Summary
Her præsenteres en protokol til isolering mikroglia fra postnatal museunger (dag 1) til in vitro forsøg. Denne improviserede fremgangsmåde til isolation genererer både højt udbytte og renhed, en betydelig fordel i forhold alternative fremgangsmåder, der tillader essentielle eksperimenter med henblik på at belyse mikroglial biologi.
Abstract
Mikroglia er de primære respondere på centralnervesystemet fornærmelser; Men meget er stadig ukendt om deres rolle i reguleringen af neuroinflammation. Mikroglia er mesodermale celler, der fungerer på samme måde makrofager i landmåling inflammatorisk stress. Den klassiske (M1-type) og alternativ (M2-type) aktiveringer af makrofager er også blevet udvidet til at mikroglia i et forsøg på at bedre at forstå den underliggende samspil disse fænotyper har i neuroinflammatoriske sygdomme som Parkinsons, Alzheimers og Huntingtons sygdomme. In vitro eksperimenter under anvendelse primær mikroglia tilbyder hurtige og pålidelige resultater, der kan forlænges med in vivo miljø. Selv om dette er en klar fordel i forhold in vivo eksperimentering, isolering mikroglia samtidig opfylde tilstrækkelige udbytter af optimal renhed har været en udfordring. Almindelige metoder øjeblikket anvendes enten lider af lavt genvinding, lav renhed eller begge. Heri vi DEMonstrate en forfining af kolonnen-free CD11 magnetisk separationsmetode, der opnår en høj celleindvinding og forbedret renhed på den halve tid. Vi foreslår denne optimerede metode som en særdeles nyttig model af primær microglial isolation med henblik på at studere neuroinflammation og neurodegeneration.
Introduction
Mikroglia er Myb-uafhængige stationære makrofager af mesodermal oprindelse, som differentierer fra c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitorer i blodet øer i blommesækken 1, 2. Når embryologiske mikroglia har koloniseret det centrale nervesystem (CNS), de overgangen fra en amoeboid til en forgrenet formular 3. Disse voksne mikroglia er klassificeret som surveillant da deres dynamiske forgreninger sonde sunde hjerneparenkym for potentielle fornærmelser 4. Selvom mikroglia kun bidrage til ca. 10% af CNS cellepopulationen, deres evne til at flise blandt hinanden sikrer maksimal scanning af parenkym 4, 5. Fare-associerede molekylmønstre (dæmper), såsom α-synuclein 6, 7 og amyloid-β 8 eller pathogen-associerede molekylmønstre (PAMPs), såsom lipopolysaccharid (LPS) 9, klassisk aktivere mikroglia at fremme en inflammatorisk reaktion karakteriseret ved reversion til amoeboid aktive tilstand og produktionen af nitrogenoxid, tumornekrosefaktor-α (TNF), interleukin 1β (IL-1β), IL-6, IL-12, og kemokin CC motiv ligand 2 9, 10, 11. I neuroinflammatoriske tilstande, såsom Parkinsons sygdom, hvor patogene α-synuclein har akkumuleret, er en neurodegenerativ cyklus oprettet fra død af dopaminerge neuroner, som frigiver mere aggregeret α-synuclein, yderligere fremme af klassisk aktivering af mikroglia 7. Svarende til perifere makrofager, kan mikroglia også har evnen til alternativt aktivere i nærvær af anti-inflammatoriske cytokiner IL-4 og IL-10, hvilket giver dem den potenteial fremme neural reparation og svækkende inflammation 2, 11. Bortset fra deres immunologiske roller i CNS, er mikroglia blevet beskrevet som vitale regulatorer af neuronal kredsløb ved beskæring synapser under udviklingen. For eksempel Cx3cr1- KO-mus har mindre tætte mikroglia og reduceret synaptisk beskæring, hvilket fører til en overflod af dendritiske spidser, umodne synapser og de elektrofysiologiske mønstre af en underudviklet CNS 12. Forståelsen af disse fysiologiske kompleksitet og de forskellige funktionelle roller mikroglia i homeostase af CNS er afgørende for søgningen efter terapi rettet mod neurodegenerative sygdomme.
