Name: Um protocolo para a Cultura rápidos post-mortem celular de Difuso Intrínseca Pontine glioma (DIPG) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda a cultura rápida pós-morte de células de glioma intrínseco difuso da ponte para estudar biologia tumoral e testar estratégias terapêuticas em modelos derivados de pacientes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem o apoio da Claire Foundation McKenna, Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NINDS K08NS070926 e R01NS092597), Departamento de Defesa (NF140075), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM RB4-06093 e RN3-06510), Alex Lemonade Fique Foundation, The Cure Starts Now Foundation e DIPG Collaborative, Lyla Nsouli Foundation, Unravel Oncologia Pediátrica, Tumor Fundação Infância Cérebro, Matthew Larson Foundation, Fundação V, Fundo da família de Godfrey em memória de Fiona Penelope, o DIPG Fundação Wayland Villars, o Dylan Jewett , Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, e Jennifer Fundos Memorial Kranz, Fundação N8, Virginia e do Fundo Ludwig DK for Cancer Research, criança Health Research Institute da Universidade de Stanford Anne T. e Robert M. Bass Endowed Faculdade de bolsas em Pediatric cancerosas e de sangue doenças.

Este protocolo foi realizada com a aprovação do nosso conselho de revisão institucional com adequada de-identificação de todos os dados do paciente e de acordo com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. Obter toda a aprovação apropriada Institutional Review Board e consentimento informado de família do paciente antes de trabalhar com este protocolo. 1. obtenção de amostras de tecido NOTA: Um elemento fundamental deste protocolo exige um tratamento adequado da doação do tecido começando imediatamente no momento da autópsia. A viabilidade global da amostra depende significativamente minimizando o intervalo pós-morte (PMI), imediatamente a transferência do tecido no meio frio apropriado suplementado com antibióticos / antimicóticos, mantendo a amostra em gelo húmido durante todo o transporte e manutenção técnica estéril durante todo o protocolo. <ol><li> Após a notificaçãode uma doação iminente, preparar um kit de coleta de amostra. Usando uma caixa de transporte com um recipiente isolado que pode ser usado diretamente para o transporte de retorno da amostra de tecido, incluir os seguintes materiais: <ol><li> Incluem materiais para preparação estéril, incluindo luvas estéreis, cortinas e bisturis. </li><li> Incluir 8 - 10 estéreis de 50 mL tubos cônicos contendo 30 meios de transporte ml no recipiente isolado com gelo ou compressas frias. NOTA: Embora qualquer meio de cultura de células padrão pode trabalhar, a melhor viabilidade amostra é obtida com Hibernate-A suplementado com antibiótico / antimicótico. </li><li> Incluem quaisquer tubos de amostra para outras análises (por exemplo, fixadores). </li><li> Se a autópsia não será realizada no local do investigador, incluir um documento que indique claramente a forma de recolher a amostra de tumor. Isto inclui detalhes tais como a manutenção da esterilidade, mantendo os tubos de amostra em gelo molhado, e incluindo amostras do mesencéfalo e medula como TUmor células muitas vezes invadem essas regiões. </li></ol></li><li> Manter a esterilidade durante a autópsia. Considere o cérebro estéril dentro do crânio, por isso observar uma técnica estéril (incluindo mudança luvas) uma vez que o crânio é aberto. Evitar contaminação com a pele e o cabelo é crítica. </li><li> Dissecar o tumor a partir do lado ventral (o &quot;ventre&quot; da ponte, ver Suplementar Figura 1). Com um bisturi estéril, cortar pequenos pedaços 1 cm do tumor e transferir imediatamente para o meio de transporte a frio (ver nota no passo 1.1.2) e colocar em gelo molhado. Colocar 10 ml de tecido a cada tubo, resultando num volume final de tecido e meios de comunicação em cada tubo de 40 ml. NOTA: No caso de DIPG, o tumor difusamente infiltra ponte e frequentemente o resto do tronco cerebral. Como tal, recolher o máximo da amostra quanto possível, tipicamente incluindo 3 - 4 tubos (30 - 40 ml) de tecido de ponte e 1 - 2 tubos (10 - 20 ml cada) de tecido de mesencéfalo e medula. </li><li> Recolha sampios do mesencéfalo e medula justaposta à ponte, que muitas vezes contêm muitas células tumorais. </li><li> Após a coleta da amostra, enviar as amostras O / N sobre gelo molhado no recipiente isolado. Não envie a amostra em gelo seco, como congelamento vai matar as células. </li></ol> 2. Preparação para o processamento da amostra <ol><li> Antes do início da preparação da amostra, esterilizar capuzes de cultura de tecidos juntamente com lâminas de barbear, pinças hemostáticas curvas, e quaisquer outros instrumentos não esterilizados sob luz UV durante 1 h. Executar todas as etapas seguintes, em condições estéreis para evitar contaminação das culturas. </li><li> Preparar e soluções de filtros estéreis. <ol><li> Para preparar a solução 1,8 M de sacarose, dissolve-se 308,07 g de sacarose em 300 ml de água destilada. Adicionar 50 ml de 10x Hank&#39;s-tamponada Solução Salina (HBSS) sem magnésio ou cálcio e perfazer o volume total a 500 mL com água destilada. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Para preparar solução de digestão enzimática, tome 50 mL de HBSS com cálcio e magnésio para cada 10 mL de tecido moído e adicionar 500 mL de 5 mg / mL de desoxirribonuclease I (concentração final de 50 ug / ml), 500 ul de 2,5 mg / colagenase ml I / II e solução de dispase (concentração final 25 ug / ml), e 500 mL de 1 M de tampão HEPES. solução de digestão Pré-aquecer num banho de água a 37 ° C. </li><li> Para preparar meios base do caule do tumor (TSM), misturar 250 ml Neurobasal-A, Modified Eagle Médium da 250 mL Dulbecco: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), 5 mL de 100 x antibiótico-antimicótico, 5 mL de 200 mM de L-alanil-L- dipéptido glutamina (GlutaMAX-A), 5 mL de tampão de HEPES, 5 mL de piruvato de sódio 100 mM, e 5 mL de 100 x MEM aminoácidos não essenciais. </li><li> Para preparar completa TSM com fatores de crescimento, adicione os seguintes suplementos para a base TSM: 50x B27 Suplemento Minus vitamina A (1:50), fator de crescimento epidérmico humano (H-EGF, 20 ng / mL), fator de crescimento de fibroblastos humanos (H- FGF, 20 ng / mL), AA humano derivado de plaquetas do factor de Crescimento (H-FCDP-AA, 10 ng / mL),humano derivado de plaquetas BB do Factor de Crescimento (H-FCDP-BB, 10 ng / mL), e solução de heparina (2 ug / mL). </li></ol></li><li> Pré-arref ecimento de uma centrifugadora de laboratório equipado com um rotor de balde a 4 ° C. </li></ol> 3. mecânica dissociação <ol><li> Transferir o tecido em um prato