Artigo de método

Visualizando a angiogênese por Multiphoton microscopia In Vivo no andaime de 3D-PLGA/nhập geneticamente modificado para raspagem crítico reparo de defeito ósseo

DOI:

10.3791/55381

⸱

7 de setembro de 2017

 ,  ,  , 
1Center for Translational Medicine Research and Development, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 2Department of Orthopedic Surgery, Maastricht UMC+, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital RWTH, 4Research Laboratory for Biomedical Optics and Molecular Imaging, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar vasos sanguíneos formação em vivo e em tempo real em 3D andaimes por microscopia do multiphoton. Angiogênese em andaimes geneticamente modificados foi estudado em modelo murino raspagem de osso crítico defeito. Mais novos vasos sanguíneos foram detectados no grupo de tratamento do que em controles.

Resumo

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A reconstrução de defeitos ósseos criticamente tamanho permanece um problema clínico sério por causa do pobre angiogênese dentro engenharia de tecido andaimes durante o reparo, que dá origem a uma falta de oferta suficiente de sangue e provoca necrose dos tecidos novos. Rápida vascularização é um pré-requisito vital para a sobrevivência de tecido novo e integração com o tecido do hospedeiro existente. A geração de novo da vasculatura em andaimes é um dos passos mais importantes na tomada de regeneração óssea mais eficiente, permitindo a reparação do tecido a crescer em um andaime. Para resolver este problema, a modificação genética de um andaime de biomaterial é usada para acelerar a angiogênese e osteogênese. No entanto, visualização e acompanhamento na vivo formação de vasos sanguíneos em tempo real e em três dimensões (3D) andaimes ou novo tecido ósseo ainda é um obstáculo para a engenharia de tecido ósseo. Microscopia do multiphoton (MPM) é uma modalidade de bio-imagem romance que pode adquirir dados volumétricos de estruturas biológicas de forma minimamente invasivos e de alta resolução. O objetivo deste estudo foi Visualizar angiogênese com microscopia do multiphoton na vivo em um andaime de 3D-PLGA/nhập geneticamente modificado para reparo de defeito de fragmento ósseo crítico. Andaimes PLGA/nhập foram acrescidas para a entrega sustentada de um gene de factor de crescimento pdgf-b carregando Lentivirus vetores (LV -pdgfb) para facilitar a angiogênese e aumentar a regeneração óssea. Em um andaime implantados raspagem osso crítico defeito modelo do rato, as áreas de vaso sanguíneo (BVAs) em PHp andaimes foram significativamente maiores do que em PH andaimes. Além disso, a expressão de pdgf-b e genes relacionados com angiogênese, vWF e VEGFR2, aumentado correspondentemente. MicroCT análises indicaram que a formação de osso novo no grupo PHp dramàtica melhorado em comparação com os outros grupos. A nosso conhecimento, esta é a primeira vez que microscopia do multiphoton foi usada em engenharia de tecidos ósseo para investigar a angiogênese em um andaime biodegradável 3D em vivo e em tempo real.

Introdução

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Osso é um tecido altamente vascularizado que continua a remodelar-se durante o tempo de vida de um indivíduo1. A regeneração óssea rápida e eficaz de defeitos de osso grande resultantes de trauma, pseudartrose, ressecções tumor ou malformações craniofaciais é um processo fisiológico complexo. Abordagens terapêuticas tradicionais utilizadas para reparo de defeito ósseo incluem implantação autograft e aloenxerto, mas sua utilização envolve vários problemas e limitações, como disponibilidade limitada, morbidez do local doador significativo, um alto risco de infecção, e Hospede de2,de rejeição imune3. No entanto, enxertos ósseos artificiais oferecem uma alternativa eficiente para aliviar essas limitações. Eles podem ser feitos de materiais biodegradáveis, são fáceis de ser fabricar com um tamanho de poro adequado e podem ser geneticamente modificados4,5.

Atualmente, vários andaimes de engenharia de tecidos têm sido empregadas no desenvolvimento da engenharia de tecido ósseo6,7. Para induzir a regeneração e reparação óssea mais eficazmente, engenharia biomateriais combinados com fatores de crescimento têm emergiu e alcançado bons resultados8,9. Infelizmente, a meia-vida curta, fácil-à-perder atividade e suprafisiológicas dosagem de fatores de crescimento para eficácia terapêutica limitam sua aplicação clínica10. Para superar estes problemas, demonstrou-se a entrega de genes de fator de crescimento, em vez de fatores de crescimento como uma abordagem eficaz para sustentar a bioatividade para o tratamento de defeitos ósseos e doenças11,12. Vetores virais são promissor entrega ferramentas para regeneração tecidual devido a sua alta eficiência13de expressar.

