Artigo de método

A evaporação de redução de Cultura condição aumenta a reprodutibilidade da Formação multicelular esferoidal em placas de microtitulação

DOI:

10.3791/55403

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7 de março de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University in Olomouc

Neste artigo

Resumo

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A perda irregular do meio de placas de microtitulação afecta a reprodutibilidade de formação de esferóides de tumor multicelular uniforme. A melhoria das condições de cultura de forma a reduzir a perda significativa vai melhorar a reprodutibilidade de formação de esferóides e os resultados de ensaios baseados em esferóides utilizando a técnica de sobreposição de líquido.

Resumo

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Modelos de tumor que imitam de perto as condições in vivo estão a tornar-se cada vez mais popular na descoberta e desenvolvimento de medicamentos para o rastreio de potenciais drogas anti-cancro. Esferóides multicelulares (tumorais) MCTSes eficazmente imitar as condições fisiológicas de tumores sólidos, tornando-os excelentes em modelos in vitro para a optimização de chumbo e validação de alvos. Fora das várias técnicas disponíveis para a cultura de MCTS, o método líquida de sobreposição em agarose é um dos métodos mais barato para a produção de MCTS. No entanto, a transferência segura de culturas MCTS usando líquida de sobreposição para rastreio de alto rendimento podem ser comprometidas por um número de limitações, incluindo o revestimento de placas de microtitulação (MPs) com agarose e o irreproducibility de formação MCTS uniforme entre poços. MPs são significativamente propenso a efeitos de borda que resultam da evaporação excessiva de forma a partir do exterior da placa, evitando a utilização de toda a placa de drogatestes. Este manuscrito fornece melhorias técnicas detalhadas para a técnica líquida de sobreposição para aumentar a escalabilidade e reprodutibilidade da formação uniforme MCTS. Além disso, os pormenores sobre uma ferramenta de software simples, semi-automático, e universalmente aplicável para a avaliação das características de MCTS após o tratamento droga é apresentada.

Introdução

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As células cancerosas em tumores são fisiologicamente dispostos numa estrutura complexa, 3-dimensionais (3D) rodeado por matriz extracelular e células que interagem. Como quase todas as células em tecidos residir em um ambiente 3D, a necessidade de mais fisiologicamente relevante em modelos tumorais in vitro que imitam as características de tumor, resultou no desenvolvimento de várias técnicas de cultura 3D 1, 2, 3. Estes modelos estão agora a tornar-se ferramentas fundamentais de investigação para estudar o papel do microambiente do tumor em metástases de células e resposta a agentes terapêuticos em 3D 2. Além disso, em comparação com 2-dimensionais culturas de células (2d) 4, modelos 3D permitem uma melhor compreensão das interacções tumor do estroma, que afetam as vias de sinalização de células.

esferóides multicelulares de tumores (MCTSes) de linhas celulares de cancro são frequentemente usados ​​na célula c 3Dmodelos ULTURA devido à sua proximidade em relação aos tumores in vivo. Dentre as diversas técnicas em uso, a técnica líquida de sobreposição (LOT) de geração de MCTS em placas revestidas de agarose ganhou um interesse significativo para a validação de otimização de chumbo e meta de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Isto é evidente a partir dos estudos recentes que foram capazes de executar telas piloto de bibliotecas de compostos em culturas MCTS usando LOT 6, 7 com sucesso. No entanto, a variabilidade de poço-a-poço na morfologia e crescimento MCTS devido à perda irregular induzida por evaporação do meio de barreiras são comuns que acompanham o lote utilizando placas de microtitulação (MPS). Consequentemente, a formação de MCTSes não uniforme compromete a importância e relevânciade dados de ensaios farmacológicos 8, 12, 13. Além dos problemas de reprodutibilidade, um outro problema prático que afecta ensaios de alto rendimento à base de lote é o revestimento das MPs com agarose quando se utiliza líquido automático unidades de fornecimento. Embora a unidade de distribuição pode ser mantido aquecido para evitar a gelificação de agarose, o entupimento da cassete de distribuição e tubagem é uma preocupação potencial para sistemas robóticos 6.

Para superar alguns desses desafios, que recentemente inventou algumas modificações no lote de MCTS cultura 8. Estas modificações são baseadas principalmente em possíveis maneiras de evitar a perda de meio irregular das MPs, usando instrumentos que são comumente encontrados em laboratórios de rastreio de alto rendimento. Um procedimento pormenorizado do lote modificado para a geração de MCTSes de tamanho uniforme e reprodutível através trêsplacas de 84 poços (WPS) é aqui apresentado. O manuscrito apresenta também uma rotina semi-automatizado para a avaliação do tamanho de MCTS, particularmente em MCTSes parcialmente desintegradas, tratados com o fármaco que não têm um limite bem definido para a medição de área de secção transversal.