På området neuroimmunology, in vitro forsøg, er yderst ønskelige på grund af den større feasibility for mekanistiske undersøgelser, de lavere vedligeholdelsesomkostninger, og for at være mindre tids- og arbejdskrævende. Furthermore, evnen til at isolere cellepopulationer er kritisk at afgrænse funktionaliteten af disse målceller under foreskrevne betingelser. Der findes talrige mikrogliaceller isoleringsmetoder, men de er begrænset ved deres evne til at opnå relativt høje numre og renhed til bred eksperimentering 13, 14, 15. For eksempel en klynge af differentiering 11b (CD11b) er en almindelig overflademarkør af monocytter, makrofager og mikroglia 16. Ved at udnytte CD11, blev en fremgangsmåde til magnetisk separation først beskrevet som en søjle tilgang, der gav ~ 99,5% renhed og ~ 1,6 x 10 6 mikroglia pr neonatal hjerne 17. Vores laboratorium for nylig udviklet en søjle-fri CD11 magnetisk separationsmetode 15, som vi udført i et polystyrenrør ved at mærke CD11 med et monoklonalt antistof konjugeret til phycoerythrin (PE). Et bispecifikt secondary antistof til PE og dextran komplekser med PE. Når bundet, er dextran-coatede magnetiske partikler indført, hvilket binder til dextran ende af antistof-komplekset. Endelig er polystyrenrør anbragt i en magnet for mikroglial isolation. Denne fremgangsmåde fordoblet udbyttet til ~ 3,2 x 10 6 mikroglia pr neonatal hjerne, men på bekostning af reducerende renhed til ~ 97%.
Heri, demonstrerer vi en hurtig og raffineret kolonne-fri CD11 magnetisk separation protokol (figur 1). Denne forbedrede fremgangsmåde forbliver som muligt, som vores oprindelige kolonne-fri metode, da prisen på CD11b magnetisk separation kit er den samme. Færdiggørelsen reduceres i halve, hvilket kan være afgørende for at maksimere celleoverlevelse og udbytte. Især renheden opnået fra denne optimerede metode er ~> 99%, en markant forbedring i forhold til renheden opnået fra den oprindelige kolonne-fri metode udviklet af vores laboratorium 15. Vigtigst er det, CD11b-PEikke udnyttes, hvilket eliminerer behovet for at inkubere væk fra lys og tillader anvendelse af den røde kanal til fluorescensmikroskopi. Endelig som i den oprindelige CD11b fremgangsmåde en astrocytiske del af højt udbytte og renhed opnås med denne forbedrede fremgangsmåde. Astrocytter er de mest talrige gliaceller i CNS, hvilket fører til tanken om, at deres homeostatiske funktioner er uundværlige i forhold til patofysiologi 18. Disse gliaceller spiller en rolle i forskellige fysiologiske funktioner, såsom dannelse af blod-hjerne-barrieren, hvilket giver næringsstof støtte, opretholde neurotransmitter homeostase, danner glia ar som respons på skade, neurobeskyttelse, indlæring og hukommelse, og neuroinflammation, eksemplificering deres undersøgende potentiale i glial biologi 19. Morfologi og funktionaliteten af mikroglia og astrocytter er blevet konstateret via konfokalmikroskopi, Western blotting, kvantitativ Real-Time Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR), GRiess nitrit assay og Luminex multiplex cytokin assay. Raffinement tilvejebringes af denne protokol giver øget tillid vedrørende mikroglial eller astrocytisk renhed, bredere anvendelse af fluorescensmikroskopi med tilgængeligheden af den røde kanal, og sparer tid, som alle er vigtige for in vitro forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anvendelse af dyrene og protokol procedurer blev godkendt og under tilsyn af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Iowa State University (Ames, IA, USA)
1. Dyrkning af blandede gliale kulturer
- Halshugge 1.-2 dage gamle hvalpe hurtigt med 5,5 tommer opererer saks, og placere hovederne straks i et 50 ml rør på is. Bemærk, at denne halshugning er den tilstand af eutanasi.
- I en laminar luftstrøm hætte, lave et lille snit i kraniet og meninges anvender 4,5 tommer straight mikro-dissekere saks. Begynde at skære fra den kaudale ende til den rostrale ende (næse). Få under huden ved hjælp af åbningen dannet af halshugning.