Entre os fatores de crescimento, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB) foi selecionada neste estudo porque é não só um mitógeno e quimiotático para células mesenquimais e osteogênicas, mas também um estimulante para a angiogénese14,15 . Estudos pré-clínicos e clínicos anteriores mostraram que PDGF-BB poderia com segurança e eficazmente promover reparação óssea em defeitos ósseos periodontais16,17. Estudos recentes revelaram que o PDGF-BB estimula angiogênese por motivação endothelial da pilha da proliferação e migração na vivo18,19. Além disso, PDGF-BB também pode processar as células-tronco mesenquimais (MSCs) capazes de se diferenciar em células endoteliais20e este mais destaca o papel potencial do MSCs na neovascularização. Portanto, induzindo a formação de novo da vasculatura em andaimes com PDGF-BB é um passo importante para a reparação do tecido crescido em andaimes em engenharia de tecido ósseo.

Defeito de consolidação é um processo morfogenético tecido dinâmico que requer coordenada osteogênese e angiogênese na reparação posições21. Neoangiogênese em andaimes engenharia de tecido implantados é um pré-requisito essencial para o fornecimento de células com nutrientes e oxigênio para o crescimento e sobrevivência e para a remoção de resíduos metabólicos. Comumente usado métodos de imagem, incluindo raios x micro computado-tomografia computadorizada (microCT), ressonância magnética (MRI), microscopia eletrônica de varredura (MEV), a tomografia de coerência óptica (OCT) e laser confocal, microscopia, são aplicados em vez de exame histológico para obter informações de angiogênese22,23. No entanto, estes métodos de enfrentam vários obstáculos em Visualizar e medir a neovasculature em 3D andaimes em engenharia de tecido ósseo. Microscopia do multiphoton (MPM) é uma técnica de bio-imagem relativamente nova que tem a vantagem distinta de simultaneamente Visualizar células, matriz extracelular e em torno de redes vasculares in vivo. Possui uma capacidade inerente de imagem tridimensional para penetração profunda do tecido e provoca baixo Fotodano. Daí, na última década, MPM tem ganhado muita atenção em estudos biomédicos24, incluindo em neurociência, imunologia e dinâmica de células-tronco. No entanto, quase não é usado em investigação ortopédica.

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Protocolo

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o cuidado animal estava em conformidade com o guia para o cuidado e o uso do laboratório de animais da província de Guangdong. Todos os procedimentos foram realizados sob a supervisão e aprovação do Comitê de ética para pesquisa Animal, Shenzhen institutos de tecnologia avançada, Academia Chinesa de Ciências.

1. produção de Lentivirus (LV)

site
  1. Clone do cDNA de pdgf-b em um vetor de expressão Lentivirus (pLenti6/5-eGFP ou LV-eGFP) em um múltiplo-clonagem personalizada a jusante do promotor citomegalovírus utilizando Spe eu e Sal Sites de restrição para construir o plasmídeo pLenti6/5-PDGFB-eGFP (LV - pdgfb) 25.
  2. Produzir particulas de Lentivirus (LV - pdgfb) de células HEK - 293 FT por co transfecting com plasmídeos de empacotamento de vírus (pLP1, pLP2 e pVSV-G) usando o método padrão de fosfato de cálcio com cloroquina (concentração final: 25 µM) 25.
  3. após 48 h de transfeccao, colheita e filtrar 500 mL de vírus contendo sobrenadante com um filtro (0,45 µm). Posteriormente, concentrar as partículas virais por ultracentrifugação a 89.000 x g durante 2 h. Ressuspender em 200 µ l de tampão fosfato salino (PBS), alíquota e armazene-o a -80 ° C.
  4. Para determinar o título de lentivirus, incubar HEK293T células com solução de Lentivirus serialmente diluída por 24 h e calcular o título Lentivirus, como descrito anteriormente 25.

