Extrações de sal sequenciais para a análise da cromatina em massa vincular propriedades de cromatina modificando complexos

Summary

Extração de sal sequencial das proteínas da cromatina vinculada é uma ferramenta útil para determinar as propriedades de vinculação de grandes complexos de proteínas. Esse método pode ser empregado para avaliar o papel das subunidades individuais ou domínios na afinidade total de uma proteína complexa em massa de cromatina.

Abstract

Elucidação das propriedades de ligação de proteínas da cromatina-direcionamento pode ser muito desafiador devido à natureza complexa da cromatina e a heterogeneidade dos mamíferos mais complexos de cromatina-modificando. Para superar estes obstáculos, adaptámos um ensaio de extração de sal sequencial (SSE) para avaliar as afinidades de ligação relativo dos complexos ligados a cromatina. Este ensaio fácil e simples pode ser usado por não-especialistas para avaliar a diferença relativa na vinculação afinidade de dois complexos relacionados as mudanças na afinidade de um complexo quando uma subunidade é perdida ou um domínio individuais é inativado e a mudança na afinidade de ligação após alterações à paisagem da cromatina. Suspendendo sequencialmente re-cromatina em massa no aumento da quantidade de sal,... somos capazes de perfil de eluição de uma proteína específica da cromatina. Usando esses perfis, somos capazes de determinar como as alterações em um complexo de cromatina-modificando ou alterações no ambiente de cromatina afetam as interações de ligação. SSE de acoplamento com outros ensaios in vitro e em vivo , podemos determinar os papéis de domínios individuais e proteínas sobre a funcionalidade de um complexo em uma variedade de ambientes de cromatina.

Introduction

Regulamento de ADN em células eucarióticas é um sistema complexo e sofisticado que é rigidamente controlado por uma variedade de proteínas que coordenar as respostas aos estímulos intracelulares e extracelulares. DNA é acondicionada em torno do histone octamers para os nucleossomas formulário, que podem ser livremente distribuídos ao longo do DNA ou compactados em bobinas apertado¹. Este arranjo estrutural do DNA e histonas é conhecido como cromatina, que é regulada por uma rede de proteínas que ler, escrever e apagar post modificações translacional (PTM) em histonas². Alguns histona PTMs, tais como a acetilação, mudar a carga de aminoácidos que são depositados, alterando as interações entre histonas e DNA². Histona PTMs servem também para recrutar reguladores transcricionais, empresas de reestruturação da cromatina, maquinaria de reparo de dano de DNA e maquinaria de replicação do DNA para regiões específicas do genoma³.

A maioria dos métodos para o estudo de interações de cromatina ou sonda interações de pequena escala ou envolvem grandes análises de todo o genoma. Estudos de ligação in vitro , frequentemente, utilizam domínios individuais recombinantes com peptídeos de histona ou DNA, em ensaios, tais como ensaios de turno electroforese mobilidade (EMSA), Calorimetria de Titulação Isotérmica, polarização de fluorescência e peptídeo pulldowns. Porque estes ensaios geralmente se concentram em um domínio de proteínas individuais, eles facilitam a compreensão de uma pequena peça do puzzle, mas não nos permitem compreender a natureza cooperativa de proteínas de vários domínios, muito menos seu papel em várias proteínas complexos. Outra camada de complexidade é adicionada pela composição heterogênea dos mamíferos mais complexos de cromatina-modificando. Esta heterogeneidade de proteína, em combinação com a natureza dinâmica da paisagem da cromatina, torna desafiador para recapitular o na vivo vinculando interações de proteínas da cromatina a cromatina em vitro.

Métodos in vivo têm feito avanços significativos; no entanto, eles são muitas vezes caro, demorado e tecnicamente desafiador. Imunoprecipitação da cromatina, seguida por sequenciamento (ChIP-seq) é muito útil para determinar a localização de proteínas e modificações do histone através do genoma, porém requer substancial otimização⁴. As proteínas são frequentemente quitosana a cromatina para preservar as interações; no entanto, isto pode produzir interações artificiais e pode causar o epítopo mascaramento⁵. Além disso, as moleculas (IP) requerem anticorpos altamente específicos e otimização extensiva de DNA cisalhamento e condições IP por ChIP-qPCR usando um sítio de ligação conhecida, que muitas vezes não é disponível a priori. Após a otimização das condições de ChIP, processamento das amostras é dispendioso e requer várias semanas ou meses para sequenciar e analisar. Embora este método é inestimável para identificar a localização da cromatina ligado proteínas através do genoma, o custo e compromisso de torná-lo proibitivo para usar esse método para gerar hipóteses sobre como pequenas mudanças podem afetar Propriedades de associação global .