de paredes alta-100 mm x 20 milímetros de cultura de células. Remover restos de mídia a partir de transporte e substituir por 10 - 15 mL meio de cultura frio. </li><li> Usando as hemostats curvas para agarrar uma lâmina de barbear, mediu o tecido finamente ao remover os vasos sanguíneos óbvios ou meninges. NOTA: Os fragmentos de tecido finais deve ser inferior a 1 mm (ver Figura 1B). </li><li> Transferir o tecido para um tubo cónico limpo de 50 mL. Lave o prato de cultura de células com um 5 ml de meio de cultura frio adicionais e transferir para o tubo cônico. Repita este passo de lavagem, conforme necessário para transferir o tecido restante. </li><li> Usando uma pipeta serológica 10 mL, triturar suavemente (4 - 5 vezes). Permitir TISS maioresfragmentos ue a depositar-se no fundo do tubo. Se necessário, Centrifugar brevemente a amostra durante 1 min (350 xg, 4 ° C). </li><li> Recolher a fracção dissociado mecanicamente. <ol><li> Remover o sobrenadante e filtra-se através de um filtro de 100 um para um novo tubo cónico de 50 ml rotulados &quot;mecânica dissociação.&quot; Inverter o filtro sobre o tubo cónico original e lava-se com meio de cultura para recuperar os fragmentos de tecido. </li><li> Centrifugar a fracção &quot;mecânica dissociação&quot; durante 5 min (350 xg, 4 ° C). </li><li> Remover o sobrenadante a partir da fracção sedimentada &quot;mecânica dissociação&quot; e ressuspender o tecido em meio de cultura frio. Se houver mais do que 5 ml de tecido na &quot;mecânica dissociação&quot; tubo cónico, dividir o tecido em outros tubos cónicos de 50 mL de tal modo que nenhum tubo tem mais do que 5 ml de tecido. </li></ol></li><li> Armazenar a fracção dissociado mecanicamente em gelo até que o passo de centrifugação em gradiente de sacarose (SteP 5). Alternativamente, a fração mecanicamente dissociado pode prosseguir para a Etapa 5 durante o período de incubação de dissociação enzimática (Passo 4.4). </li></ol> 4. enzimática dissociação <ol><li> Se houver mais do que 5 ml de tecido no tubo contendo os restantes fragmentos de tecido maiores, dividir o tecido em outros novos tubos de 50 mL cónico de tal modo que nenhum tubo tem mais do que 5 ml de tecido. </li><li> Centrifuga-se o tubo (s) cónico que contém os fragmentos de tecido restantes, durante 5 min (350 xg, 4 ° C). </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar a solução de digestão enzimática pré-aquecida, de tal modo que há 5 mL de solução de digestão de cada tecido 1 ml (por exemplo, 25 mL de solução de digestão de 5 mL de tecidos). </li><li> Selar as tampas tubo cónico com filme de laboratório e incubar a reacção num rotor a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Após a incubação, as amostras de triturar suavemente (ver Figura 1C). <ol><li> Usando uma pipeta serológica 10 mL,pipeta a amostra cima e para baixo 6 - 8 vezes. Evitar a geração de bolhas de ar em excesso. </li><li> Adicionar uma ponta de pipeta 1000 uL à extremidade da pipeta e tritura-se um adicional de 6 - 8 vezes. </li><li> Permitir que qualquer pedaços restantes para assentar no fundo do tubo. Remover o sobrenadante e filtra-se com as células ainda em suspensão através de um filtro de 100 um para um novo tubo cónico de 50 ml rotulados &quot;dissociação enzimática&quot; e armazenar em gelo. </li><li> Se fragmentos de tecido significativos permanecem, adicione um adicional de 10 mL HBSS com cálcio e magnésio para os fragmentos e repita os passos 3.5.1 e 3.5.2. Filtrar esta solução final através de um filtro de 100 um para o tubo &quot;dissociação enzimática&quot;. </li></ol></li><li> Centrifuga-se o tubo de &quot;dissociação enzimática&quot; durante 5 min (350 xg, 4 ° C) e continuar a centrifugação em gradiente de sacarose. </li></ol> 5. centrifugação em gradiente de sacarose <ol><li> Se as amostras ainda estão suspensas na solução, centrifuGE durante 5 min (350 xg, 4 ° C). </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o tecido em 20 ml de HBSS fria, sem cálcio e magnésio. Levar o volume até 25 mL total, com HBSS frio. </li><li> Lentamente, adicionar mL 1,8 M solução a 25 sacarose e inverter o tubo para misturar. Isso resulta em um gradiente de 0,9 M de sacarose. </li><li> Centrifugar sem travão durante 10 min (800 xg, 4 ° C). Usando um travão de centrifugação vai perturbar o gradiente e reduzir o rendimento (ver Figura 1D para um exemplo de uma amostra antes e após a centrifugação). </li><li> Cuidadosamente aspirar detritos de mielina e, tanto quanto possível solução de sacarose. Lava-se a amostra por adição de 30 ml de HBSS fria, sem cálcio e magnésio e misturando suavemente. Centrifugar durante 5 min (350 xg, 4 ° C). </li></ol> A lise celular 6. ACK Red Blood <ol><li> Remover o sobrenadante de lavagem. Adicionar 5 mL de tampão de lise ACK suavemente e ressuspender o sedimento de células, rodando o tubo durante 1 min à temperatura ambiente. </li><li> Extingue-se a lysis por adição de 30 ml de HBSS fria, sem cálcio e magnésio. </li><li> Centrifugar durante 5 min (350 xg, 4 ° C). </li></ol> 7. Cultura de manutenção inicial <ol><li> Ressuspender as pelotas de células final em 10 - 15 mL quente TSM completa com fatores de crescimento e quantificar a densidade de células viáveis ​​num hemocitómetro utilizando exclusão com azul de tripano. NOTA: O intervalo de células viáveis ​​varia muito, dependendo das circunstâncias da doação do tecido, e quantificação pode ser difícil nesta fase inicial devido aos restos celulares restante. Em um caso ideal, ter o objectivo de um milhão de células vivas por amostra. Em casos onde os detritos excessivos permanece, em placas a uma densidade inferior num frasco T175. </li><li> Transferir as suspensões de células final para um novo frasco de cultura T75. Pico em factores de crescimento adicionais cada outro dia para manter os níveis gerais de factores de crescimento, e para monitorizar o desenvolvimento de neuroesferas de células tumorais (ver Figura 1E e Figura 2). </li><li>Alternativamente, as células de processo enzimaticamente dissociada para análise posterior, incluindo citometria de fluxo e classificação de células activada por fluorescência. </li><li> Após o desenvolvimento das neuroesferas (que leva em média 3 - 4 semanas, mas varia de poucos dias para tão longo como dois meses), inverter o filtro de amostra usando um filtro de malha de nylon de 100 fim de reduzir a quantidade de detritos. NOTA: O filtrado devem ser mantidas em cultura em caso de células individuais viáveis ​​ou pequenas esferas estão presentes. </li><li> Garantir a integridade e a pureza da cultura através da realização de impressões digitais de DNA enquanto passaging, em comparação com a amostra inicial do paciente. </li></ol>