2. Fabricação de andaimes PLGA/nhập 3D-impresso e imobilização LV

material
  1. dissolver 20 g de PLGA (Poly D, L-lactidas-co-glicolido) em 20 mL de 1,4-dioxano, para formar uma solução homogênea. Adicionar 2 g de nanosized pó de HAp (nano-hydroxyapatide) (nhập) para a solução; o PLGA: nhập relação deve ser de 10:1 (w/w).
  2. Agite a solução mista vigorosamente (agitando a velocidade: 1.500 rpm) à temperatura de 16 h, utilizando um agitador magnético para formar uma pasta uniforme. Fabricá-las em andaimes PLGA/nhập porosos usando uma impressora 3D de baixa temperatura com um bocal computadorizado que os depósitos de fundo colar camada por camada, topo, de acordo com um modelo pré-concebidos 26; os tamanhos de poros dos andaimes variam de 200 a 400 µm.
  3. Vácuo congela os andaimes para 48 h remover o solvente tão completamente quanto possível. Mergulhe os andaimes em solução de etanol 75% por 1h para esterilização e lyophilize para obter andaimes neutros, assépticos.
    Nota: Os parâmetros principais para vácuo liofilização incluem a temperatura de condensação (° C) e o grau do vácuo (Pa). Sob um grau de vácuo de 45 Pa, os andaimes PLGA/nhập foram vácuo liofilizado-78 ° c durante 48 h remover completamente o solvente.
  4. Adicionar 10 µ l de partículas de LV (4,5 x 10 5) para cada PLGA/nhập andaime (4 x 4 x 2 mm) e incube-os andaimes para 2 h a 37 ° C numa incubadora umidificado para permitir adsorção.
  5. Após a imobilização, enxagúe os andaimes duas vezes com PBS para remover partículas de LV desacopladas. Os andaimes de partículas revestidas de LV snap-congelamento em nitrogênio líquido, lyophilize novamente e armazenar a-80 ° C para uso futuro.

3. In Vitro Cinética de liberação de partículas LV de andaimes e ensaio da atividade transdução LV

  1. incubar 3D andaimes (4 x 4 x 2 mm) transporte verde LV-proteína fluorescente (LV-eGFP, 4.5 x 10 5 LV partículas) em 1 mL de DMEM completa em 2,0 mL criogênico frascos de 37 ° C, com agitação por 5 dias.
  2. Tirar uma amostra de 1 mL cada 12 h de 12 h de pós-incubação 120 h e substituir o medium. Em cada ponto de tempo, adicione 1 mL de meio fresco, em vez de 1 mL de meio de incubação.
  3. Usar a mídia coletada para transduce HEK293T células por co incubar por 48 h. medida que o número de partículas de LV bioativos, determinando o número de GFP-positivo HEK293T células por citometria de fluxo 27.
    1. Antes transducing as células HEK293T, remover o meio de cultura e enxágue as células HEK293T duas vezes com PBS. Adicionar mídia coletadas contendo lentivirus libertado os andaimes para o poço (1 mL/poço) e a cultura com as células HEK293T por 48 h a 37 ° C numa incubadora umidificado.

4. In Vitro Avaliação da migração da medula óssea-derivado de MSC (BMSC)

  1. antes do ensaio de migração, prepare BMSCs expressando a proteína fluorescente de tomate (BMSCs-T) e de proteína (BMSCs-P) de PDGF-BB 28.
  2. Realizar o ensaio de migração BMSC com uma câmara de Boyden usando uma placa de 24 e filtros de policarbonato com um tamanho de poro de 8 µm.
    1. Lugar 0,5 mL de BMSCs (5 x 10 4) transfected com LV expressando a proteína fluorescente do tomate (BMSCs-T) nas câmaras superiores. 0,5 ml de BMSCs (2 x 10 5) transfected com LV expressando a proteína PDGF-BB (BMSCs-P) nas câmaras inferiores.
  3. Incluir seis grupos neste experimento e adicionar 500 µ l para o compartimento inferior de cada poço.
    R. em branco controle, livre de soro médio apenas
    controle de B. FBS, meio suplementado com 10% FBS
    controle C. PDGF-BB, 4 ng/mL PDGF-BB em meio livre de soro
    D. PDGF-BB aproveitar o grupo, PDGF-BB (4 ng/mL) e anticorpo policlonal anti-PDGF-BB (4 ng/mL) meio livre de soro
    grupo de E. BMSC, 2 x 10 5 BMSCs em meio livre de soro
    Grupo F. BMSCs-P, 2 x 10 5 BMSCs-P em meio livre de soro.
  4. Incuba durante 48 h a 5% de CO 2 e 37 ° C numa incubadora umidificado. Depois, retire as células migradas na parte inferior da câmara e coletá-los para a quantificação do número de BMSCs-T por citometria de fluxo.
    1. Remover células migradas na câmara baixa do lado com uma espátula de célula e ressuspender as células migradas com 2 mL de PBS. Quantificar o número de BMSCs-T migrado por citometria de fluxo 29.