- Efter indsnit, skrælle et af halvkugler til siden. Så brug et par buede eller krogede pincet til at fjerne hele hjernen.
- Fordybe hjernen (r) i en ny 50 ml rør indeholdende 0,25% trypsin-ethylenediaminetetraacetspiste syre (EDTA) i 15 minutter i et 37 ° C vandbad. Bruge 2 ml trypsin-EDTA pr hjernen.
- Vask hjernen (r) med frisk vækstmedier (10% FBS, DMEM / F12, 1% penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin, 1% natriumpyruvat og 1% ikke-essentielle aminosyrer) ved at tilføje og fjerne medier. Gentag denne 4x.
- For hver hjerne, plade to T-75 kolber indeholdende vækstmedium. Derfor, tilsættes 2 ml vækstmedium pr hjerne til røret. Således vil det være en ækvivalent af 1 ml homogeniseret hjerne med 8-9 ml vækstmedium per T-75-kolbe.
- Homogeniseres ved findeling hjernen (r) med pipetter med forskellig blænde størrelser, i rækkefølge fra største til mindste. Når det er synligt, at hjernevævet ikke bliver mindre, overgang til næste pipette. Ved afslutningen af triturering, bør suspensionen være klar, uden synlige klumper.
- Brug en 25 ml pipette, 5 ml pipette, og derefter en 10 ml pipette sekventielt.
- Pass hver HOMOGenous hjerne suspensionen gennem et 70 um cellefilter at gøre det til en enkelt cellekultur.
- For hver homogeniseret hjerne, plate to T-75-kolber indeholdende vækstmedium, som beskrevet i trin 1.5 (1 ml homogeniseret hjerne med 8-9 ml vækstmedium per T-75-kolbe).
- Skift vækstmedier efter 6 d og vokse indtil isolation på den 16. dag.
2. Isolering af mikrogliaceller
- Efter 16 dage, fjerne vækstmediet fra kolben og anbring den i et frisk 50 ml rør. Tilsæt 3 ml 0,25% trypsin-EDTA til hver T-75-kolbe. Rystes i 5 minutter ved stuetemperatur på en orbital ryster.
- Centrifuger fjernet vækstmedier ved 0,4 xg i 5 min og bruge til at stoppe trypsin-EDTA-reaktion i det efterfølgende trin.
- Efter rystning i 5 minutter tilsættes mindst 4 ml vækstmedium (frisk eller den brugte medier fra 2.1.1) for at standse trypsin-EDTA-reaktion.
- Triturer at sikre, at alle calen er blevet frigjort.
- Efter triturering, passerer cellerne gennem en 70 um cellefilter at gøre det til en enkelt cellekultur, udføre en celletælling, og derefter vågeblus cellerne ved 0,4 x g i 5 min.
- For hver 100 x 10 6 celler (ca. 15 x T-75 kolber), anvende 1 ml Recommended Media (2% FBS, DPBS (calcium og magnesium chloridfrit), 1 mM EDTA) at resuspendere cellepelleten.
BEMÆRK: Alle følgende trin er skræddersyet til en 1 ml adskillelse. - Tag en 5 ml polystyrenrør, tilsæt 1 ml Recommended Media, og markere menisken. Tilføj Anbefalet medier op til 2,5 ml og markere det så godt. Kassér Recommended Media og overføre resuspenderede celler til 5 ml polystyrenrør.
- Der tilsættes 50 pi af rotteserum for hver 1 ml af suspenderede celler. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Forberede valg cocktail ved at blande 25 pi af bestanddel A og 25 pi af komponent B. Disse komponenter er proprietære.
- Tilføj 501 L af udvælgelsen cocktail til cellerne. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: renere kulturer Gentag trin 2.9 (anbefales, men ikke obligatorisk). - Vortex mikrosfærer til 45 s. Tilføje 80 pi af mikrokugler per 1 ml prøve. Inkuber i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Bringe volumenet til 2,5 mL i polystyrenrør ved tilsætning af den Recommended Media.
- Sætte røret i magneten i 3 minutter ved stuetemperatur. Juster inkubation for at øge renheden. Langsomt hælde ud Recommended Media i en 15 ml-rør med magneten stadig i polystyrenrør.
- Gentag trin 2,12 yderligere tre gange. Yderligere magnetiske inkubationer kan udføres for at forøge renhed.
