Artigo de método

Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

DOI:

10.3791/55357

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18 de julho de 2017

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1Department of Gastrointestinal, Thoracic and Vascular Surgery, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 2German Cancer Consortium (DKTK), 3German Cancer Research Center (DKFZ)

Neste artigo

Resumo

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Descrevemos o estabelecimento de tumores colorretais ortotópicos através da injeção de células tumorais ou organoides no ceco de camundongos e o subsequente isolamento de células tumorais circulantes (CTCs) deste modelo.

Resumo

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Apesar das vantagens de uma fácil aplicabilidade e custo-eficácia, os modelos de ratos subcutâneos têm limitações severas e não simulam com precisão a biologia do tumor e a disseminação de células tumorais. Modelos de mouse ortotópicos foram introduzidos para superar essas limitações; No entanto, esses modelos são tecnicamente exigentes, especialmente em órgãos vazios, como o intestino grosso. Para produzir tumores uniformes que crescem e metastatizam de forma confiável, são críticas técnicas padronizadas de preparação e injeção de células tumorais.

Desenvolvemos um modelo de câncer colorretal ortopsico (CRC) que desenvolve tumores altamente uniformes e pode ser utilizado para estudos de biologia tumoral, bem como ensaios terapêuticos. As células tumorais de ambos os tumores primários, linhas celulares bidimensionais (2D) ou organoides tridimensionais (3D) são injetadas no ceco e, dependendo do potencial metastático das células tumorais injetadas, formam tumores altamente metastáticos. Além do que, além do mais,Os CTCs podem ser encontrados regularmente. Aqui descrevemos a técnica de preparação de células tumorais a partir de linhas celulares 2D e organoídeos 3D, bem como tecido tumoral primário, técnicas cirúrgicas e de injeção, bem como o isolamento de CTCs dos camundongos portadores de tumor e dicas atuais para solução de problemas.

Introdução

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O câncer colorretal (CRC) é uma das causas mais comuns de morte por câncer nos países ocidentais. 1 Embora o tumor primário possa ser frequentemente ressecado, a ocorrência de metástases à distância piora dramaticamente o prognóstico e muitas vezes leva à morte. 2 , 3 A correlação biológica da metástase é a circulação de células tumorais (CTCs), que se destacam do tumor, sobrevivem em circulação, se juntam ao epitélio no órgão alvo, invadem o órgão e, finalmente, superam novas lesões. 4 Embora os CTCs sejam de relevância prognóstica, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , sua biologia é parcialmente entendida como resultado de sua extrema raridade no CRC. 10

Os modelos de mouse são um poderoso tOol para estudar vários aspectos da biologia do câncer. Os modelos clássicos de tumor subcutâneo são produzidos por injeção subcutânea de células tumorais em camundongos receptores, que podem ser imunocompetentes (se forem utilizadas células de tumor murino singenésicas) ou imunodeficientes. Os modelos de tumor subcutâneo são baratos e produzem dados rapidamente; Seu crescimento de tumor de ponto final pode ser medido facilmente e não invasivamente. No entanto, 88% dos novos compostos que demonstraram atividade antitumoral em tais modelos falham nos ensaios clínicos. 11 Isto é em parte devido a diferenças entre espécies entre humanos e camundongos; No entanto, uma grande parte dessa falha é devido ao baixo valor preditivo de modelos subcutâneos de mouse.

Os modelos de ratos ortotópicos, nos quais as células tumorais são injetadas no órgão de origem e, portanto, crescem em seu microambiente original, são, portanto, cada vez mais utilizados na pesquisa do câncer. 11 , 12 , 13 , 14 Os modelos ortotópicos não apenas simulam as condições locais de crescimento tumoral; Como resultado do sítio anatômico correto do crescimento tumoral, os modelos de ratos ortotópicos também permitem a simulação realista de metástases e, portanto, são usados ​​para estudar biologia 8 , 15 e 16 de CTC ou sua resposta a diferentes tratamentos em CRC. 13 , 17