5. Estabelecimento de uma transplantação de andaime e raspagem crítico osso defeito modelo murino

Nota: camundongos BALB/c masculino (7 semanas de idade) foram comprados de Guangdong Medical Laboratory Animal Center (Guangdong, China).

  1. Registrar um total de 42 ratos masculinos para o defeito ósseo raspagem experimentam. Aleatoriamente, divida os ratos em três grupos, com quatorze anos em cada grupo que receber os seguintes tratamentos: grupo A, sem implantes; Grupo B, PH andaimes implantaram (PLGA/nhập); e grupo C, PHp andaimes implantados (PLGA/nhập/LV-pdgfb).
  2. Anestesiar os animais com a administração intraperitoneal de pentobarbital de sódio (50 mg/kg). Remover peles com colar depilatório e limpar a cabeça pele com solução de álcool de 75% antes de fazer a primeira incisão. Fixe a cabeça de cada rato com um instrumento estereotáxico para mantê-lo ainda durante a cirurgia.
  3. Fazer uma incisão inicial com um bisturi e aumentá-la em seguida a sagacidadeh tesoura para criar uma incisão de 1 cm linear da pele. Raspe o periósteo do osso do crânio para revelar a superfície óssea do crânio usando um cotonete estéril.
  4. Usar um burr trépano para criar um defeito de tamanho crítico de 4 mm de diâmetro no lado esquerdo do calvaria 30. Transplantar o andaime em local do defeito ósseo.
    Nota: Defeitos de tamanho crítico (CSD) foram originalmente definidos como " o menor tamanho intra-ósseo ferida em um determinado osso e espécie de animal que não vai se curar espontaneamente durante o tempo de vida do animal. " neste experimento, o defeito de 4 mm de diâmetro é um defeito ósseo de tamanho crítico, de acordo com o estudo anteriormente 31 , 32.
  5. Usar fórceps oftálmico para mover o periósteo volta suavemente para cobrir o local cirúrgico. Suturar a incisão pele com três pontos por cm.
  6. Executar cuidados das. Administre a analgésica buprenorfina (0,1 mg/kg) para aliviar a dor. Manter a temperatura do corpo com uma almofada de aquecimento até o animal desperta. Posteriormente, alimentar os animais com comida e água e gravar sua atividade todos os dias até o final do teste. Nota: A Analgesia pode ser administrada antes do procedimento, dependendo de seu Comitê de cuidados animais locais orientações.

6. Na Vivo Imagem de angiogênese dentro o defeito ósseo com MPM

Nota: conjugado FITC 250 kD dextran (10 mg/mL) em solução salina foi injetado por via intravenosa em ratos para obter alta-SNR (relação sinal-ruído) imagens de novos vasos sanguíneos de acordo com um estudo anterior 33. Por favor, note que este é um procedimento de sobrevivência...