<ol><li>Fisher, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinicopathologic+reappraisal+of+brain+stem+tumor+classification.+Identification+of+pilocystic+astrocytoma+and+fibrillary+astrocytoma+as+distinct+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities.</a> Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).</li>
<li>Johung, T. B., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma%3A+New+Pathophysiological+Insights+and+Emerging+Therapeutic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic.</a> Curr. Neuropharmacol. , (2016).</li>
<li>Cage, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility%2C+safety%2C+and+indications+for+surgical+biopsy+of+intrinsic+brainstem+tumors+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children.</a> Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).</li>
<li>Puget, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopsy+in+a+series+of+130+pediatric+diffuse+intrinsic+Pontine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas.</a> Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).</li>
<li>Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+rethink+the+unthinkable%3A+Upfront+biopsy+of+children+with+newly+diagnosed+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+%28DIPG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Blood+Cancer%22%5BJournal%5D)">Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG).</a> Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).</li>
<li>Sturm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paediatric+and+adult+glioblastoma%3A+multiform+%28epi%29genomic+culprits+emerge%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge.</a> Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).</li>
<li>Jones, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+genetic+and+epigenetic+mechanisms+driving+paediatric+diffuse+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma.</a> Nat. Rev. Cancer. , (2014).</li>
<li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).</li>
<li>Wu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+landscape+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+and+pediatric+non-brainstem+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma.</a> Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).</li>
<li>Fontebasso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+somatic+mutations+in+ACVR1+in+pediatric+midline+high-grade+astrocytoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma.</a> Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).</li>
<li>Buczkowicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+diffuse+intrinsic+pontine+gliomas+identifies+three+molecular+subgroups+and+recurrent+activating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating.</a> Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).</li>
<li>Monje, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-responsive+candidate+cell+of+origin+for+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).</li>
<li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+xenograft+mouse+model+of+diffuse+pontine+glioma+designed+for+therapeutic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuro-Oncol%22%5BJournal%5D)">An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing.</a> J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).</li>
<li>Grasso, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+defined+therapeutic+targets+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nat. Med. , 1-10 (2015).</li>
<li>Shu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Orthotopic+Transplantation+of+Fresh+Surgical+Specimen+Preserves+CD133+%2BTumor+Cells+in+Clinically+Relevant+Mouse+Models+of+Medulloblastoma+and+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma.</a> Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).</li>
<li>Becher, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+radiation+and+perifosine+in+a+genetically+and+histologically+accurate+model+of+brainstem+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma.</a> Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).</li>
<li>Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+embryonic+stem+cells+to+model+pediatric+gliomas+with+H3.3K27M+histone+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation.</a> Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).</li>
<li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve um método para o rápido processamento de post-mortem doações de tecido de tumor para o desenvolvimento de culturas de células derivadas do paciente, que pode ser usada em uma variedade de ensaios in vitro ou in vivo. Devido à natureza de trabalhar com amostras de autópsia, mantendo a viabilidade da amostra representa um desafio significativo. Vários factores contribuem, incluindo o intervalo post mortem a autópsia ou o tempo necessário para o transporte do tecido, deve ser minimizado tanto quanto possível, mas muitas vezes são difíceis de controlar. Em nossa experiência, um intervalo pós-morte de menos de 6 - 8 h (desde o momento da morte até a hora que o tecido é colocado em transporte gelada e meios de transporte) rendeu a melhor chance de criar uma cultura de células durável. É melhor, então, receber o tecido no laboratório dentro de 24 h, e processá-lo para a cultura imediatamente após o recebimento. Uma vez que a localização desses casos raros varia amplamente, ea qualidade da etapa de recuperação do tecido afecta fortemente a chance de sucesso, a logística de realizar a autópsia pode ser um desafio. Em muitos casos, a fim de atingir o período de tempo de 6-8 horas, não é viável para realizar a colheita de tecido num centro académico. Em vez disso, ter um serviço de recuperação de tecidos na chamada para recuperar o tecido do tumor na casa funerária no âmbito de um protocolo IRB-aprovado é muitas vezes mais conveniente para a recuperação de tecidos. Obtenção do consentimento informado antes da morte é recomendada e facilita o planejamento logístico. Preparar kits de autópsia independentes com instruções claras e completas e suprimentos estéreis para a recuperação do tecido (luvas, cortinas, bisturis) é fortemente recomendado. Além disso, o estabelecimento de pontos claras de comunicação entre o investigador, patologista, e funerária é crítica. Por exemplo, o investigador deve discutir o protocolo com o patologista antes da autópsia e destacar erros comuns. Esses erros incluem microcontaminação Bial (geralmente levedura) durante a recuperação de tecidos, insuficiência de escoar pela expedição e falha para enviar a amostra em gelo húmido suficiente em um recipiente thermoinsulated durante a noite / acelerada. Finalmente, recomendamos o uso de um serviço de correio porta-a-porta para a expedição da amostra para minimizar o tempo de transporte. Cuidados também devem ser tomados durante a dissociação de tecidos para preservar a viabilidade celular. Por exemplo, o uso dos meios de comunicação concebido para preservar a saúde do tecido neural para o transporte (Hibernate-A suplementado com antibiótico / antimicótico) irá aumentar a chance de gerar uma cultura de sucesso. É também importante para manter a amostra a uma temperatura fria durante todo o protocolo de transferência sempre as amostras em gelo. Coleta de ambas as frações de dissociação mecânicos e enzimáticos, juntamente com minimizando trituração pode melhorar o sucesso do protocolo, como ambos os passos são traumáticas para as células. Em nossa experiência, enquanto a maioria das culturas bem sucedidas crescer fora de ambas as fracções, Tivemos casos em que apenas uma das duas preparações estabelecidas uma cultura durável, potencialmente, reflectindo a natureza delicada destas amostras. Outro passo traumática no protocolo é a trituração; uma estratégia que pode reduzir o grau de trituração é necessário para assegurar que as amostras são cuidadosamente triturada no início da preparação. Outros exemplos de aspectos do protocolo concebido para melhorar a viabilidade da amostra incluem tampões (por exemplo, adicionando, HEPES) ao longo do protocolo, o que é especialmente crítico durante a dissociação enzimática. Uma possível modificação do presente protocolo para aumentar ainda mais a viabilidade das células é a remoção da etapa de lise de glóbulos vermelhos ACK. No entanto, neste caso, muitas vezes é então necessário efectuar uma etapa de lise ACK durante a primeira semana de cultura para eliminar as células vermelhas do sangue. Outro aspecto deste protocolo que pode ser modificado é a eliminação de mielina e detritos celulares usando uma densit sacarosegradiente y. Especificamente, outras estratégias que foram relatadas para melhorar a viabilidade celular de células microgliais também são possíveis nesta fase, tal como um gradiente descontínuo de Percoll 18 ou pérolas magnéticas de remoção da mielina. Finalmente, a duração de dissociação entre o tecido inicial e o aparecimento de neuroesferas varia entre amostras e pode levar de uma semana a um mês ou mais. Uma vez que as culturas iniciais contêm tipicamente um grau significativo de células mortas e detritos celulares, pode ser um desafio para determinar se as células viáveis ​​permanecem; a cultura deve ser mantida durante pelo menos 4 - 8 semanas (Figura 2). Uma estratégia para isolar as células que crescem a partir do resíduo restante é aqui apresentado (ie reverter filtragem grupos de células e re-plaqueamento em meio fresco). A decisão sobre se deve continuar a manter uma cultura é em última instância uma decisão caso a caso com base em fatores que cercam the autópsia (por exemplo, um prolongamento do intervalo post-mortem, os problemas durante o transporte do tecido), a dissociação de tecidos (por exemplo, sangue ou detritos excessivos), e como o exemplo aparece na cultura. Uma vez que uma cultura é estabelecida, a identidade deve ser validado por fingerprinting de DNA por meio de análise de repetições em cadeia curta ou um método semelhante, comparando a cultura de uma amostra do tumor original retido para esta finalidade. Recomendamos rotineiramente validar culturas por impressões digitais de DNA para assegurar que nenhuma contaminação por outras culturas ocorreu, por exemplo, a cada 3 - 6 meses. A geração dessas culturas DIPG derivados de paciente representa um passo importante no desenvolvimento bem sucedido de terapias eficazes. A expansão dos modelos de culturas DIPG derivado do paciente e de xenotransplante disponíveis será fundamental para identificar as estratégias terapêuticas mais eficazes e, finalmente, superar esta doença devastadora.