Neste artigo, descrevemos como um ensaio de extração de sal sequencial (SSE) pode ser usado para examinar os perfis de ligação global de proteínas da cromatina-limite e distinguir como as alterações em uma proteína, complexo, ou global PTM perfil podem alterar interações. Apesar de extração de sal é uma técnica comum e amplamente utilizada, demonstraremos como esse método sequencial é altamente reprodutível e versátil. SSE nos permite caracterizar como uma única subunidade de um complexo ou até mesmo um único domínio contribui para afinidade geral do complexo da cromatina em massa. SSE pode também ser usado para determinar se a ligação de uma proteína é influenciada pelas alterações na paisagem de cromatina, fornecendo hipóteses interessantes para o direcionamento de marca de histona que podem ser confirmados usando ChIP-seq e outros estudos de ampla do genoma.

Adaptamos, originalmente, esse método de Wu et al., para examinar a função de Polybromo1 (PBRM1) na ligação do PBAF cromatina remodeler^6,7. Usando esta técnica, determinou o papel de PBRM1 para ligação de cromatina dentro a cromatina PBAF remodelação complexa e determinado a contribuição relativa das seis bromodomains individuais para esta função⁷.

Aqui descrevemos como otimizar esse método para explorar a ligação da cromatina em diferentes tipos de células, para avaliar a afinidade obrigatória relativa da cromatina semelhante modificando complexos, para examinar o deslocamento de uma proteína de cromatina por um inibidor químico, e para determinar os efeitos da ligação de cromatina após alterações à paisagem da cromatina.

Protocol

1. preparações

1. preparar 100 mL de solução hipotônica Buffer r.: 0,3 M de sacarose, o 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA e 0,5% NP-40. Loja a 4 ° c.
   Nota: Algumas linhas celulares, tais como HEK293T, exigem condições menos rigorosas de Lise. Se núcleos lyse facilmente, utilize d. modificado Buffer r: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl ₂, 0,05 mM EDTA, 0,1% NP-40 e 10% de glicerol.
2. Prepare uma solução stock de 250 mL de solução de x mRIPA 2: pH de Tris 100mm 8.0, 2% NP-40 e 0,5% de sódio Deoxycholate do.
3. Preparar um 100 mL de solução de NaCl 5 de M.
4. Usando o x mRIPA 2 e soluções de NaCl 5m, preparar 50 mL de solução de x mRIPA 1 para cada uma das seis sal concentrações: 0 mM, 100mm, 200mm, 300mm, 400mm e 500 mM de NaCl. Antes de iniciar o experimento, cool todas as soluções na Ice.
Linhas sob condições desejadas de células
5. crescer.
   Nota: Ao determinar os efeitos de derrubando uma proteína, SSE para a linha "knockdown" deve ser comparado com sua células. Estes SSE deve ser executadas lado a lado. Para obter exemplos usando inibidores químicos ou estímulos, consulte seções 3-5.