  1. montar o sistema de microscopia do multiphoton (MPM) para dois fotões animada fluorescência (TPEF) e imagem latente de sinal (SHG) segunda geração harmônica.
  2. Anestesiar os animais com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (50 mg/kg) e imobilizar os animais em uma placa de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 ° C durante os experimentos. Use gás de isoflurano 3,0% em 100% de oxigênio para manter satisfatória anestesia e analgesia durante o processo de geração de imagens. Intraperitonealmente injetar soro fisiológico (200 µ l/animal) para evitar a desidratação antes de imagem.
  3. Tune o laser de femtosecond Ti-safira para 860 nm. Criar uma área de 512 x 512 µm amostragem pela verificação de um par de espelhos galvo e usar NA1.0 lente objetiva de imersão de água para focusthe feixe de excitação para a amostra e para coletar o sinal TPEF/SHG retroespalhado.
    Nota: A imagem foi realizada em um casa-compilação do multiphoton microscópico sistema da imagem latente (MPM). Durante a imagem latente, um laser de femtosecond Ti-safira estava sintonizado para 860 nm como o comprimento de onda de excitação ideal. O feixe de laser foi raster digitalizado através de um avião de amostra usando um par de espelhos de galvanômetro. Depois de passar por um espelho dicroico de 685 nm, o feixe centrou-se na amostra por um objectivo de NA1.0 X 20. Sinais TPEF e SHG induzidos foram coletados pelo mesmo objectivo. Os sinais foram divididos do laser da excitação pelo espelho dicroico mencionado acima e purificado por um filtro de passa-curto de 680 nm. Os sinais TPEF e SHG foram coletados por um feixe de fibras e conduzidos para um espectrógrafo. O detector no espectrógrafo foi uma matriz linear de tubos fotomultiplicadores (PMTs). A combinação do espectrógrafo e matriz linear PMTs ofereceu a capacidade de gravar o sinal em 16 bandas espectrais consecutivas, de 400 nm a 600 nm, em intervalos de 12,5-nm. Portanto, os sinais TPEF e SHG foram detectados simultaneamente e separados em domínios espectrais. Além disso, para geração de imagens 3D, um motor axial era usado para controlar a profundidade da imagem latente. A área de cada imagem foi definida como 512 x 512 µm, e o intervalo de profundidade foi definido como 2 µm (grupo controle, 5 µm). Notavelmente, 5 sites em cada defeito foram fotografadas para coletar dados estatisticamente significativos, e os sites de imagens selecionados foram distribuídos aleatoriamente e uniformemente ao longo do defeito.
  4. Scan 5 sites em cada defeito para coletar dados estatisticamente significativos para medir a formação de vasos.
    1. Uso procurar sites aleatoriamente e uniformemente distribuídos ao longo do defeito. Para o grupo de controle, tem o campo de visualizar a capa (FOV) área de osso original e a borda do defeito, mas para os grupos de PH e PHp, tem o FOV no cadafalso implantado.
    2. Fazer uma incisão de 1 cm de pele linear usando um bisturi e sutura da pele aberta à fixação para revelar o site de transplante. Use uma seringa para colocar uma gota de água entre a lente de imersão e transplantes para formar um copo de água.
  5. Imagem de adquirir pilhas cada 12 s mais um h 2 período de imagem. Exibir e analisar dados volumétricos utilizando um programa personalizado de MATLAB e quantificar as áreas de vaso sanguíneo com ImageJ software 34 , 35.

7. Análise da expressão de gene de pdgf-b e angiogênese relacionados Genes por RT-qPCR

Nota: PCR foi realizado seguindo as etapas usuais: 95 ° C por 30 s, 40 ciclos de 95 ° C por 5 s e 60 ° C por 30 s. fusão de Post-PCR curvas confirmaram a especificidade do único alvo-amplificação, e determinou-se a mudança de dobra do gene de interesse em relação a β-actina. A reação para cada amostra foi testada três vezes.

  1. Colheita implantou andaimes e os tecidos de ratos experimentais em 2, 4 e 8 semanas pós operação 36; amostras do grupo de controlo (n = 4), tomado nos pontos de tempo mesmo, deve ser de tecido ósseo adjacente.
    Nota: Em cada ponto do tempo (2, 4 e 8 semanas), eutanásia os ratos com inalação de CO 2. Dissecar o calvaria e, posteriormente, remover e colher os andaimes implantados desde o calvaria.
  2. Usar um reagente comercial para extrair o RNA total de cada amostra de acordo com o fabricante ' protocolo s. Use o Kit de transcrição reversa para inverter-transcrever o RNA em cDNA seguindo o fabricante ' protocolo de s.
  3. Executar quantitativo PCR em tempo real usando o sistema de detecção de SYBR Green; os primers são listados na tabela 1.
Primer(5'–3')
Gene para a frente inverter
pdgfb CATCCGCTCCTTTGATGATCTT GTGCTCGGGTCATGTTCAAGT
vWF CTCTTTGGGGACGACTTCATC TCCCGAGAATGGAGAAGGAAC
VEGFR2 GAAATGACACTGGAGCCTACA AG TCCATGCTGGTCACTAACAGAA G
β-actin AGG GTATCCATGAAATAAGTGGTTAC CAAT GCAGTACATAATTTACACAGAAG

tabela 1: moda Pimer.

