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Cancer Research

फैलाना आंतरिक Pontine Glioma की रैपिड पोस्टमार्टम सेल संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल (DIPG)

Published: March 7, 2017 doi: 10.3791/55360
Automatic Translation
1, 2
1Graduate Program in Neuroscience, Department of Neurology, Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 2Departments of Neurology, Neurosurgery, Pathology and Pediatrics, Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल रोगी व्युत्पन्न सेल संस्कृति मॉडल या ट्यूमर और microenvironmental कोशिकाओं के प्रत्यक्ष लक्षण वर्णन की स्थापना के लिए पोस्टमार्टम फैलाना आंतरिक pontine glioma नमूने के तेजी से प्रसंस्करण के लिए एक विधि का वर्णन है।

Abstract

फैलाना आंतरिक Pontine Glioma (DIPG) एक बचपन मस्तिष्क ट्यूमर एक सार्वभौमिक घातक रोग का निदान किया जाता है। क्योंकि शल्य लकीर एक व्यवहार्य उपचार रणनीति नहीं है और बायोप्सी को नियमित नहीं किया जाता है, अनुसंधान के लिए रोगी के नमूने की उपलब्धता सीमित है। नतीजतन, इस बीमारी का अध्ययन करने के प्रयासों के वफादार रोग मॉडल की कमी से चुनौती दी गई है। इस जरूरत को संबोधित करने के लिए, हम यहाँ आदेश है कि इन विट्रो assays में या विवो ओर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता टिकाऊ रोगी व्युत्पन्न सेल संस्कृति मॉडल उत्पन्न करने में पोस्टमार्टम के शव परीक्षण ऊतकों के नमूनों की तेजी से प्रसंस्करण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। इन मॉडलों को संभावित दवा लक्ष्यों के लिए स्क्रीन करने के लिए और DIPG भीतर मौलिक pathobiological प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल आगे का विश्लेषण और जो जीन पूर्व के बाद के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी (FACS), का उपयोग कर ट्यूमर और microenvironmental कोशिकाओं को अलग करने के लिए बढ़ाया जा सकता हैअभिव्यक्ति, प्रोटीन अभिव्यक्ति, या थोक सेल या एकल कोशिका के स्तर पर डीएनए के epigenetic संशोधनों। अंत में, इस प्रोटोकॉल भी अन्य केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में ट्यूमर के लिए रोगी व्युत्पन्न संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

DIPG एक आक्रामक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र द्रोह कि उदर पोंस में उठता है, आम तौर पर बचपन के मध्य 1, 2 के दौरान होता है। क्लिनिकल परीक्षण के दशकों के बावजूद, वर्तमान उपचार रेडियोथेरेपी, जो अस्थायी सुधार या लक्षणों के स्थिरीकरण प्रदान करने के लिए सीमित है और केवल 3 महीने के औसत से मंझला अस्तित्व फैली हुई है। यहाँ तक कि रेडियोथेरेपी के साथ, मंझला समग्र अस्तित्व प्रारंभिक निदान के 2 साल के भीतर इस बीमारी से मरने वाले बच्चों में से 90% के साथ केवल 9 महीने है। ट्यूमर और मस्तिष्क के महत्वपूर्ण कार्यों के infiltrative प्रकृति के कारण, शल्य लकीर संभव नहीं है। इसके अलावा, संयुक्त राज्य अमेरिका में, DIPG के लिए शल्य चिकित्सा बायोप्सी प्राप्त ऐतिहासिक 3, प्रदर्शन नहीं किया गया है के रूप में histopathological विश्लेषण चिकित्सीय उपचार और निदान आम तौर पर अकेले न्यूरोइमेजिंग द्वारा बनाया जा सकता मार्गदर्शन में कोई मौजूदा भूमिका है। इस प्रकार, के ट्यूमर के ऊतक च उपलब्धताया अध्ययन प्रतिबंधित है, उम्मीदवार दवा अणुओं और अंतर्निहित ट्यूमर जीव विज्ञान पर अनुसंधान का संचालन करने के प्रयासों को सीमित। विशेष रूप से, न्यूरोइमेजिंग और स्टीरियोटैक्टिक तकनीक में सुधार के लिए हाल के वर्षों 4, जो है, जब आणविक जीव विज्ञान के क्षेत्र में प्रगति के साथ संयुक्त, इस रोग के बारे में हमारी समझ को बदल दिया है में DIPG की सुरक्षित बायोप्सी के विकास के लिए अनुमति दी है। वर्तमान में, कई चिकित्सीय उपचार की योजना individualizing के लिए अग्रिम बायोप्सी और DIPG की आणविक रूपरेखा का प्रयोग परीक्षणों चल रहे (NCT01182350, NCT02274987) 5 हैं।

