Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Resumo

Estudar canais iônicos através de um sistema heterólogo expressar tornou-se uma técnica nuclear em pesquisa biomédica. Neste texto, apresentamos um método eficiente tempo para conseguir uma expressão de canal iónico com força controlada através da realização de transfecção transiente, sob o controlo de um promotor indutível.

Resumo

A transfecção, a entrega de ácidos nucleicos estranhos numa célula, é uma ferramenta poderosa na pesquisa de proteínas. Através deste método, os canais iónicos pode ser investigada através de análise electrofisiológica, caracterização bioquímica, estudos mutacionais, e os seus efeitos sobre os processos celulares. As transfecções transientes oferecer um protocolo simples, em que a proteína se torna disponível para análise em poucas horas ou dias. Embora este método apresenta um protocolo de tempo relativamente simples e eficiente, um dos componentes críticos é calibrar a expressão do gene de interesse a níveis fisiológicos relevantes ou níveis que são adequados para análise. Para este fim, muitas abordagens diferentes, que oferecem a capacidade de controlar a expressão do gene de interesse têm surgido. Vários protocolos de transfecção de células estáveis ​​fornecem uma maneira de introduzir de forma permanente um gene de interesse no genoma celular sob a regulação de um transcrip controlado por tetraciclinaactivação cional. Embora essa técnica produz níveis de expressão de confiança, cada gene de interesse requer algumas semanas de trabalho qualificado, nomeadamente calibração de uma curva de morte, seleção de colônias de células e, em geral mais recursos. Aqui apresenta-se um protocolo que utiliza a transfecção transitória do canal de catiões Potencial membro da subfamília V um gene transiente do receptor (TRPV1) num sistema indutível de uma maneira eficiente para expressar uma proteína de uma forma controlada que é essencial na análise de canal iónico. Nós demonstramos que usando esta técnica, somos capazes de realizar imagem de cálcio, células inteiras, e análise único canal com os níveis dos canais controlados necessários para cada tipo de coleta de dados com uma única transfecção. No geral, esta técnica fornece uma replicáveis ​​que podem ser usadas para estudar a estrutura e função de canais iónicos.

Introdução

Sistemas de expressão heteróloga é uma das técnicas mais amplamente utilizado para estudar uma multiplicidade de funções celulares ^1. Seu perfil baixo endógena de proteína, os requisitos mínimos de manutenção, o crescimento confiável e capacidade de assumir e expressar DNA estranho fizeram linhas celulares tais como embrionárias humanas de rim (HEK293) e ovário de hamster chinês (CHO) quase essencial para a pesquisa biológica ^{2, 3.} Áreas de pesquisa usando sistemas heterólogos incluem proteínas de membrana, sinalização intracelular e atividade enzimática. A seguir à transfecção de ADN ....

Protocolo

1. ligando o gene de interesse no site reprimível da Vector

1. Obter um vector indutível, como pcDNA5 / FRT / TO ou pcDNA4 / TO.
2. Analisar o gene de interesse para quaisquer locais de restrição potencialmente sensíveis existentes no meio do gene que também estão presentes no local de clonagem múltiplo do vector escolhido por ADN em silico software de análise ^4.
3. Utilizando técnicas de PCR padrão de sobreposição ^4, flanquear o gene de interesse com dois locais de reconhecimento de enzimas de restrição seleccionadas (que não são encontrados no gene de interesse), o primeiro inserido ante....

Resultados

Para criar rapidamente um modelo de expressão indutível, que feita utilização de células HEK293 que expressam a proteína Tetraciclina repressor (TR) (por exemplo, T-REX-293) e vectores que contêm sequências do operador de tetraciclina (TetO) entre o promotor CMV e o local de clonagem múltipla (por exemplo, pcDNA4 / A). Quando transfectado em células TRex-293, a expressão do gene de interesse em pcDNA4 / A é reprimida, tal como a TR liga TetO. A adição de doxiciclina ao .......

