A evaporação de redução de Cultura condição aumenta a reprodutibilidade da Formação multicelular esferoidal em placas de microtitulação

Resumo

A perda irregular do meio de placas de microtitulação afecta a reprodutibilidade de formação de esferóides de tumor multicelular uniforme. A melhoria das condições de cultura de forma a reduzir a perda significativa vai melhorar a reprodutibilidade de formação de esferóides e os resultados de ensaios baseados em esferóides utilizando a técnica de sobreposição de líquido.

Resumo

Modelos de tumor que imitam de perto as condições in vivo estão a tornar-se cada vez mais popular na descoberta e desenvolvimento de medicamentos para o rastreio de potenciais drogas anti-cancro. Esferóides multicelulares (tumorais) MCTSes eficazmente imitar as condições fisiológicas de tumores sólidos, tornando-os excelentes em modelos in vitro para a optimização de chumbo e validação de alvos. Fora das várias técnicas disponíveis para a cultura de MCTS, o método líquida de sobreposição em agarose é um dos métodos mais barato para a produção de MCTS. No entanto, a transferência segura de culturas MCTS usando líquida de sobreposição para rastreio de alto rendimento podem ser comprometidas por um número de limitações, incluindo o revestimento de placas de microtitulação (MPs) com agarose e o irreproducibility de formação MCTS uniforme entre poços. MPs são significativamente propenso a efeitos de borda que resultam da evaporação excessiva de forma a partir do exterior da placa, evitando a utilização de toda a placa de drogatestes. Este manuscrito fornece melhorias técnicas detalhadas para a técnica líquida de sobreposição para aumentar a escalabilidade e reprodutibilidade da formação uniforme MCTS. Além disso, os pormenores sobre uma ferramenta de software simples, semi-automático, e universalmente aplicável para a avaliação das características de MCTS após o tratamento droga é apresentada.

Introdução

As células cancerosas em tumores são fisiologicamente dispostos numa estrutura complexa, 3-dimensionais (3D) rodeado por matriz extracelular e células que interagem. Como quase todas as células em tecidos residir em um ambiente 3D, a necessidade de mais fisiologicamente relevante em modelos tumorais in vitro que imitam as características de tumor, resultou no desenvolvimento de várias técnicas de cultura 3D ^{1, 2, 3.} Estes modelos estão agora a tornar-se ferramentas fundamentais de investigação para estudar o papel do microambiente do tumor em metástases de ....

Protocolo

1. Preparação de placas de agarose revestidas

1. Pesar 0,75 g de agarose de baixo ponto de fusão e adicioná-lo para 100 mL de meio de McCoy 5A (com ou sem vermelho de fenol) sem soro. Aquece-se a solução num forno de microondas e agite a cada 1-2 minutos para dissolver completamente a agarose. Autoclave a solução para esterilizá-lo.
2. Arrefece-se a autoclave de agarose a cerca de 70 ° C e filtra-se por uma de 500 ml, 0,22 um filtro de topo por filtração sob vácuo em uma caixa de fluxo laminar. Alíquota da solução de agarose filtrada 0,75% (FAS) em volumes menores se não estiver usando a solução inteira de uma vez. Conserva-se a solução de agarose de f....

Resultados

A perda irregular de meio, principalmente a partir de poços periféricos, é uma questão frequentemente encontrada em MPs com volumes de cultura pequenas. Substancialmente melhores condições de cultura, tais como incubadoras com sistemas bem controlados temperatura / umidificação e deputados de redução de evaporação e tampas de placas, reduzir a perda significativa de meio através poços ^8. Para medir a evaporação relativa, volumes iguais de Orange G (OG) foram adici.......

Discussão

Revestimento de 384 poços TC placas com filtrada Agarose

A prática corrente no lote é a utilização de uma agarose de baixo ponto de fusão de 1-1,5% para revestir as placas, o que requer a agarose e / ou unidade de distribuição para ser mantido aquecido para impedir a gelificação da agarose ^6. A gelificação da agarose é de interesse potencial ao preparar várias placas utilizando cassetes de distribuição de líquido com pequenas aberturas de tubos que variam entre 0,2 e 0,4.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414
McCOY's 5A Médio	Sigma-Aldrich	M8403
" rápido" Filtro Filtermax	TPP	99505	0.22 μ m, 500 mL
Multidrop™ Dispensador de Reagente Combi	Thermo Fisher Scientific	5840300
de Dispensação de Tubo Pequeno	Thermo Fisher Scientific	24073295	Ponta de metal
Placa TC de 384 poços	de placa de 6057308	PerkinElmer	-
de distribuição de tubo padrão	CellCarrier Thermo Fisher Scientific	24072670
MicroClime Environmental Lid	Labcyte	LLS-0310
Incubadora rotativa DMSO	Sigma	D4540
(SteriStore)	HighRes Biosolutions	23641	Nº de série: D00384
Dispensador de Máquina de Lavar Microplacas	BioTek	Modelo Não Especificado	: EL406
Sistema de Imagem de Alto Conteúdo (CellVoyager)	Yokogawa Electric Corporation	Não Especificado	Modelo: CV7000
Orange G	New England Biolabs	B7022S
TrypLE™ Reagente de dissociação celular recombinante expresso	Thermo Fisher Scientific	12604021	Vermelho de fenol livre

Tipo