DIPG और अन्य बाल चिकित्सा उच्च ग्रेड gliomas उनके वयस्क ग्लियोब्लास्टोमा समकक्षों 6, 7 से अलग रोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और इस प्रकार DIPG के वफादार प्रयोगात्मक मॉडल अपनी अनूठी pathophysiology समझने के लिए आवश्यक हैं और प्रभावी चिकित्सीय रणनीतियों की खोज। हाल के वर्षों में, ध्यान केंद्रित DIPG ट्यूमर टी प्राप्त करने के प्रयासों कोशव परीक्षा के समय में अनुसंधान के लिए मुद्दा या कम सामान्य बायोप्सी के बारे में हमारी समझ और DIPG अध्ययन करने की क्षमता क्रांति ला दी है। जीनोम चौड़ा अनुक्रमण प्रयासों H3 हिस्टोन, परिवार 3 ए (H3F3A) और हिस्टोन क्लस्टर 1, H3B (HIST1H3B), प्रोटीन 8, 9, 10, 11 कोडिंग हिस्टोन में परिवर्तन की वजह से मानव रोग का पहला उदाहरण का प्रतिनिधित्व करने में एक आवर्ती उत्परिवर्तन का पता चला । इसके अलावा, DIPGs के एक सबसेट ACVR1 जीन में परिवर्तन है, जो पहले कैंसर की रिपोर्ट में नहीं किया गया है लेकिन जन्मजात बचपन विकासात्मक विकार fibrodysplasia ossificans progressiva 8, 9, 10, 11 में पाया म्यूटेशन के लिए समान हैं व्यक्त करता है। साथ ही, पहले रोगी व्युत्पन्न DIPG सेल संस्कृतियों और ओर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट मोdels अब 1 स्थापित किया गया है, 2, 12, 13, 14, माउस immunodeficient चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष xenotransplantation के माध्यम से स्थापित मॉडलों सीरियल xenografts उत्पन्न करने के साथ ही 3, 14, 15। प्रारंभिक दवा स्क्रीनिंग इन रोगी व्युत्पन्न मॉडल का उपयोग करने के प्रयासों नैदानिक अनुवाद 4, 14 के लिए होनहार उपन्यास एजेंटों की पहचान की है और कम से कम एक चिकित्सीय परीक्षण (NCT02717455) के लिए नींव रखी है।

प्रगति की दिशा में ये पहला कदम ही शुरुआत कर रहे हैं, और कई रोगी व्युत्पन्न ऊतकों के नमूनों और संस्कृति मॉडल रोग के उपप्रकार को परिभाषित करने और सबसे प्रभावी चिकित्सकीय रणनीति विकसित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा। आनुवंशिक रूप से इंजनDIPG का जुटी माउस मॉडल भी इस बीमारी के बारे में हमारी बुनियादी समझ को आगे बढ़ाने के उद्देश्य से अध्ययन की सुविधा होगी। DIPG के लिए आनुवंशिक मॉडल उत्पन्न करने के लिए किए गए प्रयासों के ऊपर चर्चा की मूलभूत जीनोमिक अध्ययन के द्वारा सहायता प्राप्त हो जाएगा, लेकिन वर्तमान में विकल्पों में से एक सीमित संख्या में उपलब्ध हैं। ऐसा ही एक मॉडल है, जो histologically समान उच्च ग्रेड brainstem gliomas उत्पन्न करता है, नवजात चूहों 5, 16 के पीछे खात में nestin पॉजिटिव कोशिकाओं में PDGF-बी overexpression और Ink4a-आसियान क्षेत्रीय मंच के नुकसान ड्राइव करने के लिए वायरल RCAs / टीवी-एक प्रणाली का उपयोग करता है। एक और दृष्टिकोण मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं है, जो इन कोशिकाओं tumorigenic 6, 7, 17 रेंडर करने के लिए पर्याप्त है से निकाली गई तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं में कई प्रमुख DIPG जुड़े म्यूटेशन (हिस्टोन H3.3 K27M उत्परिवर्तन, P53 घटाने और PDGFRA सक्रियण) recapitulating शामिल है। आनुवंशिक तरीकों और रोगी-deriv का संयोजनएड मॉडल preclinical परीक्षण सक्षम और प्रभावी उपचारों के विकास के आगे होगा।

DIPG अनुसंधान ऊपर विस्तृत करने के लिए चुनौतियों का सामना करने के लिए, यह तेजी से शव परीक्षण प्रोटोकॉल जांच 8, 9, 10, 11, 12, 14 के लिए रोगी व्युत्पन्न सेल संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया था। प्रोटोकॉल ऊतक की व्यवहार्यता की रक्षा और विस्तारित पोस्टमार्टम के अंतराल और परिवहन समय के साथ जुड़े चुनौतियों के बावजूद टिकाऊ संस्कृतियों पैदा करने की संभावना को अधिकतम करने का इरादा है। जब सफलतापूर्वक उत्पन्न, इन DIPG संस्कृतियों बाद में इन विट्रो जोड़तोड़ और इन विवो जेनोग्राफ्ट प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है, रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं पर संभावित चिकित्सीय अणु के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल सभी रोगी डेटा की उचित de-पहचान के साथ हमारे संस्थागत समीक्षा बोर्ड से और मानव कल्याण के लिए सभी, संस्थागत राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुसार अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया है। सभी उचित संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी और इस प्रोटोकॉल के साथ काम करने से पहले रोगी के परिवार से सूचित सहमति प्राप्त करते हैं।

1. ऊतक नमूने प्राप्त करने के

नोट: इस प्रोटोकॉल के एक महत्वपूर्ण घटक शव परीक्षा के समय में तुरंत शुरू ऊतक दान के समुचित से निपटने की आवश्यकता है। समग्र नमूना व्यवहार्यता पोस्टमार्टम अंतराल (पीएमआई) को कम करने के लिए तुरंत एंटीबायोटिक दवाओं / antimycotics के साथ पूरक उचित ठंड माध्यम में ऊतक के हस्तांतरण, परिवहन के दौरान गीला बर्फ पर नमूना रखते हुए, और प्रोटोकॉल भर बाँझ तकनीक को बनाए रखने पर काफी निर्भर करता है।