DIPG é uma doença maligna nervoso central agressivo sistema que surge na ponte ventral, normalmente em meados de infância 1, 2. Apesar de décadas de ensaios clínicos, o tratamento corrente é limitada a radioterapia, o que proporciona uma melhoria temporária ou estabilização dos sintomas e só prolonga a sobrevivência mediana por uma média de 3 meses. Mesmo com a radioterapia, a sobrevida global mediana é de apenas 9 meses, com 90% das crianças que morrem da doença no prazo de 2 anos após o diagnóstico inicial. Devido à natureza infiltrante do tumor e as funções críticas do tronco cerebral, a ressecção cirúrgica não é possível. Além disso, nos Estados Unidos, a obtenção de biópsias cirúrgicas para DIPG não tem historicamente sido realizada 3, como análise histopatológica não tem nenhum papel corrente na orientação do tratamento clínico e diagnóstico pode tipicamente ser feita por neuroimagens sozinho. Assim, a disponibilidade de tecido de tumor fou o estudo é restrito, limitando os esforços para realizar pesquisas sobre as moléculas da droga candidatos e a biologia do tumor subjacente. Notavelmente, melhorias nas técnicas de neuroimagem e estereotaxia, têm permitido o desenvolvimento de biópsias seguros de DIPG nos últimos anos 4, que, quando combinado com avanços na biologia molecular, têm transformado nossa compreensão da doença. Atualmente, vários estudos clínicos com biópsia inicial e perfil molecular de DIPG para a individualização de planos de tratamento estão em curso (NCT01182350, NCT02274987) 5. DIPG e outros gliomas de alto grau pediátricos representam doenças distintas de seus colegas de adultos com glioblastoma 6, 7 e modelos experimentais, assim, fiéis de DIPG são necessários para entender sua fisiopatologia única e descobrir estratégias terapêuticas eficazes. Nos últimos anos, concentrou esforços para obter tumor DIPG tproblema para a investigação no momento da autópsia ou, menos comumente, a biópsia revolucionaram a nossa compreensão e capacidade de estudar DIPG. Esforços de sequenciamento de todo o genoma revelou uma mutação recorrente na histona H3, 3A família (H3F3A) e cluster de histonas 1, H3b (HIST1H3B), o que representa o primeiro exemplo de doença humana causada por mutações no histona de codificação de proteínas 8, 9, 10, 11 . Além disso, um subconjunto de DIPGs expressa mutações no gene ACVR1, que não tenham sido previamente reportados em câncer, mas são idênticas às mutações encontradas no congênita infância developmental disorder fibrodisplasia ossificante progressiva 8, 9, 10, 11. Assim, as primeiras culturas de células DIPG derivadas de pacientes e mo xenotransplante ortotópicodels agora foram estabelecidos 1, 2, 12, 13, 14, bem como modelos de ratinho estabelecidas através do xenotransplante directa de células tumorais em ratinhos imunodeficientes para gerar os xenoenxertos de série 3, 14, 15. Esforços de pesquisa de fármacos iniciais utilizando esses modelos derivados do paciente identificaram novos agentes promissores para a tradução clínica 4, 14 e lançaram as bases para pelo menos um ensaio clínico (NCT02717455). Estes primeiros passos no sentido do progresso são apenas o começo, e numerosas amostras de tecido derivadas de pacientes e modelos de cultura será necessário definir os subtipos da doença e desenvolver as estratégias terapêuticas mais eficazes. geneticamente motormodelos de rato recer de DIPG também facilitará estudos destinados a aprofundar a nossa compreensão básica da doença. Os esforços feitos para gerar modelos genéticos para DIPG será auxiliado pelos estudos genômicos fundamentais discutidos acima, mas, actualmente, um número limitado de opções estão disponíveis. Um tal modelo, o que gera os gliomas do tronco cerebral de alto grau histologicamente semelhantes, utiliza o viral RCAS / televisão de um sistema para dirigir a sobre-expressão de PDGF-B e perda INK4A-IRA em células nestina-positivas na fossa posterior de ratinhos neonatais 5, 16. Outra abordagem envolve recapitulando vários grandes mutações associadas à DIPG (mutação K27M histona H3.3, perda de p53 e ativação PDGFRA) em células precursoras neurais derivadas de células-tronco embrionárias humanas, o que é suficiente para tornar essas células tumorigénicas 6, 7, 17. A combinação de métodos genéticos e paciente-derivmodelos ed permitirá testes pré-clínicos e promover o desenvolvimento de terapias eficazes. Para enfrentar os desafios à investigação DIPG detalhado acima, este protocolo de autópsia rápida foi desenvolvido para gerar culturas de células derivadas de pacientes para investigação 8, 9, 10, 11, 12, 14. O protocolo destina-se a proteger a viabilidade do tecido e maximizar a probabilidade de gerar culturas duráveis, apesar dos desafios associados com intervalos post mortem estendidos e tempo de transporte. Quando gerado com êxito, estas culturas DIPG pode ser usado em subsequentes manipulações in vitro e em experiências de xenoenxerto in vivo, permitindo a avaliação de potenciais moléculas terapêuticas sobre as células derivadas do paciente.