Uma grande desvantagem dos modelos de mouse ortotópicos é a sua complexidade técnica. Dependendo do órgão em que as células devem ser injetadas, a curva de aprendizado até que o experimentador seja capaz de induzir tumores reprodutíveis é bastante longa. Isto aplica-se especialmente aos modelos de câncer colorretal, uma vez que as células tumorais precisam ser injetadas na parede intestinal, o que muitas vezes resulta em perfuração, vazamento de células tumorais ou perda de células tumorais endoluminais. Isso é umO artigo pretende descrever o método de preparação celular a partir de amostras de tecido primário, linhas celulares 2D e cultura organo 3D e sua injeção no ceco de camundongos. A técnica descrita aqui leva a tumores altamente uniformes e, dependendo da biologia do tumor da linha celular usada para injeção, a formação reprodutível de metástases à distância e CTC nos camundongos receptores. 15

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Protocolo

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Os experimentos com animais apresentados aqui foram revisados ​​e permitidos de forma independente por um comitê institucional e governamental de Cuidados e Uso de Animais e foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Federação de Associações de Ciências de Animais de Laboratório (FELASA). Todas as medidas possíveis foram tomadas para minimizar o sofrimento, incluindo anestesia e analgesia ou, se necessário, eutanásia prematura.

1. Preparação de células e organismos orgânicos

NOTA: Use um volume de 20 μL com 100.000 células para cada injeção. Use a matriz da membrana basal (BMM) para evitar vazamentos e garantir a injeção padronizada. Para garantir resultados reprodutíveis, realize ensaios de autenticação de linha celular ( por exemplo , via perfil STR) em intervalos regulares.

  1. Preparação de suspensões celulares primárias de tecido fresco
    NOTA: sempre trabalhe em condições estéreis. Transferência imediata do recém-chegadoO tecido ressecado da sala de operação para o laboratório em gelo é necessário para assegurar uma alta viabilidade das células.
    O bem-estar do paciente e o tratamento ideal sempre devem ser a primeira prioridade. Portanto, amostras de tecido para pesquisa devem ser obtidas de maneira que não interfira com o subsequente tratamento patológico e o estadiamento do tumor ressecado. Na maioria dos casos, é razoável ter as amostras para pesquisas obtidas por um patologista treinado para garantir a não interferência no diagnóstico patológico.
    1. Imediatamente após a remoção estéril do espécime ressecado (idealmente ~ 1 cm 3 ), coloque a amostra de tecido em um tubo de 50 mL pré-cheio com 20-30 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Armazene o tubo no gelo e transfira-o imediatamente para o laboratório.
    2. Coloque o tecido em uma placa de Petri e lave-o duas vezes com uma abundância de PBS para remover o sangue restante.
    3. Corte o tecido em pequenos pedaços (~ 2-4 mm) com uma scaLpel ( por exemplo , com uma lâmina # 20 ou # 36).
    4. Use o dissociador de acordo com as instruções do fabricante para dissociar ainda mais o tecido do tumor a uma suspensão de célula única. Alternativamente, use outros protocolos de digestão de tumores enzimáticos.