  1. अधिसूचना परएक आसन्न दान की, एक नमूना संग्रह किट तैयार करते हैं। एक अछूता कंटेनर है कि सीधे ऊतक का नमूना की वापसी के परिवहन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ एक शिपिंग बॉक्स का उपयोग करना, शामिल हैं निम्नलिखित सामग्री:
    1. बाँझ तैयार करने के लिए सामग्री, बाँझ दस्ताने, पर्दे, और नलियां सहित शामिल करें।
    2. बर्फ या ठंडा पैक के साथ अछूता कंटेनर में 30 एमएल शिपिंग मीडिया वाले 10 बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब - 8 को शामिल करें।
      नोट: किसी भी मानक सेल संस्कृति मीडिया काम कर सकते हैं, सबसे अच्छा नमूना व्यवहार्यता हाइबरनेट-ए एंटीबायोटिक / कवकनाशी के साथ पूरक के साथ प्राप्त की है।
    3. अन्य विश्लेषण (जैसे, fixatives) के लिए किसी भी आगे नमूना ट्यूबों को शामिल करें।
    4. शव परीक्षण अन्वेषक की साइट पर प्रदर्शन नहीं किया जाएगा, तो एक दस्तावेज है कि स्पष्ट रूप से कहा गया है कि कैसे ट्यूमर नमूना एकत्र करने के लिए शामिल हैं। इस तरह के मध्यमस्तिष्क और टीयू के रूप में मज्जा से, बाँझपन बनाए रखने गीला बर्फ पर नमूना ट्यूबों रखते हुए, और सहित नमूने के रूप में विवरण शामिलMor कोशिकाओं अक्सर इन क्षेत्रों पर आक्रमण।
  2. शव परीक्षण के दौरान बाँझपन बनाए रखें। मस्तिष्क कपाल अंदर बाँझ पर विचार करें, तो (बदल दस्ताने सहित) एक बार कपाल खुला है बाँझ तकनीक का निरीक्षण करते हैं। त्वचा और बालों के साथ संक्रमण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. उदर की ओर से ट्यूमर काटना (पोंस के "पेट", पूरक चित्रा 1 देखें)। एक बाँझ छुरी के साथ, ट्यूमर से छोटे 1 सेमी मात्रा में कटौती और तुरंत ठंडे शिपिंग मीडिया (कदम 1.1.2 में नोट देखें) में स्थानांतरित और गीला बर्फ पर डाल दिया। ऊतक के 10 एमएल प्रत्येक ट्यूब में रखें, 40 एमएल के प्रत्येक ट्यूब में ऊतक और मीडिया के अंतिम मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप।
    नोट: DIPG के मामले में, ट्यूमर diffusely पोंस और अक्सर मस्तिष्क के बाकी पैठ। पोंस से - (40 एमएल ऊतक 30) और 1 - 4 ट्यूबों - 2 ट्यूब (10 - 20 एमएल ऊतक) प्रत्येक मध्यमस्तिष्क और मज्जा से इस तरह के रूप में, आमतौर पर 3 सहित संभव के रूप में नमूने के रूप में ज्यादा इकट्ठा।
  4. सैम लीजिएमध्यमस्तिष्क और मज्जा से मंदिरों पोंस, जो अक्सर कई ट्यूमर कोशिकाओं को रोकने के लिए juxtaposed।
  5. नमूना संग्रह के बाद, अछूता कंटेनर में नमूने हे / एन गीला बर्फ पर जहाज। सूखी बर्फ पर नमूना जहाज के रूप में ठंड की कोशिकाओं को मारने जाएगा मत करो।

2. नमूना प्रसंस्करण के लिए तैयारी

  1. नमूना तैयार करने शुरू करने से पहले, 1 घंटे के लिए पराबैंगनी प्रकाश के तहत रेज़र ब्लेड, घुमावदार hemostats, और किसी भी अन्य गैर बाँझ उपकरणों के साथ टिशू कल्चर डाकू बाँझ। संस्कृतियों के संक्रमण को रोकने के लिए बाँझ शर्तों के तहत निम्न चरणों में से सभी को पूरा करें।
  2. तैयार है और बाँझ फिल्टर समाधान।
    1. 1.8 मीटर सूक्रोज समाधान तैयार करने के लिए, आसुत जल से 300 एमएल में 308.07 जी सुक्रोज भंग। 50 जोड़े एमएल 10x Hank's बफर खारा समाधान (HbSS) कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना और 500 आसुत जल का उपयोग कर एमएल के लिए कुल मात्रा लाने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    2. एंजाइमी पाचन समाधान तैयार करने के लिए ले 5कैल्शियम और कीमा बनाया हुआ ऊतक के हर 10 एमएल के लिए मैग्नीशियम के साथ 0 एमएल HBSS और 500 μL 5 मिलीग्राम / एमएल deoxyribonuclease मैं (अंतिम एकाग्रता 50 माइक्रोग्राम / एमएल), 500 μL 2.5 मिलीग्राम / एमएल collagenase मैं / द्वितीय और Dispase समाधान (अंतिम एकाग्रता 25 को जोड़ने माइक्रोग्राम / एमएल), और 500 μL 1 एम HEPES बफर। एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में prewarm पाचन समाधान।
    3. ट्यूमर स्टेम मीडिया (एस एम) आधार तैयार करने के लिए, मिश्रण 250 एमएल Neurobasal-ए, 250 एमएल Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम: पोषक तत्व मिश्रण F12 (DMEM / F12), 5 एमएल 100x एंटीबायोटिक कवकनाशी, 5 एमएल 200 मिमी एल alanyl-एल glutamine dipeptide (GlutaMAX-ए), 5 एमएल HEPES बफर, 5 एमएल 100 मिमी सोडियम पाइरूवेट, और 5 एमएल 100x सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है।
    4. विकास के कारकों के साथ पूरा TSM तैयार करने के लिए, टी एस एम आधार करने के लिए निम्नलिखित की खुराक जोड़ें: 50x B27 पूरक विटामिन ए माइनस (1:50), मानव epidermal वृद्धि कारक (एच EGF, 20 एनजी / एमएल), मानव fibroblast वृद्धि कारक (एच FGF, 20 एनजी / एमएल), मानव प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक एए (एच PDGF-एए, 10 एनजी / एमएल),मानव प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक बी बी (एच PDGF-बी बी, 10 एनजी / एमएल), और हेपरिन समाधान (2 माइक्रोग्राम / एमएल)।
  3. एक प्रयोगशाला 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक झूलते बाल्टी रोटर के साथ सुसज्जित सेंट्रीफ्यूज Precool।