<table><tbody><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS com Cálcio/Magnésio</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH (Colagenose/Dispase)</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico/Antimicótico</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27 Menos Vitamina A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos Não Essenciais (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Humano PDGF-AA</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-16</td><td></td></tr><tr><td>Humano PDGF-BB</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-18</td><td></td></tr><tr><td>Humano EGF</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Humano FGF</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-146</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi estéreis</td><td>Bard Paker</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Hemostáticos curvos</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 100 x 20 mm</td><td></td> Pinça estéril <td>Corning</td> 353003 <td></td></tr><tr><td>TWD</td><td>Tradewinds</td><td>DF8988-5</td><td></td></tr><tr><td>Campos estéreis</td><td>3M</td><td>2037</td><td></td></tr><tr><td>Luvas estéreis</td><td>Kimberly Clark</td><td>1182307</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysis Buffer</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de malha de 100 mícrons</td><td>Fisher</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td><td>Fisher</td><td>1495949A</td><td></td></tr></tbody></table>

um protocolo para a cultura rápidos post-mortem celular de difuso intrínseca pontine glioma (dipg)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Difusa Intrínseca Pontine glioma (DIPG) é um tumor do tronco cerebral na infância que carrega um prognóstico universalmente fatal. Porque a ressecção cirúrgica não é uma estratégia terapêutica viável e biópsia não é rotineiramente realizado, a disponibilidade de amostras de doentes para a pesquisa é limitado. Consequentemente, os esforços para estudar esta doença foram desafiados por uma escassez de modelos de doenças fiéis. Para endereçar esta necessidade, descrevemos aqui um protocolo para o rápido processamento de amostras de tecido da autópsia post mortem, a fim de gerar modelos de cultura de células derivadas de pacientes duráveis que podem ser utilizados em ensaios in vitro ou in vivo de xenoenxertos de experiências ortotópicos. Estes modelos podem ser utilizados para pesquisar potenciais alvos de drogas e estudar processos pathobiological fundamentais dentro DIPG. Este protocolo pode ainda ser estendido para isolar e analisar as células tumorais e usando microambiente celular activada por fluorescência (FACS), que permite a análise subsequente do gene expression, a expressão da proteína, ou modificações epigenéticas do DNA na célula granel ou nível de uma única célula. Finalmente, este protocolo pode também ser adaptado para gerar culturas derivadas de pacientes de outros tumores do sistema nervoso central.

