Aqui, nós apresentamos um protocolo para isolar microglia de crias de rato pós-natais (dia 1) para experimentação in vitro. Este método improvisada de isolamento gera tanto rendimento e pureza elevados, uma vantagem significativa em relação aos métodos alternativos que permite a ampla gama de experimentação para efeitos de elucidação da biologia da microglia.
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Artigo de método
Isolamento magnético rápido e refinado CD11b da Primária Microglia com pureza e versatilidade
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microglia são os principais respondedores a insultos do sistema nervoso central; no entanto, muito permanece desconhecido sobre o seu papel na regulação da neuroinflamação. Microglia s culas da mesoderme que funcionam de forma semelhante aos macrófagos na topografia de stress inflamatório. O (M1-type) clássica e alternativa (do tipo M2) ativações de macrófagos também foram estendidos para microglia em um esforço para melhor compreender a interação subjacente estes fenótipos têm em condições neuroinflamat�ios como Parkinson, Alzheimer e doença de Huntington. Em experiências in vitro, utilizando a microglia primário oferece resultados rápidos e fiáveis, que podem ser estendidos para o ambiente in vivo. Embora esta seja uma clara vantagem sobre a experimentação in vivo, isolando microglia ao conseguir rendimentos adequados de pureza óptima tem sido um desafio. Os métodos mais comuns actualmente em uso quer sofrem de baixa recuperação, baixo grau de pureza, ou ambos. Aqui, nós demmonstrar um refinamento do CD11b método de separação magnética sem colunas que atinge uma célula de recuperação elevado e pureza melhorada em metade da quantidade de tempo. Propomos este método otimizado como um modelo altamente útil de isolamento microglial primário para fins de estudar neuroinflamação e neurodegeneração.
Introdução
Microglia são macrófagos residentes Myb-independentes de origem mesodérmica, que diferenciam a partir de c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitores nas ilhas de sangue do saco vitelino 1, 2. Uma vez que a microglia embriológicos colonizaram o sistema nervoso central (SNC), que a transição de uma para uma forma amebóide ramificado 3. Estes microglia adultos são classificados como surveillant desde suas ramificações dinâmicas sondar o parênquima cerebral saudável para potenciais insultos 4. Embora microglia só contribuem para aproximadamente 10% da população de c....
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Protocolo
O uso dos animais e procedimentos protocolares foram aprovados e supervisionados pela Comissão Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade Estadual de Iowa (Ames, IA, EUA)
1. Crescimento de culturas gliais mistas
- Decapitar 1- filhotes de 2 dias de idade rapidamente com uma tesoura que operam 5,5 polegadas, e colocar as cabeças imediatamente em um tubo de 50 ml em gelo. Note que esta decapitação é o modo de eutanásia.
- Num capuz de fluxo de ar laminar, fazer uma pequena incisão no crânio e as meninges utilizando 4,5 polegadas rectas-dissecando micro tesouras. Começar a cortar a partir do final cau....
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Resultados
Microglia isolado utilizando o kit de CD11b selecção positiva II têm alta pureza
microglia primários de ratinho foram isolados utilizando o protocolo acima mencionado e plaqueadas em lamelas de poli-D-lisina-revestidas para verificar a pureza de isolamento. Dez mil células foram plaqueadas por cavidade e análise imunocitoquimica foi efectuada utilizando molécula de adaptador se liga a cálcio ionizado 1 (Iba1) como um marcador da .......
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Discussão
Mais antigos métodos de isolamento microgliais têm recuperações limitados que não são apropriados para diversas análises de proteína por transferência de Western e análise de RNA por qRT-PCR. A adesão diferencial e métodos tripsinização leves são duas abordagens comuns, com baixos rendimentos microgliais 13, 14, 15. A abordagem baseada em CD11b coluna também tem baixa recuperação, mas consegue uma maior pureza do que a adesão d.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) Subvenções: NS088206 e ES026892. O W. Eugene e Linda Lloyd cadeira dotada para AGK e Deans Professorship para AK também são reconhecidas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de Separação EasySep CD11b II | StemCell Technologies | 18970 | |
| Ímã EasySep | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Aminoácidos não essenciais (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamina (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Tripsina-EDTA | Gibco por Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco por Life Technologies | 14190250 |
Referências
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric d....
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Reimpressões e permissões