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Protocolo

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1. Preparação de placas de agarose revestidas

  1. Pesar 0,75 g de agarose de baixo ponto de fusão e adicioná-lo para 100 mL de meio de McCoy 5A (com ou sem vermelho de fenol) sem soro. Aquece-se a solução num forno de microondas e agite a cada 1-2 minutos para dissolver completamente a agarose. Autoclave a solução para esterilizá-lo.
  2. Arrefece-se a autoclave de agarose a cerca de 70 ° C e filtra-se por uma de 500 ml, 0,22 um filtro de topo por filtração sob vácuo em uma caixa de fluxo laminar. Alíquota da solução de agarose filtrada 0,75% (FAS) em volumes menores se não estiver usando a solução inteira de uma vez. Conserva-se a solução de agarose de forma asséptica pronta-para-utilização numa sala fria a 4 ° C ou frigorífico durante até 4 semanas.
  3. Anexar um pequeno tubo com uma cassete de plástico- ou dispensar com ponta de metal para um dispensador de reagente Combi e escorvar a cassete com 70% de etanol (EtOH) e, em seguida, com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) numa caixa de fluxo.
  4. Antes da utilização, aquecer uma aliquota armazenado do FAS i n o microondas para derreter-lo. Primeiro a cassete de distribuição com a solução de agarose e revestimento de 384 poços, cultura de tecidos (TC) tenha sido tratada com "especial" microplacas com 15 mL de FAS. Permitir que o de agarose em placa de arrefecer para 15-20 min antes de semear as células. Armazenar as placas revestidas com agarose assepticamente, envolvido num saco de polietileno em um quarto frio ou a 4 ° C e ao abrigo da luz directa.
    NOTA: Evitar o aquecimento repetido do FAS 0,75% para evitar uma mudança na concentração de agarose na solução estoque. placas revestidas com agarose pode ser armazenado durante até 2 semanas, quando armazenado sob as condições acima mencionadas. O FAS não requerem aquecimento durante o revestimento de placas.
  5. Limpar a gaveta de distribuição por aprontá-lo com 70-80 ° C água estéril para remover qualquer agarose restante nas pontas cassete e tubos.

2. celular Cultura e MCTS Formação

  1. células HCT116 cultura humana de carcinoma colo-rectal, como descrito anteriormentelass = "xref"> 8.
  2. Remover o número necessário de revestidos por agarose, de 384 poços, TC-microplacas tratadas de armazenamento a frio e equilibrar-los à temperatura ambiente (TA) durante 15 min.
  3. Prepare o distribuidor de reagente Combi para semeadura de células por priming uma cassete de tubo de distribuição padrão com etanol 70% e PBS estéril. Ajuste o volume de semeadura à ul necessária e a velocidade de distribuição de média usando os botões de ajuste manuais no distribuidor.
    NOTA: O processo inteiro semeadura de células é realizada sob condições estéreis e em uma caixa de fluxo laminar.
  4. Separar as células aderentes a partir do frasco de cultura de tecido, utilizando uma enzima recombinante de células-dissociação. Adicione uma suspensão da célula em um recipiente estéril com células de semente a uma densidade de 2,5 x 10 4 culas / mL por cavidade em 50? L de meio de crescimento completo. Quando mais do que uma sementeira 384-WP, agita-se as células utilizando um agitador magnético, para evitar que se deposite no fundo do copo.
  5. permitir que oplacas em repouso durante 30 min à temperatura ambiente e, em seguida, centrifuga-se durante 15 min a 4 x g.
  6. Enquanto isso, ter uma tampa ambiental-reduzir a evaporação e preenchê-lo com 8 mL de H 2 O esterilizada ou 5% de dimetil sul f óxido (DMSO) nos lados curtos (esquerda e direita) usando uma pipeta de 5 mL (Figura 1A). Em primeiro lugar, prescindir 4 ml de líquido de enchimento para a calha do lado esquerdo por varrer a ponta da pipeta lentamente cima e para baixo. Repita este passo com a calha do lado direito.
    NOTA: assegurar que o líquido acrescentado para as calhas laterais não se fundem no centro da tampa, e deixar um espaço para a troca de gás (Figura 1A). A adição de uma quantidade em excesso de H 2 O resulta na infiltração de H 2 O para o exterior da tampa e, posteriormente, nas cavidades exteriores das placas de 384 poços TC.
  7. Encha o reservatório de líquido da placa TC 384 poços com H 2 O estéril e substituir as tampas de placas regulares com as tampas ambientais cheios de líquido (Figura 2A).
  8. Colocar as placas num incubador rotativo a 37 ° C com 95% de humidade, 5% de CO 2, e 20% de O2, e permitir que as células se agregar em MCTSes durante 4 dias. Evitar a abertura da porta da incubadora durante muito tempo nos dias subsequentes, a fim de evitar que o nível de humidade de cair abruptamente.