O protocolo descrito pode ser resumido como um fluxo de trabalho de cinco passos com imagens de tecido em vários estágios de processamento da Figura 1. A amostra é primeiramente obtida através de rápida autópsia estéril. Durante a dissociação mecânica, o tecido é triturado durante a remoção das meninges e vasos sanguíneos a partir da amostra, e filtrou-se através de um filtro de malha de nylon de 100 um. Os restantes fragmentos de tecido são enzimaticamente dissociada em um forno de aquecimento. Em seguida, os resíduos são reduzidos através de centrifugação em gradiente de sacarose, o isolamento de uma camada distinta da mielina a partir da amostra. Além disso, a lise ACK reduz visivelmente a quantidade de glóbulos vermelhos presentes na amostra. Finalmente, as células são plaqueadas em meio isento de soro suplementado com factores de crescimento. Suplementar Figura 1 é um exemplo do tumor após autópsia. O tumor cresce como uma infiltração difusa da uma ponted as regiões adjacentes do tronco cerebral. Durante as preparações de amostra, pequenos pedaços de ~ 1 cm x 1 cm deve ser cortado e colocado imediatamente em meios de transporte de água fria em gelo. A Figura 2 mostra diversos exemplos de como as amostras podem aparecer a partir das fases iniciais de cultura de uma cultura durável. Inicialmente chapeado e culturas primitivas (A, B) muitas vezes não parecem conter muitas células sobreviventes. Além disso, agrupamentos de células precoces (C, D), muitas vezes não exibem o grau de contraste tipicamente associados com neuroesferas. Notavelmente, a duração de tempo em cultura antes do aparecimento de agregados de células pode levar semanas a alguns meses. No entanto, a passagem inicial destes aglomerados de células, combinado com filtragem inversa de cachos de células, pode isolar as células tumorais saudáveis ​​que são capazes de formar esferas (F). O filtrado (E) normalmente contém restos de detritos; No entanto, recomendamos revestimento e mantendo o filtrado e monitoramento para<html> o desenvolvimento de aglomerados de células. Estas amostras derivadas do paciente podem então ser mantidas em cultura durante várias passagens (G, H). A Figura 3 demonstra a capacidade destas células para ser xenoenxertado em ratinhos. Em cada um destes casos, as células foram transfectadas com DIPG um repórter GFP-luciferase para monitorar o desenvolvimento dos tumores por meio de bioluminescência (A). Os tumores também podem ser analisados ​​histologicamente, por exemplo, para observar o enxerto do tumor (B) ou a expressão de marcadores específicos (C). Estes modelos in vivo, combinados com os ensaios in vitro podem ser utilizados para avaliar os efeitos de várias drogas ou manipulações de genes (por exemplo, 8, 9, 10, 11, 14). les / ftp_upload / 55360 / 55360fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. As amostras de tecido em vários estágios de processamento. (A) Obter a amostra através de procedimentos de autópsia estéreis e transporte de noite no gelo molhado. (B) Da esquerda para a direita: (linha 1) tubos contendo tecido tumoral em meio marítimo; tecido fresco em um prato de cultura de células de 100 milímetros x 20 mm; picagem do tecido inicial; (Linha 2) do tecido parcialmente picada; remoção de meninges e vasos sanguíneos; tamanho final das peças de tecido moído. (C) Da esquerda para a direita: (linha 1) tecidos incubados em uma mesa rotativa em um C forno de 37 °; (Linha 2) trituração do tecido através de uma ponta de pipeta 1000 mL ligado a uma pipeta de 10 mL; filtragem de tecido dissociado através de um filtro de malha de nylon de 100 um. (D) Da esquerda para a direita: tecido dissociado suspensas em solução 0,9 M de sacarose antes da centrifugação; tecido dissociado separado através de um gradiente de sacarose após a centrifugação; uma camada visível óf detritos mielina no topo do gradiente de sacarose; um sedimento celular final após lise ACK e lavagem. (E) A amostra final pode ser colocado em cultura ou utilizado em outras análises a jusante. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig2.jpg" /> Figura 2. Imagens de culturas primárias e Células passagem precoce. (A - B) Culturas banhado imediatamente após dissociação (SU-DIPG-XXX, A), ou que não tenham crescido neurospheres ainda (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) aparecimento precoce de neurospheres em culturas primárias de SU-DIPG-XXVIII (C) e SU-DIPG-XXIX (D). (EF) Primeira passagem da cultura primária a partir de D, utilizando um filtro de nylon de 100 um, com o filtrate (E) e filtrado inversa (F) banhado. (G - H) neurospheres maduros a partir da primeira passagem do SU-DIPG-XXVII (G) e a terceira passagem do SU-DIPG-XXV (H) que crescem na cultura. Barra de escala = 200 pm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig3.jpg" /> Figura 3. culturas de células derivadas do paciente pode Enxerte e formar tumores em camundongos. Imagens (A) bioluminescência de quatro culturas de células derivadas de pacientes diferentes transfectadas com um repórter GFP-luciferase. (B) Corte sagital de um xenotransplante de rato, mostrando células tumorais enxertados na ponte do mouse. Verde: GFP, Vermelho: proteína básica da mielina. Escala da barra = 1 mm. immunofluores (C) Exemploimagem cência mostrando células tumorais GFP enxertados em um cérebro de camundongo. Azul: DAPI, Verde: GFP, Vermelho: IGF2R. Barra de escala = 40 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Suplementar Figura 1. Amostra Autópsia de um tumor Pontine. Immediate aparência post-mortem de um glioma pontino intrínseca difusa. O tumor apresenta-se como uma grande massa, rico em mielina na superfície ventral da ponte. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esta imagem.</a>

Este protocolo descreve um método para o rápido processamento de amostras de glioma pontino intrínsecas difusas post-mortem para o estabelecimento de modelos de culturas de células derivadas de pacientes ou caracterização directa de células tumorais e microambiente.

