécies de passeriformes (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanuse Turdus migratorius ) e um columbid (Columba livia).
Introdução
Pássaros são temas ideais para estudos que envolvem a qualidade do esperma e competição1, esperma telômero dinâmica2, epigenetics3e tópicos semelhantes, como são amplamente utilizados em pesquisas biológicas e esperma pode ser degustadas facilmente usando esfregaços massagem. Esfregaços massagem é uma técnica manual suave, não-invasivo para a coleta de sêmen de aves4,5,6. Amostras repetidas podem ser obtidas facilmente e sem ferramentas especiais são necessárias, tornando simples para executar no campo ou no laboratório. Apesar de esfregaços massagem tem sido usado por décadas, é difícil de aprender com os escritos descrições disponíveis. Esta publicação destina-se a reduzir o tempo e incerteza envolvidos em aprender massagem esfregaços.
Sêmen coletado de aves usando esfregaços massagem pode ser usado imediatamente para avaliação de motilidade4,7 ou inseminação artificial8, ou congelado para outros usos, tais como de imagem avançada e extração de DNA. Amostras de sêmen de aves da ordem Passeriformes são pequenas mas contenham esperma densamente. DNA é extraído usando um kit de extração comercial para manter a simplicidade, com modificações para superar as funções de protecção especializadas de esperma9. Após a extração, telômeros de esperma podem ser medidos usando qPCR10.
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Protocolo
Este protocolo envolve assuntos animais vertebrados e foi aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) da North Dakota State University e institucional Cuidado Animal.
1. coleta de sêmen de uma ave passeriforme da família usando esfregaços massagem
Nota: Esfregaços massagem é uma técnica de coleção de sêmen eficaz sobre aves reprodutivamente ativas somente, mas pode ser realizada com sucesso fora da época de reprodução em situações apropriadas em cativeiro. Atividade reprodutiva deve ser determinada para a espécie-alvo antes de utilizar a massagem esfregaços. Esta técnica pode ser usada em aves selvagens após captura ou em pássaros mantidos em cativeiro.
- Começando com um pássaro masculino, (em condição de reprodução) aderência do bander na mão não dominante, transferir o pássaro para a mão dominante com seu lado ventral, tocando a palma (Figura 1).
- Certifique-se de que a cabeça da ave é o mais próximo a borda lateral da palma da mão. Seguro levemente a cabeça e o corpo usando o mindinho, anel e os dedos do meio. Isso deixa do pássaro respiradouro e cauda exposta.
- Deixe as pernas do pássaro solto ou levemente comedido, usando a palma da mão.
Figura 1 : Aperto para massagem esfregaços. O pássaro está seguro levemente na mão dominante, com seu lado ventral, tocando a palma e cabeça garantidas pelo dedo mindinho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Coloque o dominante o dedo indicador e o polegar de cada lado da extremidade superior da cloaca e levemente belisca os dedos juntos, aplicando uma pressão muito leve em direção a cauda ( Figura 2). A cloaca será evert, expondo a mucosa cloacal (interior cor de rosa).
Nota: Se o pássaro não está atualmente produzindo sêmen, a protuberância cloacal pode ser pequena e a cloaca é difícil de evert. Com a experiência, é fácil diferenciar entre as cloacas de machos reprodutivamente ativas e inativas5,11.
Figura 2 : Dedo posição e protuberância cloacal. Evert cloaca aplicando pressão ligeira à extremidade superior (A). Em um ativo reprodutivamente masculino ave passeriforme da família, a protuberância cloacal é óbvia e empresa (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Com a mão não dominante, coloque a almofada do dedo no lado dorsal da base da cauda para estabilizar a mão e em seguida, coloque a ponta do polegar logo abaixo da cloaca de sempre.
Nota: Uma miniatura curta e Lisa é vantajosa para a realização de massagem cloacal e protege o pássaro de lesão acidental. - Mova o polegar não-dominante cranialmente e profunda em um movimento repetitivo com média pressão, ficando abaixo da cloaca. Continue até o pássaro ejacula. Dependendo do indivíduo, isto normalmente leva entre 1 e várias dezenas de cursos.
- Assim que o pássaro ejacula, colete o sêmen em um tubo de Microhematócrito. Repita a massagem esfregaços para obter múltiplos ejacula.
Nota: Passeriformes sémen é castanho claro e normalmente tem uma consistência um pouco grossa. Substâncias brancas ou escuras, expelidas da cloaca não estão sémen e podem contaminar a amostra de sêmen. A aparência de uma pequena quantidade de sangue na cloaca ou misturado com o sêmen é geralmente causado por muita pressão durante a massagem. - Para a extração de DNA, coloca o sêmen em um tubo de microcentrifugadora com 20 µ l de 1X PBS (pH 7,4). Nota: Sêmen armazenado em PBS 1x não é apropriado para a inseminação artificial, mas pode ser usado para a extração de DNA em uma data posterior quando armazenado a-80 ° C. O PBS pode ser temperatura ambiente ou refrigerados, mas deve estar no estado líquido, quando a amostra de sêmen é depositada.