3. meio de permuta Usando um sistema robótico

  1. No dia 4 após a formação MCTS, adicionar 30 mL de meio de pré-aquecido por poço utilizando um dispensador de microplacas máquina de lavar automática. Permitir que as MCTSes a crescer durante mais 3 dias. Substituir o meio regularmente a cada 3 dias, até atingir o tamanho desejado para a experimentação.
  2. Para aspirar um volume definido de meio de cada poço, empiricamente ajustar o Z -Altura da anilha colector. Aspirar 30 ul de meio por poço e substitui-lo com 30 mL de meio fresco, pré-aquecido.
    NOTA: Defina a velocidade de distribuição e a velocidade com que a máquina de lavar colector viaja para baixonos poços, à taxa mais baixa para minimizar a turbulência nos poços.

Imagem 4. Alto conteúdo de MCTS e Análise de Imagem semi-automatizado

  1. Imagem do MCTS em um sistema de imagem automatizado de alto conteúdo usando um objetivo ar 4X (NA 16).
  2. Defina o tempo de exposição a 11 ms eo binning a 4 x 4. Ajuste o número e espaçamento dos -stacks z ea binning pixel como desejado para o experimento para capturar uma MCTS inteiras por poço.
  3. Processar o passo a passo as imagens, conforme descrito no "leia-me", usando uma rotina em casa escrito em linguagem de programação.
    Nota: O código .m e leia-me .txt arquivos estão disponíveis como arquivos de código suplementares (Figura 1B). As medidas de rotina área de MCTS, eixos maiores e menores, perímetro e solidez das imagens 2D.

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Figura 1:Preparação de tampas ambientais e um fluxograma da rotina de semi-automático. (A) A imagem de uma tampa ambiental de redução de evaporação preenchido com a correta (à esquerda) e excesso (direita) quantidade de enchimento líquido (neste caso, 5% DMSO). A seta indica a calha-lado curto para a adição de líquido. O asterisco indica o intervalo no meio da tampa, seguindo a adição do volume correcto de DMSO. (B) Um fluxo de trabalho que mostra os passos envolvidos na rotina de análise de imagem semi-automatizada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

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A perda irregular de meio, principalmente a partir de poços periféricos, é uma questão frequentemente encontrada em MPs com volumes de cultura pequenas. Substancialmente melhores condições de cultura, tais como incubadoras com sistemas bem controlados temperatura / umidificação e deputados de redução de evaporação e tampas de placas, reduzir a perda significativa de meio através poços 8. Para medir a evaporação relativa, volumes iguais de Orange G (OG) foram adici...

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Discussão

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Revestimento de 384 poços TC placas com filtrada Agarose

A prática corrente no lote é a utilização de uma agarose de baixo ponto de fusão de 1-1,5% para revestir as placas, o que requer a agarose e / ou unidade de distribuição para ser mantido aquecido para impedir a gelificação da agarose 6. A gelificação da agarose é de interesse potencial ao preparar várias placas utilizando cassetes de distribuição de líquido com pequenas aberturas de tubos que variam entre 0,2 e 0,4...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado por doações do Ministério checo da Educação, Juventude e Desporto (LO1304) e da Agência Tecnológica da República Checa (TE01020028). Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Lakshman Varanasi para tirar as imagens estáticas de tampas ambientais.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AgaroseSigma-AldrichA9414
McCOY's 5A MédioSigma-AldrichM8403
" rápido" Filtro FiltermaxTPP995050.22 μ m, 500 mL
Multidrop™ Dispensador de Reagente Combi Thermo Fisher Scientific5840300
de Dispensação de Tubo Pequeno Thermo Fisher Scientific24073295Ponta de metal 
Placa TC de 384 poçosde placa de 6057308PerkinElmer-
de distribuição de tubo padrãoCellCarrier Thermo Fisher Scientific24072670
MicroClime Environmental LidLabcyteLLS-0310
Incubadora rotativa DMSOSigmaD4540
(SteriStore)HighRes Biosolutions23641Nº de série: D00384
Dispensador de Máquina de Lavar MicroplacasBioTekModelo Não Especificado: EL406 
Sistema de Imagem de Alto Conteúdo (CellVoyager)Yokogawa Electric CorporationNão EspecificadoModelo: CV7000
Orange GNew England BiolabsB7022S
TrypLE™ Reagente de dissociação celular recombinante expressoThermo Fisher Scientific12604021Vermelho de fenol livre
Tipo

Referências

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