    5. Contar as células da suspensão de célula única resultante ( por exemplo , em um contador de cunha ou um hemocitómetro).
    6. Centrifugação (5 min a 1.500 xg) e lavar a suspensão celular duas vezes com PBS.
    7. Ressuspender as células no BMM em uma concentração de 5 x 10 6 células / mL e mantê-las em gelo.
  2. Preparação de linhas celulares para injeção
    1. Cultive todas as linhas celulares de câncer colorretal sob condições de cultura padrão (37 ° C, 5% de CO 2 ) e prepará-las no dia da cirurgia.
    2. Colhe as células de acordo com os protocolos de cultura de células padrão, conte as células ( por exemplo , em um contador de cúpula ou um hemocitómetro) e calcule a reqQuantidade estimada para todas as injeções, dependendo do número de animais a serem injetados.
    3. Prepare 3-5x do volume realmente necessário para explicar as perdas de pipetagem e o volume morto da seringa de injeção.
    4. Centrifugação (5 min a 1.500 g) e lavar a suspensão celular duas vezes com PBS.
    5. Ressuspender as células no BMM em uma concentração de 5 x 10 6 células / mL e mantê-las em gelo.
  3. Preparação de orgóides
    NOTA: Todas as culturas de organoides 3D são cultivadas sob condições de cultura padrão (37 ° C, 5% de CO 2 ). Protocolos detalhados para a cultura de organoides foram publicados antes. 18 , 19 , 20 Semelhante às linhas celulares convencionais, recomendamos um volume de 20 μL de BMM com 100.000 células por injeção. Os organoides são preparados no dia da cirurgia da seguinte forma:
    1. Prepare o seguinte meio (no seguintePara DMEM / F12 +++): Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% de glutamina (200 mM) + 1% de penicilina / estreptomicina.
    2. Preencha os tubos de 15 mL com 1 mL de DMEM / F12 +++.
    3. Elimine cuidadosamente os organoides da superfície da placa de cultura e transfira os conteúdos de 3 a 5 poços para um tubo de 15 mL.
    4. Corte cuidadosamente os organoids em pedaços menores, pipetando-os para cima e para baixo com uma pipeta de vidro estendida.
    5. Adicionar 5 mL de DMEM / F12 +++ ao tubo, seguido de centrifugação a 1000 xg durante 5 min.
    6. Após centrifugação, remova o sobrenadante, ressuspenda o sedimento em 600 μL de tampão de dissociação enzimática e transfira a suspensão para um poço de uma placa de 6 poços.
    7. Incubar a 37 ° C durante 1-5 minutos e, em seguida, cuidadosamente pipetar a suspensão para cima e para baixo para dissolver os organoides.
      NOTA: Verifique a digestão através do microscópio; Está completo quando todos os clusters celulares foram dissociadosD para células individuais.
    8. Após a digestão bem sucedida, adicione 1,4 mL de DMEM / F12 +++ para parar a digestão. Em seguida, transferir todos os poços de organoides digeridos para um tubo de 50 mL.
    9. Contar as células e calcular a quantidade necessária para todas as injeções.
    10. Prepare 3 - 5x do volume realmente necessário para contabilizar as perdas de pipetagem e o volume morto da seringa de injeção
    11. Centrifugação (5 min a 1.500 xg) e lavar a suspensão celular duas vezes com PBS.
    12. Ressuspendeu as células em BMM para uma concentração de 5 x 10 6 células / mL e mantê-las em gelo.