2. Extração de sal sequencial básica

1. colheita 8 milhões de células de cada condição e lavar duas vezes com 5 mL de PBS frio gelo.
   Nota: É fundamental ter igual número de células que possuem concentrações de proteína equivalente. O número exato de células pode precisar de ser otimizado para linhas de célula individual ou proteínas específicas. É importante não ter muitos, como o aumento nas concentrações de proteína impedirá a observação da curva de eluição, que depende de ligação do equilíbrio. No entanto, com muito poucas células não pode haver proteína suficiente para detectar a curva, e a pelota de cromatina é mais difícil de isolar e podem ser perdidos entre fracções.
2. Ressuspender as células em 1 mL de tampão A + inibidores da protease, transferir para tubos de centrífuga de micro de 1,5 mL e top giram sobre inferior a 4 ° c durante 10 min.
3. Isolar os núcleos por centrifugação a 6000 x g por 5 min a 4 ° c.
   Nota: Após esta etapa o envelope nuclear ainda deve estar intacto. Se o envelope nuclear está intacto, a pelota re-irá suspender totalmente; no entanto, quando o envelope é lysed e a cromatina é liberada, a pelota não irá re-suspender. Se o envelope nuclear não está intacto após incubação de tampão A, usar modificado A. Buffer
Inibidores de
4. Adicionar 200 µ l de mRIPA 0 mM NaCl + protease cada pellet de núcleos antes de re-suspender o sedimento. Homogeneizar a amostra cada pipetando 15 vezes com uma pipeta de 1 mL. A pelota deve Ressuspender facilmente, no entanto, os núcleos serão lyse como ele é pipetado e a amostra se tornará espesso e pegajoso e difícil de colocar.
   1. a fim de elaborar a pelota na ponta, toque final da ponta da pipeta contra o fundo do tubo. A pelota não irá dissolver totalmente uma vez que o DNA é liberado do núcleo, mas pipetagem quebrará cima
5. Quando todas as amostras têm sido homogeneizadas, incubar todas as amostras no gelo por 3 min.
   Nota: O tempo de incubação pode precisar de ser otimizada dependendo da proteína de interesse.
6. Pellet de cromatina isolado por centrifugação das amostras por 3 min a 6500 x g a 4 ° c.
7. Transferência de sobrenadante para uma centrífuga limpa 1,5 mL tubo. Esta será a fração de 0 mM. Esta solução de mRIPA de 0 mM pode atuar como uma etapa de lavagem para lise dos núcleos e remover qualquer proteínas soltas não associadas com cromatina.
Inibidores de
8. Adicionar 200 µ l de mRIPA 100 mM NaCl + protease cada pellet de cromatina antes de re-suspender o sedimento. Romper a pelota de cromatina pipetando a pelota e descer 15 vezes.
   Nota: É fundamental para ser consistente com o número de vezes que a pelota em pipetado.
9. Incubar no gelo por 3 min. Esta etapa de incubação permite que todas as amostras alcançar um estado de equilíbrio, que é particularmente importante quando existem múltiplos exemplos.
10. Centrifugar 6500 x g por 3 min a 4 ° c e transferência sobrenadante para um tubo limpo 1,5 mL.
11. Repetir 2.6-2.10 para as concentrações de sal restantes.
    Nota: Após 400 mM NaCl, mRIPA a pelota deve ser clara e como e não vai ficar no fundo do tubo. O sedimento pode ser colocado na tampa do tubo de centrífuga enquanto o sobrenadante isolado.
12. Adicionar 70 µ l de 4x do carregamento de proteína tingir de cada fração e carregar 30 µ l de cada fração em um gel do acrilamido do SDS para análise ocidental do borrão.
    Nota: Para determinar o perfil de ligação da proteína, é fundamental para carregar volumes equivalentes das concentrações de proteína igual lisado, ao invés de carregamento.
13. Realizar um western blot padrão transferindo para uma membrana e usar os anticorpos primários para proteínas de interesse.
14. Para dosar a proteína eluída da cromatina, incubar o borrão em anticorpos secundários de fluorescência infravermelho IRDye e borrão de imagem com uma câmera. Enquanto podem ser utilizados outros métodos de desenvolvimento, nós recomendamos fluorescência ou imagiologia por infravermelhos, como é mais quantitativa na natureza.
15. Uso ImageJ ou software similar para calcular a intensidade para a proteína eluída em cada concentração de sal. Pela representação gráfica da intensidade da banda contra a concentração de sal, pode ser determinado o padrão de eluição de sua proteína do interesse.

3. Extração de sal sequencial na presença de um " leitor " inibidor

1. colheita dois conjuntos de células (4 milhões) e isolar os núcleos como um padrão SSE.
2. Re-suspender ambos os conjuntos em 200 µ l de mRIPA 0 mM NaCl e incubar durante 3 min. Isso permitirá que a remoção de qualquer proteína livre nos núcleos.
3. Adicionar 200 µ l mRIPA 0 mM de NaCl para cada pellet. Adicionar o inibidor (2 µ l (+) JQ1 a 1 mm) de uma amostra e DMSO para o conjunto de controle.
4. Agitar o sedimento por pipetagem 15 vezes e incubar no gelo por 5 min.
5. Centrifugar 6500 x g por 3 min a 4 ° c e transferência sobrenadante para um tubo limpo 1,5 mL.
6. Repetir 3.3-4 para todas as concentrações de sal e realizar um western blot padrão.

4. Extração de sal sequencial na presença de um " escritor " inibidor

1. tratar as células com o inibidor (10 µM SAHA) ou DMSO por 3 h.
2. Colher células 4 milhões para cada tratamento.
3. Realizar um SSE padrão para as amostras com o inibidor adicionado para todos os buffers.

5. Sequencial sal extração seguinte dano do ADN

1. tratar células com 1 doxorrubicina µM por 1 h.
2. Alterar os meios de comunicação sobre as células e lhes permitem recuperar para 3h.
3. Colher 8 milhões de células e executar o SSE básico.

6. Extração de sal não-sequencial

1. colher 12 milhões de células e lave com PBS.
2. Dividir células que existem 2 milhões de células por tubo de centrífuga micro.
3. Ressuspender em 500 µ l de tampão A e incubar durante 10 min.
4. Isolar os núcleos por centrifugação a 6000 x g..
5. Re-suspender aglomerados em um 200 µ l de cada um dos buffers de mRIPA + NaCl.
6. Homogeneizar cada amostra pipetando 15 vezes com uma ponta de pipeta de 1 mL.
7. Incubar no gelo por 3 min.
8. Isolar a cromatina por centrifugação a 6500 x g e transferir o sobrenadante para limpar os tubos. Adicionar 70 µ l de corante a carregar e executar 30 µ l em um gel de SDS-page para análise ocidental do borrão.