- Confirme a presença de espermatozoides na amostra exibindo uma pequena quantidade da amostra diluída sob um microscópio composto (Figura 3).
- Armazene o sêmen diluído a-80 ° C até a extração.
2. extração de DNA do sêmen do pássaro
Nota: Este protocolo foi testado com vários jogos comerciais de extração de DNA, mas só faz sucesso quando usado com um DNA kit12. Etapas que são modificadas desde o protocolo do kit são indicadas por *.
- Preparar uma solução 1m de ditiotreitol (DTT) em água e misture usando um vortex.*
- Alíquota da solução de TDT e armazená-lo a-20 ° C até imediatamente antes da utilização. Cada amostra a ser extraído requer 10 µ l de solução de TDT * 1m
- Preparar um buffer contendo 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; e 4% SDS. Cada amostra a ser extraído exige 90 µ l desta buffer.*
- Armazene o buffer em temperatura ambiente. Se ele se precipitou, aquecê-lo a 56 ° C, para dissolve.*
- Pré-aqueça uma incubadora contendo um balancim ou agitador a 65 ° c
- Imediatamente antes de iniciar a extração, misture a solução de TDT 10 µ l com 90 µ l de buffer preparado no passo 2.2 para cada amostra a ser extraído, por exemplo, 900 buffer de µ l além de 100 µ l TDT solução se extraindo 10 amostras. Esta mistura será chamada TDT-buffer.*
- Adicionar 70 µ l 1X PBS para a amostra de sêmen diluído inteiro e misture bem, usando um vortex.*
- Adicione 100 µ l tampão-DTT e solução de proteinase K 10 µ l de amostra. Vórtex por 20 segundos, então incubar na incubadora pré-aquecido por 1 hora em um balancim ou shaker.*
- Adicionar 200 µ l de buffer AL e 200 µ l EtOH fresco (100%) e vórtice para encerrar 20
- Transferir a amostra inteira para uma coluna de rotação e centrifugar 1 minuto em 6.000 x. g. descarte o tubo de coleta.
- Coloque a coluna em um tubo novo e juntar 500 µ l preparado tampão AW1. Centrifugar 1 minuto em 6.000 x. g. descarte o tubo de coleta.
- Coloque a coluna em um tubo novo e juntar 500 µ l preparado tampão AW2. Centrífuga para 1 minuto em 6.000 g. x descartar o escoamento e coloque a coluna de volta no tubo.
- Centrifugar a 3 minutos a 20.000 x g. descarte o tubo de coleta e colocar a coluna em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
- Pipeta 35 µ l de AE buffer directamente sobre a membrana da coluna e incubar a temperatura ambiente por 5 minutes.*
- Centrifugar 1 minuto a 14.000 x. g. descartar a coluna de rotação e armazenar amostras extraídas a-80 ° C.
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Resultados
Massagem de esfregaços e DNA extração usando que o protocolo descrito foi realizado em várias espécies de passeriformes e um columbid (tabela 1). A presença de espermatozoides em amostras de sêmen recolhidas pela massagem esfregaços foi confirmada pela visualização de uma pequena quantidade das amostras diluídas sob um microscópio composto em ampliação de 400 X (Figura 3). Depois de extrair o DNA de amostras de sêmen coletados de pardais de c...
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Discussão
Nós descrevemos um método simples e confiável para coleta de sêmen de aves pequenas e médias em condição reprodutivamente ativa e extrair DNA de esperma aviária.
O protocolo de extração de DNA de sémen descrito é modificado a partir de um kit para manter a simplicidade, mas foi refinado para uso em sêmen aviária. Espermatozoides são resistentes à Lise por extração padrão produtos químicos9,13, e amostras de sêmen coletadas de passerifo...
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Agradecemos Jose Noguera assistência precoce com massagem cloacal, e Jeffrey Kittilson para laboratório de apoio. Este trabalho foi apoiado por um prêmio de ND EPSCoR FAR0022429 a BJH. Custos de publicação foram generosamente apoiados pelo departamento de ciências biológicas da NDSU.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos capilares de microhematócrito | Fisherbrand | 22-362566 | Qualquer fornecedor pode ser usado. Tubos menores podem ser mais eficazes para a coleta de pequenas amostras de sêmen, como de aves passeriformes muito pequenas, como o pardal. |
| Tubos de microcentrífuga | Qualquer | ||
| 1x PBS | Qualquer | Usado para armazenar amostras de sêmen antes da extração de DNA. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Qualquer fornecedor pode ser usado. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Qualquer fornecedor pode ser usado. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Qualquer fornecedor pode ser usado. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Qualquer fornecedor pode ser usado. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit é recomendado especificamente. Este protocolo de extração de DNA foi tentado com outros kits comerciais, mas com pouco sucesso. As razões para isso são desconhecidas para nós. |
Referências
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Reimpressões e permissões