2. Orthotopic Mouse Model

  1. Preparação de animais receptores para cirurgia
    NOTA: Use ratos NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) de 6-8 semanas de idade como destinatários. 21 NSG estão entre os camundongos mais imunocomprometidos, sem células maduras B, T e NK, juntamente com múltiplos outros imunes deFects. 21 Eles crescem de forma confiável, mesmo que sejam baixados números de células e sejam altamente propensos a metástases à distância. Os ratos NSG são criadores excelentes e podem ser mantidos em unidades convencionais de patógenos livres (SPF).
    1. Antes da primeira incisão, injete 0,05 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea.
    2. Use sevoflurano em 3-3,5 vol% para anestesia geral. Uma perda do reflexo de pinça do dedo do pé indica anestesia suficiente.
    3. Cubra os olhos dos ratos anestesiados com pomada oftálmica para evitar a dessecação da córnea.
    4. Conduza os camundongos em posição supina numa pequena mesa.
    5. Raspar o abdômen com uma máquina de barbear elétrica (o creme depilatório pode ser usado alternativamente) e desinfectar com pelo menos 3 vezes clorhexidina / iodo e 70% de álcool alternativamente.
    6. Cubra o campo cirúrgico com cortinas estéreis.
      NOTA: O uso de antibióticos perioperatórios é opcional e está sujeito a diretrizes institucionais.
  2. Laparotomia da linha média e exposição do ceco
    1. Use tesoura (os escalpelos podem ser usados ​​alternativamente) para fazer uma pequena incisão da linha média (3 - 5 mm) da pele na parte inferior do abdômen. Pegue a musculatura da parede abdominal com fórceps e cuidadosamente o incise com uma tesoura, abrindo assim a cavidade abdominal.
    2. Identificar e externalizar cuidadosamente o ceco com fórceps atraumáticos. Posicione a bolsa final cega do ceco no abdômen apontando de forma cranial.
    3. Uma vez exteriorizado, mantenha o cecum úmido usando esfregões salinos quentes em todos os momentos.
  3. Injeção ortotópica, fechamento do abdômen e recuperação pós-operatória
    1. Para injeção intracecal, use uma seringa padrão de 1 mL com uma cânula de 30 G. Monte esta seringa em uma bomba de microinjeção, que por sua vez é montada em um micromanipulador.
    2. Cuide cuidadosamente a ponta do ceco com fórceps atraumáticos e suavemente alise-a acariciando-aD com um segundo conjunto de fórceps umedecido com solução salina quente.
    3. Posicione a cânula diretamente acima do ceco.
    4. Execute as seguintes etapas sob controle visual com um microscópio cirúrgico binocular.
    5. Cuide cuidadosamente o ceco com duas pinças atraumáticas em ambas as extremidades da parte exteriorizada do ceco, estique-a ligeiramente e depois puxe-a lentamente sobre a cânula que está posicionada em paralelo e diretamente acima. É crucial não perfurar toda a parede do intestino (assim, injetar as células no lúmen), bem como não perfurar a serosa além do ponto inicial de penetração, pois isso levaria a vazamento e disseminação peritoneal.
      1. Mova o intestino em direção à cânula, não a cânula em direção ao intestino. Segure e estique o intestino entre duas fórceps. As mãos do cirurgião devem descansar sobre uma superfície para reduzir o tremor.
    6. Injetar as células entre a serosa (vista como revestimento muito fino e translúcido acima daE vasos sanguíneos intramurais) e muscularis. Por conseguinte, a cânula deve ser colocada visualmente acima dos vasos sanguíneos e embaixo da fina membrana translúcida.
    7. Use um interruptor de pé para iniciar a injeção para reduzir o tremor enquanto a cânula está dentro da parede do intestino.
    8. Uma vez que a cânula está em posição, comece a injeção. Use uma duração de 20 s, resultando em 1 μL / s de configuração na unidade de controle da bomba.
      NOTA: A injeção dentro ou perto de um vaso sanguíneo danificado conduz a disseminação intravascular direta e metástase à distância e, portanto, deve ser evitada.
    9. Após a conclusão da injeção, remova cuidadosamente a cânula puxando-a para trás.
    10. Coloque um cotonete seco sob o ceco e, em seguida, enxágue completamente o ceco com água destilada para liar células vazias e, assim, evite a disseminação peritoneal artificial.
  4. Encerramento do abdômen e recuperação pós-operatória
    1. Depois deInsistente, gentilmente retorna o ceco à cavidade abdominal.
    2. Feche a parede abdominal com suturas de roda rapidamente absorvíveis de 6-0.
    3. Feche a pele com os clipes da ferida cirúrgica.
    4. Coloque o mouse em um mapa de aquecimento configurado para 38 ° C até se recuperar completamente da anestesia.
    5. Observe de perto a condição pós-operatória dos ratos nas 48 horas seguintes. Em caso de angústia, tratar com 0,05 mg / kg de buprenorfina a cada 12 h.
    6. Monitore os ratos pelo menos uma vez por dia para detectar sinais de angústia devido ao crescimento do tumor.

3. Isolamento de células tumorais circulantes de amostras de sangue inteiro

NOTA: Obtenha sangue por punção cardíaca transcutânea em ratos anestesiados, seguido de eutanásia. Idealmente, 1000 μL de sangue são empurrados para uma seringa pré-cheia com 100 μL de um anticoagulante (ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) ou heparina). Use um anti-humano-EpCAM (adesão de células epiteliaisMolécula) anticorpo para identificar os CTCs. Isso funciona muito bem se as linhas de células epiteliais humanas forem usadas no modelo do mouse. Para outros aparelhos, diferentes anticorpos podem ser necessários.