3. यांत्रिक हदबंदी

  1. एक उच्च घिरी 100 मिमी x 20 मिमी सेल संस्कृति डिश में ऊतक स्थानांतरण। शिपिंग से मीडिया बचे हुए निकालें और 10 के साथ जगह - 15 एमएल ठंड संस्कृति मीडिया।
  2. घुमावदार hemostats का उपयोग करते हुए एक धार काबू करने के लिए, बारीक ऊतक कीमा, जबकि स्पष्ट रक्त वाहिकाओं या तानिका हटाने।
    नोट: अंतिम ऊतक टुकड़े 1 मिमी की तुलना में छोटा होना चाहिए (देखें चित्रा 1 बी)।
  3. एक साफ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ऊतक स्थानांतरण। एक अतिरिक्त 5 एमएल ठंड संस्कृति मीडिया के साथ सेल संस्कृति डिश धो और शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण। शेष ऊतक हस्तांतरण करने के लिए इस धोने कदम के रूप में आवश्यक दोहराएँ।
  4. (- 5 बार 4) एक 10 एमएल सीरम वैज्ञानिक pipet का प्रयोग, धीरे triturate। बड़ा Tiss की अनुमति देंUE टुकड़े ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए। यदि आवश्यक हो, संक्षेप में 1 मिनट (350 XG, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए नमूना अपकेंद्रित्र।
  5. यंत्रवत् अलग अंश लीजिए।
    1. तैरनेवाला निकालें और एक 100 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर लेबल एक नया 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में "यांत्रिक हदबंदी।" मूल शंक्वाकार ट्यूब पर फिल्टर पलटना और ऊतक टुकड़े ठीक करने के लिए संस्कृति मीडिया से धो लें।
    2. 5 मिनट (350 XG, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए "यांत्रिक हदबंदी" अंश अपकेंद्रित्र।
    3. pelleted "यांत्रिक हदबंदी" अंश से सतह पर तैरनेवाला निकालें और ठंड संस्कृति मीडिया में ऊतक resuspend। अगर वहाँ है "यांत्रिक हदबंदी" शंक्वाकार ट्यूब में ऊतक के अधिक से अधिक 5 एमएल, अन्य 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ऊतक कि इस तरह की कोई ट्यूब अधिक से अधिक 5 एमएल ऊतक है विभाजित।
  6. बर्फ पर यंत्रवत् अलग अंश स्टोर सूक्रोज ढाल centrifugation चरण तक (स्टेपी 5)। वैकल्पिक रूप से, यंत्रवत् अलग अंश एंजाइमी हदबंदी ऊष्मायन अवधि (चरण 4.4) के दौरान 5 चरण के लिए आगे बढ़ सकते हैं।

4. enzymatic पृथक्करण

  1. अगर वहाँ शेष बड़ा ऊतक टुकड़े युक्त ट्यूब में ऊतक के अधिक से अधिक 5 एमएल है, अन्य नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ऊतक विभाजित ऐसी है कि कोई ट्यूब अधिक से अधिक 5 एमएल ऊतक है।
  2. शंक्वाकार ट्यूब (s) 5 मिनट (350 XG, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए शेष ऊतक टुकड़े युक्त अपकेंद्रित्र।
  3. तैरनेवाला निकालें और prewarmed enzymatic पाचन समाधान जोड़ने, ऐसी है कि वहाँ हर 1 एमएल ऊतक के लिए 5 एमएल पाचन समाधान (जैसे, 5 एमएल ऊतक के लिए 25 एमएल पाचन समाधान)।
  4. प्रयोगशाला फिल्म के साथ शंक्वाकार ट्यूब पलकों को सील करने और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर प्रतिक्रिया सेते हैं।
  5. ऊष्मायन के बाद, धीरे नमूने triturate (देखें चित्र 1 सी)।
    1. एक 10 एमएल सीरम वैज्ञानिक pipet का प्रयोग,pipet नमूना ऊपर और नीचे 6 - 8 बार। अत्यधिक हवा के बुलबुले पैदा करने से बचें।
    2. pipet के अंत तक 1,000 μL pipet टिप जोड़ें और एक अतिरिक्त 6 triturate - 8 बार।
    3. किसी भी शेष हिस्सा ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें। निकालें और कोशिकाओं को अभी भी लेबल "enzymatic पृथक्करण" एक नया 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एक 100 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निलंबित साथ सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर और बर्फ पर दुकान।
    4. अगर महत्वपूर्ण ऊतक टुकड़े बने हुए हैं, कैल्शियम और मैग्नीशियम टुकड़े करने के साथ एक अतिरिक्त 10 एमएल HBSS जोड़ने और दोहराने 3.5.1 और 3.5.2 कदम। "Enzymatic पृथक्करण" ट्यूब में एक 100 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से इस अंतिम समाधान फ़िल्टर।
  6. 5 मिनट (350 XG, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए "enzymatic पृथक्करण" ट्यूब अपकेंद्रित्र और सुक्रोज ढाल centrifugation जारी है।

5. सुक्रोज ढाल centrifugation

  1. नमूने अभी भी समाधान, Centrifu में निलंबित कर रहे हैं5 मिनट (350 XG, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए जीई।
  2. कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना 20 एमएल ठंड HBSS में सतह पर तैरनेवाला और resuspend ऊतक निकालें। ठंड HBSS के साथ 25 एमएल की कुल करने के लिए खंड को ले आओ।
  3. धीरे-धीरे 25 एमएल 1.8 मीटर सूक्रोज समाधान जोड़ने और ट्यूब मिश्रण करने के लिए पलटना। यह एक 0.9 मीटर सूक्रोज ढाल में यह परिणाम है।
  4. 10 मिनट (800 XG, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए कोई ब्रेक के साथ अपकेंद्रित्र। एक centrifugation ब्रेक का उपयोग ढाल बाधित और उपज कम हो जाएगा (पहले और centrifugation के बाद एक नमूना का एक उदाहरण के लिए चित्रा -1 देखें)।
  5. ध्यान से माइलिन मलबे और जितना संभव हो उतना सूक्रोज समाधान aspirate। कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना 30 एमएल ठंड HBSS जोड़ने और धीरे मिश्रण से नमूना धो लें। 5 मिनट (350 XG, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए अपकेंद्रित्र।