Um protocolo para a Cultura rápidos post-mortem celular de Difuso Intrínseca Pontine glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

O objetivo geral deste protocolo rápido de cultura celular pós-mortem é gerar culturas celulares duradouras derivadas de pacientes com glioma difuso intrínseco da ponte para facilitar os experimentos necessários para compreender e, em última instância, desenvolver terapias eficazes contra o DIPG. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a biologia básica e estratégias terapêuticas para o glioma difuso intrínseco da ponte, como, por exemplo, se certas drogas são eficazes em diferentes culturas derivadas de pacientes. A principal vantagem desta técnica é que ela permite o estudo direto da biologia de células derivadas de pacientes.As implicações desta técnica estendem-se à terapia para DIPG, pois permitem a avaliação de diferentes estratégias terapêuticas em diversos subtipos genéticos da doença. Embora este método possa fornecer informações sobre DIPG, ele também pode ser aplicado a outras doenças, como outros gliomas pediátricos de alto grau, glioblastomas em adultos ou outros tumores do sistema nervoso central. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldades, porque é difícil obter e processar rapidamente amostras de necropsia de maneira eficiente.Antes da preparação da amostra, esterilize a cabine de cultura de tecidos, juntamente com lâminas de barbear, hemostatos curvos e outras ferramentas não estéreis, sob luz UV por uma hora, e realize todos os passos seguintes em condições estéreis. Em seguida, transfira o tecido para uma placa de cultura celular de 100 milímetros por 20 milímetros com paredes altas. Remova o meio remanescente do transporte e substitua por 10 a 15 mililitros de meio de cultura frio.Em seguida, utilizando hemostatos curvos para segurar uma lâmina de barbear, pique finamente o tecido enquanto remove os vasos sanguíneos ou as meninges. Os fragmentos finais de tecido devem ser menores que um milímetro. Depois disso, transfira o tecido para um tubo cônico limpo de 50 mililitros.Lave o recipiente de cultura celular com mais cinco mililitros de meio de cultura frio e transfira a amostra para o tubo cônico. Repita esta etapa de lavagem conforme necessário para transferir o tecido remanescente. Usando uma pipeta serológica de 10 mililitros, triture suavemente a amostra de quatro a cinco vezes.Deixe os fragmentos de tecido maiores sedimentarem no fundo do tubo. Se necessário, centrifugue brevemente a amostra por um minuto. Para coletar a fração dissociada, remova o sobrenadante e filtre-o através de um filtro de 100 microns em um novo tubo cônico de 50 mililitros rotulado Dissociação Mecânica.Inverta o filtro sobre o tubo cônico original e lave com meio de cultura para recuperar os fragmentos de tecido. Em seguida, centrifugue a fração de dissociação mecânica por cinco minutos. Posteriormente, remova o sobrenadante da fração de dissociação mecânica sedimentada e re-suspenda o tecido em meio de cultura frio.Se houver mais de cinco mililitros de tecido no tubo cônico de dissociação mecânica, divida o tecido em outros tubos cônicos de 50 mililitros de modo que nenhum tubo contenha mais de cinco mililitros de tecido. Em seguida, mantenha a fração dissociada mecanicamente em gelo até a etapa de centrifugação em gradiente de sacarose. Neste procedimento, centrifugue o tubo cônico contendo os fragmentos de tecido remanescentes por cinco minutos.Em seguida, remova o sobrenadante e adicione a solução de digestão enzimática pré-aquecida, de modo que haja cinco mililitros de solução de digestão para cada um mililitro de tecido. Então, feche a tampa do tubo cônico com filme laboratorial e incube a reação em um agitador rotativo a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, triture as amostras suavemente.Usando uma pipeta serológica de 10 mililitros, pipete a amostra para cima e para baixo de seis a oito vezes, evitando a formação de bolhas de ar excessivas. Em seguida, acople uma ponteira de pipeta de 1.000 microlitros à extremidade da pipeta e triture a amostra por mais seis a oito vezes. Deixe que quaisquer fragmentos remanescentes sedimentem no fundo do tubo.Em seguida, remova e filtre o sobrenatante com as células ainda em suspensão por meio de um filtro de 100 micrômetros para um novo tubo cônico de 50 mililitros rotulado Dissociação Enzimática e armazene-o em gelo. Após isso, centrifugue o tubo de dissociação enzimática por cinco minutos e prossiga para a centrifugação em gradiente de sacarose. Se a amostra ainda estiver em suspensão na solução, centrifugue-a por cinco minutos.Em seguida, remova o sobrenadante e re-suspenda o tecido em 20 mililitros de HBSS frio sem cálcio e magnésio. Então, complete o volume para 25 mililitros com HBSS frio. Adicione lentamente 25 mililitros de solução de sacarose 1,8 molar e inverta o tubo para homogeneizar.Isso resulta em um gradiente de sacarose 0,9 molar. Em seguida, centrifugue a amostra sem interrupção por 10 minutos. Aspire cuidadosamente os detritos de mielina na maior quantidade possível da solução de sacarose.Em seguida, lave a amostra adicionando 30 mililitros de HBSS frio sem cálcio e magnésio e misturando suavemente. Depois disso, centrifugue por cinco minutos. Neste procedimento, remova o sobrenadante da lavagem.Adicione cinco mililitros de tampão de lise ACK e re-suspenda suavemente o pellet celular, girando o tubo durante um minuto à temperatura ambiente. Em seguida, interrompa a lise adicionando 30 mililitros de HBSS frio sem cálcio e magnésio. Posteriormente, centrifugue por cinco minutos.Re-suspenda o pellet final de células em 10 a 15 mililitros de TSM completo aquecido com fatores de crescimento e quantifique a densidade de células viáveis em um hemocitômetro, utilizando exclusão com azul de tripano. Em seguida, transfira a suspensão celular final para um novo frasco de cultura T75. Adicione fatores de crescimento adicionais a cada dois dias para manter os níveis totais de fatores de crescimento e monitore o desenvolvimento de neuroesferas de células tumorais.Aqui estão vários exemplos de como as amostras podem aparecer desde as fases iniciais do cultivo até um cultivo duradouro. Inicialmente, as placas e os cultivos precoces muitas vezes não parecem conter muitas células viáveis. Além disso, os aglomerados celulares iniciais muitas vezes não exibem o grau de contraste tipicamente associado aos neuroesferas.No entanto, a passagem inicial desses aglomerados celulares, combinada com a filtração reversa dos aglomerados celulares, pode isolar células tumorais saudáveis capazes de formar esferoides. O filtrado geralmente contém resíduos remanescentes. Essas amostras derivadas de pacientes podem então ser mantidas em cultura por múltiplas passagens.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a quatro horas, se executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante garantir que a amostra seja mantida em temperatura fria durante todas as etapas, exceto durante a dissociação enzimática, e minimizar o manuseio traumático da amostra. Após este procedimento, podem ser realizados estudos adicionais, como triagem in vitro de fármacos ou xenotransplantes ortotópicos, para responder perguntas subsequentes sobre a patobiologia do DIPG.Após seu desenvolvimento, essa técnica de cultivo abriu caminho para pesquisadores na área de neuro-oncologia pediátrica explorarem novas abordagens terapêuticas para crianças com DIPG. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como realizar protocolos de cultura celular rápida pós-mortem em amostras de tumores cerebrais. Não se esqueça de que trabalhar com tecido humano pode ser perigoso, e precauções, como o uso de equipamento de proteção individual e técnica estéril, devem ser sempre adotadas.

