Um protocolo para a Cultura rápidos post-mortem celular de Difuso Intrínseca Pontine glioma (DIPG)

O objetivo geral deste protocolo rápido de cultura de células post-mortem é gerar culturas de células derivadas de pacientes duráveis de glioma pontino intrínseco difuso para facilitar os experimentos necessários para entender e, finalmente, desenvolver terapias eficazes para DIPG. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a biologia fundamental e as estratégias terapêuticas para o glioma pontino intrínseco difuso, como se certos medicamentos funcionam em diferentes culturas derivadas de pacientes. A principal vantagem desta técnica é que ela permite o estudo direto da biologia das células derivadas do paciente.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia para DIPG, pois permite o teste de diferentes estratégias terapêuticas em diferentes subtipos genéticos da doença. Embora esse método possa fornecer informações sobre o DIPG, ele também pode ser aplicado a outras doenças, como outros gliomas pediátricos de alto grau, glioblastomas adultos ou outros tumores do sistema nervoso central. Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldades, porque é difícil obter e processar rapidamente amostras de autópsia de maneira eficiente.

Antes da preparação da amostra, esterilize a capa de cultura de tecidos, juntamente com lâminas de barbear, hemostáticos curvos e outras ferramentas não estéreis sob luz ultravioleta por uma hora e execute todas as etapas a seguir em condições estéreis. Em seguida, transfira o tecido para uma placa de cultura de células de paredes altas de 100 milímetros por 20 milímetros. Remova o meio que sobrou do transporte e substitua-o por 10 a 15 mililitros de meio de cultura a frio.

Em seguida, usando os hemostáticos curvos para segurar uma lâmina de barbear, pique o tecido finamente enquanto remove os vasos sanguíneos ou meninges. Os fragmentos finais de tecido devem ser menores que um milímetro. Depois, transfira o tecido para um tubo cônico limpo de 50 mililitros.

Lave a placa de cultura de células com mais cinco mililitros de meio de cultura a frio e transfira a amostra para o tubo cônico. Repita esta etapa de lavagem conforme necessário para transferir o tecido restante. Usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros, triture a amostra suavemente por quatro a cinco vezes.

Permita que fragmentos de tecido maiores se depositem no fundo do tubo. Se necessário, centrifugue brevemente a amostra durante um minuto. Para coletar a fração dissociada, remova o sobrenadante e o filtrado através de um filtro de 100 mícrons em um novo tubo cônico de 50 mililitros denominado Dissociação Mecânica.

Inverter o filtro sobre o tubo cónico original e lavá-lo com meios de cultura para recuperar os fragmentos de tecido. Em seguida, centrifugar a fração de dissociação mecânica durante cinco minutos. Em seguida, remover o sobrenadante da fracção de dissociação mecânica peletizada e ressuspender o tecido em meios de cultura a frio.

Se houver mais de cinco mililitros de tecido no tubo cônico de dissociação mecânica, divida o tecido em outros tubos cônicos de 50 mililitros, de modo que nenhum tubo tenha mais de cinco mililitros de tecido. Em seguida, conservar a fracção dissociada mecanicamente no gelo até à fase de centrifugação do gradiente de sacarose. Neste procedimento, centrifugue o tubo cónico que contém os fragmentos de tecido remanescentes durante cinco minutos.

Depois disso, remova o sobrenadante e adicione a solução de digestão enzimática pré-aquecida, de modo que haja cinco mililitros de solução de digestão para cada mililitro de tecido. Em seguida, sele a tampa do tubo cônico com filme de laboratório e incube a reação em um rotador a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, triturar as amostras suavemente.

Usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros, pipete a amostra para cima e para baixo de seis a oito vezes e evite gerar bolhas de ar excessivas. Em seguida, adicione uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros ao final da pipeta e triture a amostra por mais seis a oito vezes. Deixe que os pedaços restantes se depositem no fundo do tubo.

Em seguida, remova e filtre o sobrenadante com as células ainda suspensas através de um filtro de 100 mícrons em um novo tubo cônico de 50 mililitros denominado Dissociação Enzimática e armazene-o no gelo. Em seguida, centrifugue o tubo de dissociação enzimática por cinco minutos e continue a centrifugação com gradiente de sacarose. Se a amostra ainda estiver suspensa em solução, centrifugue-a durante cinco minutos.

Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o tecido em 20 mililitros de HBSS frio sem cálcio e magnésio. Em seguida, aumente o volume para 25 mililitros com HBSS frio. Adicione lentamente 25 mililitros de solução de sacarose 1,8 molar e inverta o tubo para misturar.

Isso resulta em um gradiente de sacarose molar de 0,9. Em seguida, centrifugue a amostra sem interrupção por 10 minutos. Aspire cuidadosamente os detritos de mielina no máximo possível de solução de sacarose e sacarose.

Em seguida, lave a amostra adicionando 30 mililitros de HBSS frio sem cálcio e magnésio e misturando delicadamente. Depois disso, centrifugue por cinco minutos. Neste procedimento, remova o sobrenadante de lavagem.

Adicione cinco mililitros de tampão de lise ACK e ressuspenda suavemente o pellet celular, girando o tubo por um minuto em temperatura ambiente. Em seguida, sacie a lise adicionando 30 mililitros de HBSS frio sem cálcio e magnésio. Em seguida, centrifugue por cinco minutos.

Ressuspenda o pellet celular final em 10 a 15 mililitros de TSM completo quente com fatores de crescimento e quantifique a densidade celular viável em um hemocitômetro, usando a exclusão de azul de tripano. Em seguida, transferir a suspensão final das células para um novo balão de cultura T75. Adicione fatores de crescimento adicionais a cada dois dias para manter os níveis gerais de fator de crescimento e monitore o desenvolvimento de neuroesferas de células tumorais.

Aqui estão vários exemplos de como as amostras podem aparecer desde os estágios iniciais de cultura até uma cultura durável. Inicialmente, as culturas plaqueadas e precoces geralmente não parecem conter muitas células sobreviventes. Além disso, os primeiros aglomerados de células geralmente não exibem o grau de contraste tipicamente associado às neuroesferas.

No entanto, a passagem inicial desses aglomerados de células, combinada com a filtragem reversa de aglomerados de células, pode isolar células tumorais saudáveis que são capazes de formar esferas. O filtrado normalmente contém restos de detritos. Essas amostras derivadas de pacientes podem então ser mantidas em cultura por várias passagens.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a quatro horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante garantir que a amostra seja mantida em temperatura fria em todas as etapas, exceto a dissociação enzimática, e minimizar o manuseio traumático da amostra. Após esse procedimento, estudos adicionais podem ser realizados, como triagem de drogas in vitro ou xenoenxerto ortotópico, para responder a perguntas subsequentes sobre a patobiologia do DIPG.

Após seu desenvolvimento, essa técnica de cultura abriu caminho para pesquisadores no campo da neuro-oncologia pediátrica explorarem novos caminhos terapêuticos para crianças com DIPG. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como realizar protocolos rápidos de cultura de células post-mortem em amostras de tumores cerebrais. Não se esqueça de que trabalhar com tecido humano pode ser perigoso, e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual e técnicas estéreis, devem sempre ser utilizadas.