6. एसीके लाल रक्त सेल

  1. धोने सतह पर तैरनेवाला निकालें। 5 एमएल एसीके lysis बफर जोड़ें और धीरे सेल गोली resuspend, आरटी पर 1 मिनट के लिए ट्यूब घूमता।
  2. एल बुझानाकैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना 30 एमएल ठंड HBSS जोड़कर विश्लेषण।
  3. 5 मिनट (350 XG, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए अपकेंद्रित्र।

7. प्रारंभिक संस्कृति रखरखाव

  1. विकास के कारकों के साथ गर्म पूरा टी एस एम 15 एमएल और एक hemocytometer trypan नीले बहिष्कार का उपयोग करने पर व्यवहार्य सेल घनत्व यों - 10 में अंतिम सेल छर्रों Resuspend।
    नोट: व्यवहार्य कोशिकाओं की सीमा व्यापक रूप से ऊतक दान की परिस्थितियों पर निर्भर करता है, और मात्रा का ठहराव बचे हुए सेलुलर मलबे के कारण इस प्रारंभिक चरण में मुश्किल हो सकता है। आदर्श मामले में, नमूना प्रति एक लाख जीवित कोशिकाओं है करना है। मामलों में जहां अत्यधिक मलबे रहता है, एक T175 फ्लास्क में एक कम घनत्व पर थाली में।
  2. एक नए T75 संस्कृति फ्लास्क अंतिम सेल निलंबन स्थानांतरण। अतिरिक्त वृद्धि कारकों में स्पाइक समग्र विकास कारक स्तर को बनाए रखने, और ट्यूमर सेल neurospheres के विकास के लिए नजर रखने के लिए हर दूसरे दिन (चित्रा 1E और चित्रा 2 देखें)।
  3. वैकल्पिक रूप से, प्रक्रिया फ्लो और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई सहित आगे के विश्लेषण के लिए enzymatically अलग कोशिकाओं।
  4. neurospheres के विकास (जो औसतन 3 लेता है - 4 सप्ताह है, लेकिन के रूप में लंबे समय के रूप में 2 महीने के लिए कुछ दिनों से चलता है) के बाद, फिल्टर नमूना एक 100 माइक्रोन नायलॉन जाल फिल्टर का उपयोग मलबे की मात्रा को कम करने के लिए रिवर्स।
    ध्यान दें: छानना व्यवहार्य एकल कक्षों या छोटे क्षेत्रों मौजूद हैं मामले में संस्कृति में बनाए रखा जाना चाहिए।
  5. है, जबकि passaging प्रारंभिक रोगी के नमूने की तुलना में डीएनए फिंगरप्रिंटिंग प्रदर्शन से ईमानदारी और संस्कृति की पवित्रता सुनिश्चित करें।

Representative Results

प्रोटोकॉल वर्णित चित्र 1 में प्रसंस्करण के विभिन्न चरणों में ऊतक की छवियों के साथ एक पांच कदम कार्यप्रवाह के रूप में संक्षेप है। नमूना पहले तेजी से बाँझ शव परीक्षा के माध्यम से प्राप्त की है। यांत्रिक हदबंदी के दौरान, जबकि नमूना से रक्त वाहिकाओं और तानिका हटाने ऊतक कीमा बनाया हुआ, और एक 100 माइक्रोन नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है। शेष ऊतक टुकड़े enzymatically एक वार्मिंग ओवन में अलग कर रहे हैं। अगले, मलबे सूक्रोज ढाल centrifugation के माध्यम से कम हो जाता है, नमूना से माइलिन का एक अलग परत अलग। इसके अलावा, एसीके सेल दिख नमूने में मौजूद लाल रक्त कोशिकाओं की मात्रा कम कर देता। अंत में, कोशिकाओं में वृद्धि कारकों के साथ पूरक सीरम मुक्त मीडिया में चढ़ाया जाता है।

पूरक चित्रा 1 शव परीक्षण पर ट्यूमर का एक उदाहरण है। ट्यूमर पोंस एक के एक फैलाना घुसपैठ के रूप में बढ़ता हैडी मस्तिष्क के आसपास के क्षेत्रों के। नमूना तैयारी के दौरान, छोटे ~ 1 सेमी एक्स 1 सेमी हिस्सा कटौती की जानी चाहिए और तुरंत बर्फ पर ठंड शिपिंग मीडिया में रखा।

चित्रा 2 कैसे नमूने संवर्धन के प्रारंभिक दौर से एक टिकाऊ संस्कृति को प्रदर्शित कर सकते हैं के विभिन्न उदाहरणों से पता चलता है। प्रारंभ में चढ़ाया और जल्दी संस्कृतियों (ए, बी) अक्सर कई जीवित कोशिकाओं को रोकने के लिए नहीं दिखाई देते। इसके अलावा, जल्दी सेल समूहों (सी, डी) अक्सर आम तौर पर neurospheres के साथ जुड़े विपरीत की डिग्री प्रदर्शन नहीं करते। विशेष रूप से, संस्कृति में सेल समूहों की उपस्थिति से पहले समय की अवधि एक दो महीने के लिए सप्ताह लग सकते हैं। हालांकि, इन सेल समूहों के प्रारंभिक मार्ग, सेल समूहों के रिवर्स छानने के साथ संयुक्त, स्वस्थ ट्यूमर कोशिकाओं कि क्षेत्रों (एफ) के रूप में करने में सक्षम हैं अलग कर सकते हैं। छानना (ई) आम तौर पर बचे हुए मलबे होता है; हालांकि, हम चढ़ाना सलाह देते हैं और छानना को बनाए रखने के लिए निगरानी और सेल समूहों का विकास। ये रोगी व्युत्पन्न नमूने तो कई मार्ग (जी, एच) के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है।