- Tilsæt 3 ml vækstmedier og tælle antallet af celler under anvendelse af en celletæller.
- Plate celler følgelig i Poly-D-Lysin (PDL) overtrukne plader til behandlinger. Behandle cellerne 48 timer efter podning inPDL-coatede plader. Dette gør det muligt for cellerne at komme sig stress af adskillelse.
BEMÆRK: Check renheden af kulturen ved anvendelse af immuncytokemi som tidligere 15 beskrevet. - Plate den negative fraktion (opsamlet i et 15 ml rør), som for det meste indeholder astrocytter, i T-75-kolber i vækstmediet.
- Efter mindst 6 timers inkubation i 37 ° C inkubator, ændre mediet og lade det vokse O / N. Split astrocytter den næste dag for behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microglia isoleret under anvendelse CD11 Positive Selection kit II har høj renhed
Primære muse mikroglia blev isoleret ved anvendelse af ovennævnte protokol og udpladet på poly-D-lysin-overtrukne dækglas at kontrollere renheden af isolation. Ti tusind celler blev udpladet pr brønd og immuncytokemisk analyse blev udført under anvendelse af ioniseret calcium-bindende adaptormolekyle 1 (Iba1) som en markør for mikroglia og glial fibrillært surt protein (GFAP) som en markør for astrocytter at kontrollere for renheden af det isolerede mikroglia . Den isolerede kultur kun udtrykkes Iba1 uden GFAP-ekspression (figur 2A), hvilket antyder, at kulturen isoleret var rene mikroglia. I modsætning til andre tidligere offentliggjorte fremgangsmåder til primær mikroglial adskillelse, der opnåede ~ 97% renhed, anvendelse af denne fremgangsmåde opnåede vi ~> 99% renhed på den halve tid. For yderligere at validere renheden af th er kultur, kørte vi en Western blot 20 for Iba1 og GFAP. Immunoblot-analyse afslørede endvidere, at denne isolering fra de blandede gliale kulturer var en næsten ren mikroglial kultur (figur 2B).
Den modificerede isoleringsprocedure har ikke nogen automatisk fluorescens fra magnetiske perler
Den røde kanal kan ikke bruges til immuncytokemi (ICC) ved brug af tidligere CD11b isolation kit til mikroglial adskillelse som nævnt af Gordon et al. 15 på grund af brugen af PE-mærkning under adskillelse. Under anvendelse af denne nye PE-fri isolation kit, kan vi bruge den røde kanal for immuncytokemisk analyse (figur 3). Fra denne ICC, er det klart, at denne nye metode gør det muligt at bruge alle de kanaler for flowcytometri eller andre fluorescerende billeddannelsesundersøgelser.
ve_step" fo: keep-together.within-side = "1"> Isolerede mikroglialceller kulturer funktionelt reagere på LPS stimulusFor at bekræfte at det isolerede mikroglia er funktionelt aktive, behandlede vi cellerne med LPS, et almindeligt anvendt stimulerende 9 at aktivere mikroglia, i 24 timer før probing af forskellige proinflammatoriske faktorer. Klassisk mikroglial aktivering er ledsaget af frigivelse af nitrit og forskellige proinflammatoriske cytokiner i mediet. Derfor vi bruges flere komplementære assays for at bekræfte den funktionelle aktivitet af vores isolerede mikroglia. Først brugte vi Griess-assayet til at vise at LPS dramatisk induceret nitrit-sekretion fra den isolerede mikroglia (figur 4A). For yderligere at validere aktiviteten af isoleret mikroglia anvendte vi QRT-PCR til at vise (messenger ribonukleinsyre) mRNA-niveauer af NOS2, en anden kendetegnende for mikroglial inflammation, signifikant forøget with LPS-behandling (figur 4B). Dernæst anvendte vi en perlebaseret multiplex assay Luminex 21, at kontrollere, at LPS signifikant stimulerede sekretionen af proinflammatoriske cytokiner fra mikroglial kultur (figur 5A). Endvidere har vi bekræftet via QRT-PCR-analyse, at LPS-behandling forøgede de genekspressionsniveauer af flere pro-inflammatoriske cytokiner, herunder IL-1β og TNFa (figur 5B). Alle disse data sammen tyder på, at primære mikroglia isoleret ved anvendelse af denne nyraffineret fremgangsmåde er funktionelt aktive og viser en tilsvarende aktivering profil som primære mikroglia isoleret under anvendelse af tidligere publicerede fremgangsmåder.
