Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

Manuela Lahne; Ryne A. Gorsuch; Craig M. Nelson; David R. Hyde

doi:10.3791/55335

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Artigo de método

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

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DOI:

10.3791/55335

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24 de fevereiro de 2017

Manuela Lahne¹ , Ryne A. Gorsuch¹ , Craig M. Nelson¹^,² , David R. Hyde¹

¹Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, ²Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

Neste artigo

Resumo

regeneração de retina de peixe-zebra foi principalmente estudada usando retinas fixos. No entanto, os processos dinâmicos, como a migração nuclear interkinetic ocorrer durante a resposta regenerativa e exigem processamento de imagem de células vivas para investigar os mecanismos subjacentes. Aqui, descrevemos as condições de cultura e de imagem para monitorar Migração Nuclear Interkinetic (INM) em tempo real através de microscopia multiphoton.

Resumo

Um programa de regeneração endógena é iniciada por Müller glia no peixe-zebra adulto (Danio rerio) retina seguintes danos e morte neuronal. As Müller glia re-entrar no ciclo celular e produzir células progenitoras neuronais que são submetidos a ciclos subsequentes de divisões celulares e diferenciar em tipos de células neuronais perdidas. Ambos Müller glia e células progenitoras neuronais núcleos replicar o seu ADN e sofrem mitose em locais distintos da retina, ou seja, elas migram entre o basal camada interna Nuclear (INL) e a camada exterior Nuclear (ONL), respectivamente, em um processo descrito como Interkinetic Migração nuclear (INM). INM foi predominantemente estudados na retina em desenvolvimento. Para examinar a dinâmica do INM no adulto regenerar retina zebrafish em detalhe, processamento de imagem de células vivas de células fluorescentes marcado Müller glia / neuronais progenitoras é necessária. Aqui, nós fornecemos as condições para isolar e retinas cultura dorsaisde Tg [GFAP: nGFP] ^mi2004 peixe-zebra que foram expostos à luz intensa constante por 35 h. Também mostram que estas culturas de retina são viáveis para efectuar experiências de imagiologia ao vivo de células, a aquisição de imagens continuamente Z-pilha, através da espessura do explante da retina por até 8 h, usando microscopia multifotônica para monitorar o comportamento migratório das GFAP: células -positivas nGFP . Além disso, descrevemos os detalhes para realizar a análise pós-imagem para determinar a velocidade do INM apical e basal. Para resumir, nós estabelecemos condições para o estudo da dinâmica do INM em um modelo adulto da regeneração neuronal. Isto irá avançar nossa compreensão deste processo celular crucial e nos permitem determinar os mecanismos que controlam INM.

Introdução

Ao contrário dos humanos, peixe-zebra (Danio rerio) apresentam uma resposta regeneração robusta sobre a morte celular dos neurônios da retina ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^4. Factor de necrose tumoral α, uma molécula de sinalização que é libertado a partir de morrer neurónios retinais induz Müller glia residente no basal camada interna Nuclear (INL) da retina, a proliferar ⁵ e produzir células progenitoras neuronais que continuam a proliferar antes de se diferenciar em a célula neuronal tipos que morreram ^{^....}