चित्रा 3 चूहों में xenografted होने के लिए इन कोशिकाओं की क्षमता को दर्शाता है। इन मामलों में से प्रत्येक में, DIPG कोशिकाओं bioluminescence (ए) के माध्यम से ट्यूमर के विकास की निगरानी के लिए एक GFP-luciferase पत्रकार के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। ट्यूमर भी उदाहरण ट्यूमर engraftment (बी) या विशिष्ट मार्कर (सी) की अभिव्यक्ति का निरीक्षण करने के लिए histologically की जांच की जा सकती है। इन विवो मॉडल, इन विट्रो assays के साथ संयुक्त विभिन्न दवाओं या जीन जोड़तोड़ के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, 8, 9, 10, 11, 14)।

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चित्रा 1. प्रसंस्करण के विभिन्न चरणों में ऊतकों के नमूनों। (ए) बाँझ शव परीक्षण प्रक्रियाओं और गीला बर्फ पर रातोंरात शिपिंग के माध्यम से नमूना प्राप्त करते हैं। (बी) बाएं से दाएं: (पंक्ति 1) शिपिंग मीडिया में ट्यूमर के ऊतक युक्त ट्यूबों; एक 100 मिमी x 20 मिमी सेल संस्कृति डिश में ताजा ऊतक; ऊतक के प्रारंभिक नख़रेबाज़; (पंक्ति 2) आंशिक रूप से कीमा बनाया हुआ ऊतक; तानिका और रक्त वाहिकाओं को हटाने; कीमा बनाया हुआ ऊतक के टुकड़े के अंतिम आकार। (सी) बाएं से दाएं: (पंक्ति 1) ऊतक एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में एक घूर्णन मेज पर incubated; (पंक्ति 2) एक 1000 μL pipet एक 10 एमएल pipet से जुड़ी टिप के माध्यम से ऊतक के विचूर्णन; एक 100 माइक्रोन नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से अलग ऊतक के छानने। (डी) बाएं से दाएं: ऊतक centrifugation से पहले 0.9 एम sucrose के समाधान में निलंबित अलग; अलग ऊतक centrifugation के बाद एक सूक्रोज ढाल भर में अलग; एक दृश्य परत ओसुक्रोज ढाल के शीर्ष पर च माइलिन मलबे; एसीके सेल और धोने के बाद एक अंतिम सेल गोली। (ई) अंतिम नमूना संस्कृति में रखा जा सकता है या अन्य बहाव के विश्लेषण में इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
2. प्राथमिक संस्कृतियों और जल्दी पारित होने कोशिकाओं की छवियों चित्रा। (ए - बी) संस्कृतियों हदबंदी के बाद तुरंत चढ़ाया (SU-DIPG-XXX, ए), या कि अभी तक उगाया neurospheres नहीं किया है (SU-DIPG-XXIX, बी)। (सी - डी) SU-DIPG-XXVIII (सी) और एसयू DIPG-XXIX (डी) के प्राथमिक संस्कृतियों में neurospheres के प्रारंभिक उपस्थिति। (एफई) डी से प्राथमिक संस्कृति एक 100 माइक्रोन नायलॉन फिल्टर का उपयोग करने के पहले पारित होने, फाई के साथltrate (ई) और रिवर्स छानना (एफ) चढ़ाया। (G - एच) SU-DIPG-XXVII (G) और SU-DIPG-XXV (एच) के तीसरे पारित होने के पहले पारित होने से परिपक्व neurospheres संस्कृति में बढ़ रहा है। स्केल बार = 200 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. रोगी व्युत्पन्न सेल संस्कृतियों टीका लगाना और चूहे में पर्चा ट्यूमर सकते हैं। एक GFP-luciferase रिपोर्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट चार अलग-अलग रोगी व्युत्पन्न सेल संस्कृतियों के (ए) Bioluminescence छवियों। (बी) के एक माउस जेनोग्राफ्ट से बाण अनुभाग, ट्यूमर कोशिकाओं माउस पोंस में engrafted दिखा। ग्रीन: GFP, लाल: माइलिन बुनियादी प्रोटीन। स्केल बार = 1 मिमी। (सी) उदाहरण immunofluoresGFP ट्यूमर कोशिकाओं को एक माउस मस्तिष्क में engrafted दिखा cence छवि। ब्लू: DAPI, ग्रीन: GFP, लाल: IGF2R। स्केल बार = 40 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1. एक Pontine ट्यूमर का पोस्टमार्टम नमूना। एक फैलाना आंतरिक pontine glioma का तत्काल पोस्टमार्टम उपस्थिति। ट्यूमर पोंस के उदर सतह पर एक बड़े, माइलिन युक्त जन के रूप में प्रकट होता है। इस छवि को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस प्रोटोकॉल पोस्टमार्टम ट्यूमर के ऊतक दान के तेजी से प्रसंस्करण रोगी व्युत्पन्न सेल संस्कृतियों को विकसित करने की है, जो इन विट्रो की एक किस्म में या विवो प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए एक विधि का वर्णन है। शव परीक्षण के लिए नमूने के साथ काम की प्रकृति के कारण, नमूना व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती बन गया है। कई कारकों का योगदान, पोस्टमार्टम के अंतराल शव परीक्षण करने के लिए या समय के ऊतकों के परिवहन के लिए आवश्यक भी शामिल हैं, जितना संभव हो उतना कम किया जाना चाहिए लेकिन अक्सर नियंत्रित करने के लिए मेहनत कर रहे हैं। हमारे अनुभव, कम से कम 6 के एक पोस्टमार्टम के अंतराल में - 8 h (समय है कि ऊतक बर्फ के ठंडे शिपिंग और परिवहन मीडिया में रखा गया है करने के लिए मृत्यु के समय से) एक टिकाऊ सेल संस्कृति की स्थापना का सबसे अच्छा मौका प्राप्त हुए है। यह सबसे अच्छा है तो 24 घंटे के भीतर प्रयोगशाला में ऊतक प्राप्त करते हैं, और संस्कृति के लिए इसे तुरंत प्रोसेस करने के लिए प्राप्त होने पर।