  1. Enriquecimento de CTC:
    1. Preencha os tubos de 15 mL com meio de gradiente de densidade de 5 mL e transfira cuidadosamente o sangue para o tubo de 15 mL.
    2. Centrifugação (30 min a 300 xg sem freio) e remova cuidadosamente o sobrenadante superior.
    3. Despeje o resto em um novo tubo de 15 mL e centrifugue (15 min, 300 xg com freio).
    4. Recupere a interfase que contém as células mononucleares (descarte o resto) e lave as células duas vezes com PBS.
    5. Ressuspender o sedimento em 200 μL de PBS / 1% de EDTA e adicionar 4 μL de anticorpo EpCAM. Incube 20 min no gelo no escuro.
  2. Triagem e escolha
    1. Prepare o seguinte buffer (a seguir denominado buffer de seleção): PBS + 10% de soro de vitelo fetal (FCS) + 1% de penicilina / STreptomicina (1%) + 0,8% de EDTA.
    2. Use uma caneta PAP para desenhar um círculo de ~ 1 cm em uma placa de Petri estéril de 6 cm (evita que o fluido se disperse no prato) e pipetar 700 μL de tampão de colheita para este círculo.
    3. Adicione 50 μL de suspensão celular ao tampão de picking de 700 μL dentro do círculo. Verifique a densidade das células com o microscópio. Divida a amostra em pratos diferentes se for muito denso.
    4. Aguarde as células se acalmarem (~ 5 min).
    5. Teste a queda da suspensão celular para células coradas (= EpCAM-positivas).
    6. Uma vez que uma célula é encontrada, escolha a célula com o micromanipulador e coloque-a em tampão de 50 μL, dependendo da análise a jusante pretendida ( p . Ex. , Tampão de extração de RNA ou meio de cultura).
    7. Dependendo das análises a jusante pretendidas, isole células e / ou medidores negativos para EpCAM como controles negativos.
    8. Proceda com análises a jusante ( por exemplo , cultura celular, PCR).

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Resultados

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A geração bem sucedida e reprodutível de tumores colorretais neste modelo depende criticamente da injeção precisa das células sem derramamento ou vazamento. Se isso for alcançado, este modelo é extremamente confiável e muito raramente resulta em disseminação peritoneal artificial. A cinética de crescimento dos tumores, bem como os seus padrões de disseminação, dependem da biologia dos organoídeos e células utilizados. 15 Enquanto as células HCT116 apresentam metás...

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Discussão

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Apesar de sua atividade pré-clinicamente comprovada em modelos de ratos subcutâneos, a grande maioria dos novos compostos falha em ensaios clínicos e nunca atinge a clínica. 11 Esta óbvia insuficiência de modelos subcutâneos de ratos para simular com precisão a biologia e os padrões de crescimento dos tumores levou ao desenvolvimento de modelos de ratos ortotópicos baseados na injeção de células tumorais diretamente no órgão original.