Discussão

Transfecção é um protocolo amplamente utilizado para a expressão da proteína e da pesquisa, com muitas variações diferentes para melhorar a consistência e a estabilidade de expressão. reagentes de transfecção transitória oferecer um método simples, fácil de usar o protocolo em que a célula e a proteína de interesse pode ser analisado dentro de horas ou durante a noite a partir do momento da transfecção. Infelizmente, esta abordagem pode ser imprevisível quando o modo de análise requer um nível consistente de expressão d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
pcDNA™ 4/TO Vetor de Expressão de Mamíferos	ThermoScientific Fisher	V102020
pcDNA™ 5/TO Vetor de Expressão de Mamíferos	ThermoScientific Fisher	V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Swift™   Termociclador MaxPro	Esco	n.a
Enzimas de Restrição	ThermoScientific	Fisher ER0501
Agarose	Kit de Extração Rápida de Gel Lonza	50004
PureLink	Invitrogen	K210012
NanoDrop 2000c	ThermoScientific Fisher	ND-2000C
T4 DNA Ligase	ThermoScientific Fisher	EL0011
One Shot® TOP10 Quimicamente Competente E. coli	ThermoScientific Fisher	C404006
Ampicilina (Sódio), Grau USP	Gold Bio	A-301-5
Triptona para microbiologia	Merck	6.19305E+13
Extrato de Levedura	BD worldwide	212750
SIF6000R Incubated Shaker	LAB COMPANION	45H118
NucleoSpin® plasmídeo	Macherey Nagel	740588.25
MS Fonte de Alimentação 300V	Major Science	MP-300V
Owl™ EasyCast™ Sistema de Eletroforese em Gel Mini B1A	ThermoScientific Fisher	B1A
T-REx™-293 linha celular	Invitrogen	R710-07
DMEM (1x), líquido (glicose alta)	Gibco	41965-039
HindIII-HF®	NEB	R3104S
ApaI	NEB	R0114S
CutSmart® Tampão	NEB	B7204S
pcDNA™ 6/TR  Vetor de Expressão de Mamíferos	ThermoScientific Fisher	V102520
Fetal Soro Bovino (FBS), qualificado, aprovado pela UE, origem da América do Sul	Gibco	10270106
HEPES Buffer Solution (1 M)	Biological Industries	03-025-1B
Solução de Penicilina-Estreptomicina	Biological Industries	03-031-1B
L-Alanil-L-Glutamina (Estável Glutamina) (200 mM)	Biological Industries	03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubadora	ThermoScientific Fisher	51026406
MSC-Advantage™ Gabinete de Segurança Biológica Classe II	ThermoScientific Fisher	51025411
Cloridrato de Blasticidina S	Sigma-Aldrich	15205-25MG
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (DPBS) Modificada, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Gibco	25300054
Hemacitômetro metalizado duplo com regras de Neubauer	Hausser Scientific	31000
Opti-MEM I Meio de soro reduzido	Gibco	31985070
TransIT®- Reagente de Transfecção LT1	Mirus	MIR 2300
lamínulas, espessura #1, diâmetro redondo de 12 mm	Vidro Knittel	GG-12
BioCoat™ Poli-D-Lisina (PDL)	Corning	354210
Água, Grau de Cultura de Células Biological	Industries	03-055-1A
Doxiciclina hiclato	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Fura-2, AM éster	Biotium	BTM-50034
Pluronic® F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
µ-Slide 8 Well	ibidi	80826
(E)-Capsaicina	Tocris	462
Microscópio de Fluorescência Olympus IX70	Olympus	n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher	Sutter Instruments	n.a
EXi Câmera de Microscopia de Fluorescência Azul	QImaging	n.a
MetaFluorence Ratio Imaging Software	Molecular Devices	n.a
Tubo de borosilicato de parede fina	Sutter Instruments	B150-110-7.5HP
Tubo de borosilicato de parede padrão	Sutter Instruments	B150-86-7.5HP
Dimetilsulfóxido anidro	Sigma-Aldrich	276855
P1000 extrator de micropipetas	Sutter Instruments	P-1000
MF-900 Microforge	NARISHIGE	n.a
Sistema de perfusão ValveBank	AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Sistema de Aquisição de Dados de Baixo Ruído	Molecular Devices	n.a
Axopatch 200B Amplificador	Molecular Devices	n.a
Instrumentos	moleculares	n.a

MP-225 de Sutter dos dispositivos moleculares do software do pCLAMP 10,6