चूंकि इन दुर्लभ मामलों का स्थान है, व्यापक रूप से भिन्न होता है औरऊतक पुनः प्राप्ति के कदम की गुणवत्ता जोरदार सफलता की संभावना को प्रभावित करता है, शव परीक्षा प्रदर्शन की रसद चुनौतीपूर्ण हो सकता है। कई मामलों में, क्रम में 6-8 घंटे की समय सीमा को प्राप्त करने के लिए यह संभव नहीं एक शैक्षिक केंद्र में ऊतक फसल आचरण है। इसके बजाय, एक आईआरबी अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत अंतिम संस्कार के घर में ट्यूमर के ऊतक ठीक करने के लिए फोन पर एक ऊतक वसूली सेवा के बाद अक्सर ऊतक वसूली के लिए और अधिक समीचीन है। मौत के अग्रिम में सूचित सहमति प्राप्त करने की सिफारिश की और सैन्य योजना बनाने की सुविधा है। स्पष्ट और पूरी तरह से निर्देश और ऊतक पुनर्प्राप्ति (दस्ताने, पर्दे, नलियां) के लिए बाँझ आपूर्ति के साथ आत्म निहित शव परीक्षण किट तैयारी पुरजोर सिफारिश की है। इसके अतिरिक्त, अन्वेषक, पैथोलॉजिस्ट, और अंतिम संस्कार के घर के बीच संचार के स्पष्ट अंक की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, अन्वेषक से पहले शव परीक्षण के लिए पैथोलॉजिस्ट के साथ प्रोटोकॉल पर चर्चा और आम त्रुटियों को उजागर करना चाहिए। इन त्रुटियों को सूक्ष्म शामिलBial संदूषण (आमतौर पर खमीर) ऊतक पुनः प्राप्ति, रात भर / तेजी लाई शिपिंग और एक thermoinsulated कंटेनर में पर्याप्त गीला बर्फ पर नमूना जहाज करने के लिए विफलता के माध्यम से जहाज करने के लिए विफलता के दौरान। अंत में, हम नमूने के लदान के लिए एक दरवाजे से दरवाजा कूरियर सेवा का उपयोग परिवहन के समय को कम करने के लिए सलाह देते हैं।

जॉब भी सेल व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए ऊतक हदबंदी के दौरान लिया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए उपयुक्त, मीडिया के उपयोग के परिवहन के लिए तंत्रिका ऊतक स्वास्थ्य की रक्षा करने के लिए (हाइबरनेट-ए के साथ पूरक कवकनाशी एंटीबायोटिक /) एक सफल संस्कृति पैदा करने की संभावना बढ़ जाएगी। यह भी हमेशा बर्फ पर नमूने के हस्तांतरण से प्रोटोकॉल भर में एक ठंडे तापमान पर नमूना रखने के लिए महत्वपूर्ण है। विचूर्णन को न्यूनतम प्रोटोकॉल सफलता में सुधार कर सकते हैं, के रूप में दोनों चरणों की कोशिकाओं के लिए दर्दनाक हैं के साथ-साथ दोनों यांत्रिक और enzymatic हदबंदी अंशों एकत्रित। हमारे अनुभव में, सबसे सफल संस्कृतियों दोनों भागों से बाहर हो जाना, जबकि, हम उदाहरण हैं जहां दो की तैयारियों का केवल एक एक टिकाऊ संस्कृति की स्थापना की है, संभवतः इन नमूनों के नाजुक प्रकृति को दर्शाती पड़ा है। प्रोटोकॉल में एक और दर्दनाक कदम विचूर्णन है; एक रणनीति है कि आवश्यक विचूर्णन की डिग्री को कम कर सकते हैं सुनिश्चित करने के लिए नमूनों को अच्छी तरह से तैयारी के बहुत शुरुआत में कीमा बनाया जाता है। नमूना व्यवहार्यता को बेहतर बनाया प्रोटोकॉल के पहलुओं के अन्य उदाहरण जोड़ने बफ़र्स (जैसे, HEPES) प्रोटोकॉल है, जो एंजाइमी हदबंदी के दौरान विशेष रूप से महत्वपूर्ण है भर में शामिल हैं।

इस प्रोटोकॉल आगे सेल व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए एक संभावित संशोधन एसीके लाल रक्त सेल कदम को हटाने की है। हालांकि, इस मामले में, यह अक्सर तब आवश्यक लाल रक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए संस्कृति में प्रारंभिक सप्ताह के दौरान एक एसीके सेल कदम प्रदर्शन करने के लिए है। इस प्रोटोकॉल है कि संशोधित किया जा सकता का एक अन्य पहलू एक सुक्रोज densit का उपयोग कर माइलिन और सेलुलर मलबे का उन्मूलन हैY ढाल। विशेष रूप से, अन्य रणनीति है कि microglial कोशिकाओं के सेल व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए सूचित किया गया है यह भी संभव है इस कदम पर, इस तरह के एक असंतत Percoll घनत्व ढाल 18 या चुंबकीय माइलिन हटाने मोती के रूप में कर रहे हैं।