Os modelos de ratos ortotópicos s...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Pesquisa Alemã (WE 3548 / 4-1) e Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meios e componentes de cultura celular
Advanced DMEM F12Invitrogen12634010DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M)Life Technologies GmbH15630056DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM)Life Technologies GmbH35050038DMEM/ F12 +++ medium
Penicilina/ Estreptomicina (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122DMEM/ F12 +++ meio
DMEMLife Technologies GmbH61965026meio básico de linhagens celulares 2D (DMEM/10% FCS)
Soro fetal de bezerro (FCS)BIOCHROM AGS 0115meio básico de linhagens celulares 2D (DMEM/10% FCS)
Tampão de dissociação enzimática TrypLE ExpressLife Technologies GmbH12604021
Matriz de membrana basal Matrigel (BMM, sem vermelho de fenol)CORNING B.V. Life Sciences356231
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineLife Technologies GmbH14190169
Tripsina-EDTA (0,25%, Vermelho de fenol)Life Technologies GmbH25200072
placas de 6/48 poços com tampaBalão de cultura de células CORNING3516/3548
75 cm², 250 mLVWR International GmbH734-2066
frasco de cultura de células 150 cm², 600 mLCorning B.V. Life Sciences355001
tubos Eppendorf 1,5 mL / 2 mLSarstedt AG & Co.72.706.400/ 72.695.400
Tubos de centrífuga de 15 mL, 50 mLGreiner-Bio-One GmbH188271/227270
TC10 Lâminas de contagem (para máquina de contagem TC20)Bio-Rad Laboratories GmbH1450016
pipetas Pasteur (vidro, 150 mm)Fisher Scientific GmbH11546963/ FB50251finamente puxadas usando um bico de bunsen
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235para preparação de tecido tumoral primário
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec130-090-753para preparação de tecido tumoral primário
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237para preparação de tecido tumoral
primário Kit de Dissociação de Tumor HumanoMiltenyi Biotec130-095-929para preparação
de tecido tumoral primárioFalcon 70 µ m Cell StrainerCorning BV Life Sciences352350para preparação de tecido tumoral primário
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento cirúrgico
SevofluranoAbbVie Germany GmbH & Co. KG-
Oxigênio médicoAir Liquide Medical GmbH-
BuprenorfinaTemgesic-Bepanthen
- pomada oftálmicaBayer Vital GmbH10047757
Solução salina normal 0,9% (E154)Serumwerk Bernburg AG10013
Aqua ad injectabiliaBraun235144
Seringa de 1 mL (sem volume morto) - Injekt-F SOLOBraun/neoLab194291661
agulha de injeção 30GBECTON DICKINSON304000
swabs de celuloseLohmann & Fórceps Micro-Adson Rauscher Deutschland13356
FST - Ferramentas Fine Science11018-12
Tesoura de Íris - ToughCutFST - Ferramentas Fine Science14058-11
Porta-agulhas Olsen-HegarFST - Ferramentas Fine Science12002-12
Kit AutoClipFST - Ferramentas Fine Science12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (cirúrgico sutura)Johnson & Johnson Medical GmbHZ1012H
Máquina de Anestesia de Pesquisa de Mesa com Descarga de O2 e Vaporizador de SevofluranoBomba Parkland ScientificV3000PS/PK
UltraMicro com ControladorMicro4 Equipamento World Precision InstrumentsUMP3-4para injeção ortotópica altamente controlada
Pedal para Controlador SYS-Micro4World Precision Instruments15867equipamento para injeção ortotópica altamente controlada
Micromanipulador manual de três eixosWorld Precision InstrumentsM325equipamento para injeção ortotópica altamente controlada
Suporte magnético para micromanipuladorWorld Precision InstrumentsEquipamento M10para injeção ortotópica altamente controlada
Placa de base de aço para suporte magnético M10World Precision Instruments5479equipamento para injeção ortotópica altamente controlada
Placa Quente 062Labotect13854
Isis - Barbeador de cabeloAESCULAP - Braun-Microscópio
Cirúrgico BinocularParkland ScientificVS-2Z
NomeEmpresa<strong>Número de CatálogoComentários
Isolamento CTC
EDTARoth8040.1
Gradiente de densidade médio – FicollStemCell - Lymphoprep7801
Alexa Fluor 488 anti-humano CD326 (EpCAM) Anticorpo clone 9C4BioLegend324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Anticorpo clone G8.8BioLegend118210
Placa de Petri, ø 60 x 15 mm, 21 cm², VentGreiner bio-one628102
Microscópio de Cultura de Células de FluorescênciaLeica
Transferman 4r MicromanipuladorEppendorf
CellTram AirEppendorfconectada ao micromanipulador
Dmz Universal Microelectrode ExtratorDagan Corporationnecessária para a fabricação de micro capilares para aspiração de célula única
Prism Glass CapilariesDagan Corporation
Caneta PAPAbcamab2601
Tampão de fosfato de Dulbecco SalinaLife Technologies GmbH14190169tampão de coleta
Soro fetal de bezerro (FCS)BIOCHROM AGS 0115tampão de coleta
Penicilina/Estreptomicina (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122tampão de coleta
EDTARoth8040.1buffer de coleta
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Imunohistoquímica
Clone de anticorpo anti-humano purificado CD326 (EpCAM) 9C4BioLegend324201EpCAM imuno-histoquímica (cf, fig. 2C)
HRP coelho anti-camundongo IgGAbcamab97046EpCAM imuno-histoquímica (cf, fig. 2C)
Bomba de aspiração

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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