Isolerede mikroglia kan bruges til signalering undersøgelser
Ved hjælp af de tidligere metoder til mikroglial isolation, løb vestlige blot for signaling undersøgelser var vanskeligt og umuligt på grund af lavt udbytte og renhed. Vi har tidligere vist, at Fyn, en Src-familien kinase, er involveret i en pro-inflammatorisk signalering kaskade i mikrogliaceller 9. Her belagt vi en million mikrogliaceller i en plade med 12 brønde, og efter 48 timer, vi samlet cellerne til at køre Western blots for nativt Fyn og Src kinaser phosphoryleret i tyrosinrest 416 (p-Src-Y416). Vi var i stand til at påvise både Fyn og p-Src-Y416-niveauer i vores isolerede mikrogliaceller (figur 6), hvilket viser, at denne metode kan anvendes på Western blotting-teknikker til signalering undersøgelser.
Den negative fraktion fra mikroglial adskillelse indeholder astrocytter, som kan anvendes til at signalere undersøgelser
Astrocytter er centrale aktører i neuroinflammation, og forstå de signalerende mekanismer bag astrocytic inflammation og neuron-astrocyt krydstale er vigtig 19. Her viser vi, at den negative fraktion fra mikroglial adskillelse indeholder GFAP-positive astrocytiske celler (Figur 7A). Også vores Western blot-analyse for Fyn og p-Src-Y416 (figur 7B) viste, at begge disse proteiner kan detekteres i den negative fraktion samt. Disse resultater viser tilsammen, at den negative fraktion er en ideel forberedelse til astrocytiske undersøgelser med henblik på identifikation af proteiner er vigtige for inflammatoriske signaleringskaskader.
Figur 1: Skematisk af Isolering af mikrogliaceller fra 1-2 Dage-postnatale Pups. Klik her for at se en større versionaf dette tal.
Figur 2: Mikroglia Isoleret hjælp CD11b-positive Selection Kit II Har høj renhed. (A) Immuncytokemi af isoleret microglial kultur sondering for GFAP i rød kanal og IBA1 i grønne kanal. (B) Immunoblot af isoleret microglial kultur sondering for GFAP (~ 51 kDa), IBA1 (~ 15 kDa) og β-Actin (~ 42 kDa). Målestokken = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Modificeret isoleringsprocedure ikke har nogen Auto-fluorescens fra magnetiske perler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: LPS Stimulation Øget nitritproduktion i mikrogliale Culture. (A) Isolerede mikrogliaceller behandlet med 1 pg / ml LPS i 24 timer og behandlingsmediet blev opsamlet til bestemmelse nitritfrigivelse af Griess assay. (B) q-RT-PCR for NOS2 fra isoleret microglia behandlet med LPS i 24 timer. Tallene angiver middelværdien ± SE fra 2 eller flere uafhængige forsøg. Data blev analyseret ved hjælp af t-test (* p0 0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: LPS-induceret Pro-inflammatorisk cytokinfrigørelse fra mikrogliaceller. (A) Luminex multiplex assay blev udført på behandling medium opsamlet fra isolerede mikrogliaceller behandlet med 1 pg / ml LPS i 24 timer. (B) q-RT-PCR for IL-1βand TNFa fra isoleret microglia behandlet med LPS i 24 timer. Tallene angiver middelværdien ± SE fra 2 eller flere uafhængige forsøg. Data blev analyseret under anvendelse af t-test (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Isoleret Mikroglia kan bruges til Signalering Studies. Western blot-analyse viser, at Fyn og p-Src-Y416 kan detekteres fra mikroglia isoleret med vores nyligt raffineret metode.