8. MicroCT análise de regeneração óssea

  1. Euthanize ratos com inalação de CO 2 no pós operação de 8 semanas. Em um ambiente bem ventilado, coloque cada rato numa jaula de rato limpa delicadamente e bomba de gás de CO 2 para a jaula para anestesiar os ratos antes da eutanásia.
  2. Dissecar o crânio para a imagem latente de microCT na região do defeito ósseo. Usuário os seguintes parâmetros nos experimentos de digitalização: 9 resolução µm, Al filtro de 0,5 mm, 50 kV tensão e atual 142 µA.
    3. Recon
  3. struct todos os dados de imagens usando o software comercial fornecidos pela empresa. Calibrar os exames usando a função de calibração de um software CTAn.
    Nota: Coloque uma unidade de Hounsfield (HU) sob os ratos em cada verificação.

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Resultados

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Porosa cilíndrica de PLGA/nhập moldes 0,6 mm de altura e 4 mm de diâmetro foram fabricados com uma impressora 3D. As morfologias dos andaimes foram analisadas através de microscopia de varredura de elétrons e microCT. A figura 1A mostra a foto do cadafalso implantado. MicroCT varredura revelou que mais de 85% dos poros tinham tamanhos que variam de 200 a 400 µm (figura 1B). Imagem SEM demonstrou que a superfície do andaime tinha um microtopography áspero,...

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Discussão

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Osso é um tecido altamente vascularizado, com uma capacidade única de curar e remodelar durante toda a vida de um indivíduo1continuamente. O nível da vascularização é importante para o reparo de osteogênese e defeito. Baixa vascularização limita a aplicação clínica ampla da engenharia de tecido ósseo. Construir um osso altamente vascularizado engenharia de tecidos, de acordo com a teoria da biomimética, tornou-se uma ferramenta para a reparação de defeitos ósseos de segmento grande. Vários tipos d...

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Divulgações

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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

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Este estudo foi suportado pelo programa pavão Shenzhen, China (n. º 110811003586331), programa de pesquisa básica Shenzhen (n. º JCYJ20150401150223631, n. º JCYJ20150401145529020 e não. JCYJ20160331190714896), a Guangdong público pesquisa e capacitação programa especial (n º 2015A020212030), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 81501893), o programa de pesquisa de Basic Major nacional da China (2013CB945503) e o Programa de inovação SIAT para excelentes jovens investigadores (Y5G010).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeo) (PLGA)SigmaP1941Relação L/G 75:25, MW 66000-107000
Nanopartículas de hidroxiapatitaSigma702153Diâmetro médio < 200 nm
Sal de difosfato de cloroquinaSigmaC6628
Dextrano conjugado com FITC 250-kDSigmaFD250S
1,4-dioxanolingfeng, Filtros Stericup Shanghai0,45 mícron
Merck Millipore CorporationSLHV033RB
PDGF-BB CdnaSino Biological, IncMZ50801-G
Anti-PDGF-BB anticorpo policlonal de camundongonbsp; BioVision, Inc5489-30T
PDGF-BB proteína4489-50
Solução de transfecção de fosfato de cálcioPromega CorporationE1200
L-DMEMHycloneSH30021.01
DPBSHycloneSH30028.01
Penicilina-Estreptomicina, LíquidoThermo Fisher Scientific
FBSThermo Fisher Scientific10099-141
Transwell Corning3422
Camundongos BALB/c machosCentro de Animais de Laboratório Médico de Guangdong
pentobarbital sódico Merck1063180500
microscopiaUm caseiro nos Institutos de Tecnologia Avançada de Shenzhen para detectar fluorescência excitada de dois fótons (TPEF) e sinal de geração de segundo harmônico (SHG).
isofluranoKeyuan, Shandong401750169
TRIzol reagenteInvitrogen15596018
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)TakaraRR420B
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)TakaraRR036B
Hematoxilina e eosinaBeyotimeC0105
ParafinaLeica& nbsp;RM2235
Ultracentrifuge OPtima L-100XPBeckman CoulterL-100XP
Impressora de baixa temperatura de TsinghuaUm instrumento caseiro na universidade de Tsinghua
LightCycler 480Roche5815916001
microCTBruker1176
software comercialBruker
Buprenorfina
& recombinante 15140122 multifotônica Universidade

Referências

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