a-protocol-for-rapid-post-mortem-cell-culture-diffuse-intrinsic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo demonstra o processo de isolamento e cultura de células progenitoras gliais de glio pontino intrínseco difuso ou tecido do tronco cerebral afetado por DIPG. Células gliais isoladas do tecido tumoral via  uma digestão enzimática são cultivadas em meio neurobasal, o que promove seu crescimento e o desenvolvimento de neuroesferas flutuantes.

Isolando e Cultivando Células de Glioma Pontino Intrínseco Difuso

Gliomas malignos constituem um grupo heterogêneo de neoplasias gliais altamente infiltrativas com características clínicas e moleculares distintas. Xenograftos ortotópicos primários recapitulam as características histopatológicas e moleculares de subtipos de glioma malignos em modelos animais pré-clínicos.

Glioma Xenoenxertos Ortotópicos Primários Recapitulam crescimento infiltrativo e isocitar mutação desidrogenase I

Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

Nós estabelecemos um modelo de glioblastoma ortotópico cortical em camundongos para microscopia de dois fótons intravital que recapitula as restrições biofísicas normalmente no jogo durante o crescimento do tumor. Uma janela de vidro crônica substituir o crânio acima do tumor permite o acompanhamento da progressão do tumor ao longo do tempo por meio de microscopia de dois fótons.

Um Glioblastoma Rato modelo ortotópico Manter restrições Cérebro parênquima físicas e Adequado para intravital dois fótons Microscopia

Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Aqui apresentamos um sistema de cultura monocamada mista ex-vivo para o estudo da migração de células glioma humanas (hGC) em tempo real. Este modelo fornece a capacidade de observar interações entre hGCs e axônios mielinated e não-myelinated dentro de uma câmara compartimentada.

Monitoramento em tempo real da migração humana de células glioma em co-culturas de raiz dorsal Ganglion Axon-Oligodendrocyte

Este trabalho descreve o desenvolvimento de eletrodos interdigitalizados flexíveis para implementação em modelos de tumores cerebrais 3D, a saber, cultura in vitro , modelo in ovo e modelo murino in vivo. O método proposto pode ser utilizado para avaliar os efeitos de campos elétricos pulsados em tumores em diferentes níveis de complexidade.

Dispositivos eletrônicos orgânicos flexíveis para terapia de campo elétrico pulsado de glioblastoma

Este estudo introduz um método automatizado para gerar organoides 3-dimensionais de glioblastoma derivados do paciente utilizando um picador de tecido. O método fornece uma abordagem adequada e eficaz para a obtenção de tais organoides para testes terapêuticos.

Cultivando organoides de glioma derivados de pacientes ex vivo usando um picador de tecido

Apresentamos uma nova abordagem para microscopia de dois fótons da liberação tumoral de nanopartículas de óxido de ferro marcadas fluorescente para glioblastoma em um modelo de camundongo.

Microscopia Intravital de Dois Fótons de Glioblastoma em Modelo Murino

IDH1-mutante gliomas difusos de baixo grau são tumores raros e difíceis de cultivar. Apresentamos um método simples de explante não enzimático que preserva a expressão da proteína mutante IDH1 e sustenta as culturas por meses. É importante ressaltar que essa técnica funciona com tumores criopreservados, oferecendo um recurso valioso para a pesquisa de gliomas.

Um protocolo para culturas de explante de gliomas difusos de baixo grau com mutação IDH1

Aprenda a cultura rápida pós-morte de células de glioma intrínseco difuso da ponte para estudar biologia tumoral e testar estratégias terapêuticas em modelos derivados de pacientes.

Um protocolo para a Cultura rápidos post-mortem celular de Difuso Intrínseca Pontine glioma (DIPG)

Explorar mais vídeos