Figur 7: Den negative fraktion fra mikroglial Separation Indeholder Astrocytter der kan bruges til Signalering Studies. (A) Western blotting, viser, at den negative fraktion indeholder GFAP-positive celler. (B) Western blot-analyse viser, at der kan påvises Fyn og p-Src-Y416 fra GFAP-positive celler.target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
| Parametre | Aktuel metode | modificerede fremgangsmåde | |
| Koste | $ 620 | $ 620 | |
| Tid | 55 min | 25 min | |
| Fluorescens | Ja (rød kanal) | Ingen | |
| Renhed | ~ 97% | ~ 99% | |
Tabel 1: Komparativ analyse mellem Raffineret mikroglial Isolation Metode og den oprindelige metode til isolation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ældre mikrogliaceller isoleringsmetoder har begrænsede inddrivelser som ikke er passende til forskellige proteinanalyser ved Western blot og RNA analyser ved QRT-PCR. Den differentielle adhærens og milde trypsinisering metoder er to almindelige fremgangsmåder med lave mikroglialceller udbytter 13, 14, 15. Søjlen-baserede CD11b tilgang har også lav genvinding, men opnår større renhed end forskellen adhærens og mild trypsinering 13, 14, 15, 16, 17. Vores oprindelige kolonne-fri CD11b tilgang stærkt forbedret de isolerede udbytter, hvilket gør den velegnet til protein og RNA-analyser såsom Western blotting og QRT-PCR, men på bekostning af nedsat renhed 15.
Vores nyligt ændret metode bevarerudbytterne af den oprindelige metode og forøger renheden lidt fra ~ 95-97% til ~> 99%, men på den halve færdiggørelse tid, som er kritisk for celleoverlevelse. Afgørende skridt i protokol kan sikre optimal mikroglial isolation. Mens decapitating hvalpene, der skal sørges for at holde hovederne på is og at dissekere i en laminar luftstrøm kammer inden for 5-10 min. Forlængede hjerne excision gange vil gøre det vanskeligt at opnå den fulde hjernen, fordi det begynder at miste sin fasthed ved omgivelsestemperaturer, kompromittere mikrogliaceller udbytter. Især hvis trin 2.9 gentages mindst én gang, der er en observerbar forøgelse i renhed og levedygtighed. Hvis udbyttet fra separationen er lav, kan separationen gentages med færre kolber pr ml anbefalede medier, eller ved at forøge mængden af separation (> 1 ml). Faldende celle crowding generelt vil forbedre renhed, levedygtighed og udbytte. Den magnetiske inkubationstid kan forlænges i trin 2.12 at øge renheden. Dette kansikre korrekt magnetisk binding af mikrosfærerne, der er knyttet til microglia. Endvidere kan yderligere magnetiske inkubationer udføres i trin 2.9 af hensyn til øget renhed og udbytte.
Gennemførligheden af protokollen svarer til eller bedre end det oprindelige CD11b metode; imidlertid den nye metode er raffineret og kortere. En anden væsentlig fordel opnås med disse raffinerede metode er muligheden for at udnytte den røde kanal til fluorescensmikroskopi, som er besat af PE i den oprindelige metode (tabel 1) 15. Selvom vi får højt udbytte og renhed af mikroglia med fremgangsmåden, den astrocytiske udbytte opnået fra denne adskillelse er mindre rent da det bevarer nogle fibroblaster. Som beskrevet i trin 2.17, efter udpladning astrocytterne og inkubering i 6 timer, vækstmedierne bør erstattes med frisk medium. Astrocytter er den første til at knytte til kolben, mens en stor del af de fibroblaster forbliver i suspension. Udskiftning af medier, der generelt vil fjerne hovedparten af de kontaminerende fibroblaster. Selv om denne teknik sikrer en høj renhed af astrocytter, er en sekundær rensning metode til at opnå renere kulturer berettiget.
Samlet set denne modificerede CD11 isolation metode genererer højrene primære mikrogliaceller og astrocytter i løbet af kort tid. Den kortere isolation tid generelt forbedrer celle overlevelsesrater. Det giver et nyttigt modelsystem til belysning af signaleringsmekanismer underliggende både mikroglial og astroglial biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) Tilskud: NS088206 og ES026892. Den W. Eugene og Linda Lloyd Begavet Stol til AGK og dekaner professorat til AK er også anerkendt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
References
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
- Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
- Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease. Neuroscience. 302, 89-102 (2015).
- Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).
- Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
- Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally? Neuroscience. 302, 59-73 (2015).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
- Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
- Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
- Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
- Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).