Results

Neste artigo, vamos demonstrar as vantagens e aplicações do método comumente usados extração sequencial de sal (SSE) que nós adaptamos do literatura⁶. Na Figura 1, comparamos a reprodutibilidade do SSE para extrair proteínas não sequencial, detectando os padrões de eluição de ARID1a e PBRM1. Consistentemente, observamos que ARID1a, uma subunidade BAF, elutes principalmente em 200 mM NaCl e PBRM1, uma subunidade PBAF exclusiva, elutes p...

Discussion

Caracterização das interações da proteína e cromatina através da extração de sal é um método comum que tem sido utilizado por décadas de^14,15; no entanto, isso não foi sistematicamente otimizado antes de revelar sua utilidade completa. Vamos demonstrar como este método sequencial fornece uma maneira rápida e barata de distinguir entre alterações na ligação de cromatina quando a proteína ou o ambiente é alterado. SSE é altamente adaptável e otimizável e importante...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloreto de Sódio, Cristal 2.5 Kg AR (ACS)	Avantor/Macron	7581-06
Sacarose, Cristal 500 G AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	8360-04
Cloreto de Potássio, Granular 500 G AR¨ (ACS)	Base Avantor/Macron	6858-04
Trizma(R), Padrão Primário e Tampão, >=99,9% (titulação), ácido tetraacético cristalino	Sigma-Aldrich	T1503-1kg
EDTA (Etilenodinitrio), sal dissódico, di-hidratado 125 G AR (ACS)Avantor	/Macron	4931-02
NONIDET P-40 SUBSTRATO, 100mL UN3082	Amresco	E109-100ML
Tampão HEPES Solução (1M)	Gibco	15630-080
Cloreto de Magnésio, 6-Hidrato, Cristal 500 G AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	5958-04
GLICEROL, 1L	Amresco	0854-1L
SAL DE SÓDIO ÁCIDO DESOXICÓLICO, 100g	Amresco	0613-100G
Eppendorf Research mais pipeta	Fisher Scientific	13-690-032
Eppendorf 5424 R microcentrífuga refrigerada Eppendorf		5424 R
Camundongo secundário ligado a IgG HRP	Sinalização celular	7076
Sinalização celular secundária IgG ligada a HRP de coelho		7074
Anticorpo BMI-1 Anticorpo	Millipore
PBRM1 Anticorpo	Bethyl	A301-591A
ARID1a Santa	Cruz	sc-32761
BRD4 anticorpo	Bethyl	A301-9852a
(+) JQ1	Cayman Chemical Company	11187
SAHA	Cayman Chemical Company	10009929
Doxorrubicina	AK Scientific	25316-40-9
Dimetil Sulfóxido (DMSO)	Macron	4948-02
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
Mini Tanque de Gel	ThermoFisher	A25977
Albumina, Bovino (BSA)	Amresco	0332-100g	Usado como uma solução a 5% em PBS-T como solução de bloqueio para Western blots
Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)	Life Technologies	B0001
Bolt LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	B0007
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 a 250 kDa	ThermoFisher	26619
Methyl Álcool, Macron anidro		3041-10
Tripsina kEDTA, 1X	Cellgro	25-053-CI
AZIDA DE SÓDIO, 250g UN1687	Amresco	0639-250G
DODECIL SULFATO DE SÓDIO (SDS) 500g UN1325	Amresco	0227-500G
Glicina, para eletroforese, > = 99%	Sigma-Aldrich	G8898-1kg
BigTop Tubos de microcentrífuga, polipropileno	VWR	20170-333
1000 µ L Pontas de pipeta	VWR	83007-382
NuPAGE Bis-Tris Géis pré-fabricados 4-12%	Invitrogen	NW04125BOX
Hemissulfato de Leupeptina, 5 MG	RPI Produtos de pesquisa	22035-0,005	Usado para solução de inibidor de protease.
APROTININ, 10 MG	RPI Research Products	20550-0.01	Usado para solução de inibidor de protease.
PEPESTATINA A, 5 produtos	de pesquisa 30100-0,005	MG RPI	usados para a solução do inibidor da protease.
OVCA429 células	Presente de Karen Cowden Dahl. Ph.D.
HEK293T	Células HeLa ATCC	CRL-3216
	ATCC	CCL-2
Mídia 5A de McCoy	Corning Mediatech	10-050-CV
DMEM	Corning Mediatech	10-013-CV
Meio Essencial Mínimo (MEM), Pó	Corning Mediatech	50-011-PC
MEM NEAA (100X) aminoácido não essencial	Gibco	11140-050
FB-11: Soro Fetal Bovino, Fonte dos EUA	Solução	FB-11
	Life Technologies	15140-122
Glutamax	Life Technologies	35050-061
piruvato de sódio	Life Technologies	11360070
VWR Power Fonte:	VWR	13-690-032