अंत में, प्रारंभिक ऊतक हदबंदी और neurospheres की उपस्थिति के बीच की अवधि के नमूने के बीच होती है और एक महीने या अधिक करने के लिए एक सप्ताह से कहीं भी ले जा सकते हैं। चूंकि प्रारंभिक संस्कृतियों आम तौर पर मृत कोशिकाओं और सेलुलर मलबे का एक महत्वपूर्ण डिग्री होते हैं, यह निर्धारित करने के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं रहने के लिए कि क्या चुनौतीपूर्ण हो सकता है; 8 सप्ताह (चित्रा 2) - संस्कृति में कम से कम 4 के लिए बनाए रखा जाना चाहिए। शेष मलबे यहां प्रस्तुत किया है से बढ़ कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए एक रणनीति (यानी ताजा मीडिया में सेल समूहों और फिर से चढ़ाना छानने रिवर्स)। क्या एक संस्कृति को बनाए रखने के लिए जारी करने के बारे में निर्णय अंततः आसपास वें कारकों पर आधारित एक मामला-दर-मामला निर्णय हैई शव परीक्षा (जैसे, एक लंबे समय तक पोस्टमार्टम के अंतराल, ऊतक परिवहन के दौरान मुद्दों), ऊतक हदबंदी (जैसे, अत्यधिक रक्त या मलबे), और कैसे नमूना संस्कृति में प्रकट होता है। एक बार एक संस्कृति की स्थापना की है, पहचान लघु मिलकर दोहराने विश्लेषण या एक समान विधि का उपयोग डीएनए फिंगरप्रिंटिंग द्वारा मान्य किया जाना चाहिए, इस उद्देश्य के लिए बनाए रखा मूल ट्यूमर का एक नमूना संस्कृति की तुलना। 6 महीने - हम नियमित रूप से हर 3 डीएनए फिंगरप्रिंटिंग द्वारा संस्कृतियों मान्य करने की सिफारिश सुनिश्चित करने के लिए कि अन्य संस्कृतियों के द्वारा कोई संदूषण हुआ है, उदाहरण के लिए।

इन रोगी व्युत्पन्न DIPG संस्कृतियों की पीढ़ी के प्रभावी उपचार के सफल विकास में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है। उपलब्ध रोगी व्युत्पन्न DIPG संस्कृतियों और xenograft मॉडल के विस्तार के सबसे प्रभावी चिकित्सीय रणनीतियों की पहचान करने और अंततः इस घातक बीमारी पर काबू पाने के लिए महत्वपूर्ण होगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों कृतज्ञता McKenna क्लेयर फाउंडेशन, मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक (NINDS K08NS070926 और R01NS092597) के राष्ट्रीय संस्थान से समर्थन स्वीकार करते हैं, रक्षा विभाग (NF140075), पुनर्योजी चिकित्सा (सीआईआरएम RB4-06093 और RN3-06510), एलेक्स नींबू पानी के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट स्टैंड फाउंडेशन, इलाज शुरू होता है अब फाउंडेशन और DIPG सहयोगात्मक, लायला Nsouli फाउंडेशन, सुलझाना बाल चिकित्सा कर्क, बचपन ब्रेन ट्यूमर फाउंडेशन, मैथ्यू लार्सन फाउंडेशन, वी फाउंडेशन, गॉडफ्रे परिवार फंड फियोना पेनेलोप, वेलैंड Villars DIPG फाउंडेशन, डायलन Jewett की स्मृति में , बाल चिकित्सा में धक्का देकर जॉनसन, Zoey गणेश, डायलन फ्रिक, अबीगैल जेन्सेन, और जेनिफर Kranz मेमोरियल फंड, N8 फाउंडेशन, वर्जीनिया और कैंसर अनुसंधान के लिए डीके लुडविग फंड, स्टैनफोर्ड ऐनी टी पर बाल स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान और रॉबर्ट एम बास संपन्न संकाय छात्रवृत्ति कैंसर और रक्त रोगों।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hibernate-A Gibco A12475-01
HBSS with Calcium/Magnesium Gibco 24020-117
HBSS Corning 21-022-CV
HEPES Gibco 15630-080
Liberase DH (Collagenase/Dispase) Roche 5401054001
DNAse I Worthington Biochemical LS002007
Sucrose Sigma S0389
Antibiotic/Antimycotic Gibco 15240-096
Neurobasal-A Gibco 10888-022
DMEM/F12 Gibco 11330-032
GlutaMAX-I (100x) Gibco 35050-061
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
B27 Supplement Minus Vitamin A Gibco 12587-010
MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Gibco 11140-050
Human PDGF-AA Shenandoah Biotechnology 100-16
Human PDGF-BB Shenandoah Biotechnology 100-18
Human EGF Shenandoah Biotechnology 100-26
Human FGF Shenandoah Biotechnology 100-146
Sterile scalpel blades Bard Paker 372610
Curved hemostats Fine Science Tools 13013-14
Razor blades VWR 55411-050
100 x 20 mm cell culture dish Corning 353003
Sterile forceps TWD Tradewinds DF8988-5
Sterile drapes 3M 2037
Sterile gloves Kimberly Clark 1182307
ACK Lysis Buffer Gibco A1049201
100 micron mesh filter Fisher 352360
50 mL conical tube Fisher 1495949A

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References

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कैंसर रिसर्च अंक 121 DIPG glioma रोगी व्युत्पन्न सेल संस्कृति तेजी से शव परीक्षण मस्तिष्क ऊतक हदबंदी कैंसर
फैलाना आंतरिक Pontine Glioma की रैपिड पोस्टमार्टम सेल संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल (DIPG)
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Lin, G. L., Monje, M. A Protocol for … More

Lin, G. L., Monje, M. A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG). J. Vis. Exp. (121), e55360, doi:10.3791/55360 (2017).

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