A evaporação de redução de Cultura condição aumenta a reprodutibilidade da Formação multicelular esferoidal em placas de microtitulação

As células cancerosas em tumores são fisiologicamente dispostos numa estrutura complexa, 3-dimensionais (3D) rodeado por matriz extracelular e células que interagem. Como quase todas as células em tecidos residir em um ambiente 3D, a necessidade de mais fisiologicamente relevante em modelos tumorais in vitro que imitam as características de tumor, resultou no desenvolvimento de várias técnicas de cultura 3D ^{1, 2, 3.} Estes modelos estão agora a tornar-se ferramentas fundamentais de investigação para estudar o papel do microambiente do tumor em metástases de células e resposta a agentes terapêuticos em 3D ^2. Além disso, em comparação com 2-dimensionais culturas de células (2d) ^4, modelos 3D permitem uma melhor compreensão das interacções tumor do estroma, que afetam as vias de sinalização de células.

esferóides multicelulares de tumores (MCTSes) de linhas celulares de cancro são frequentemente usados ​​na célula c 3Dmodelos ULTURA devido à sua proximidade em relação aos tumores in vivo. Dentre as diversas técnicas em uso, a técnica líquida de sobreposição (LOT) de geração de MCTS em placas revestidas de agarose ganhou um interesse significativo para a validação de otimização de chumbo e meta de ^{5, 6, 7, 8, 9, 10, 11.} Isto é evidente a partir dos estudos recentes que foram capazes de executar telas piloto de bibliotecas de compostos em culturas MCTS usando LOT ^{6, 7} com sucesso. No entanto, a variabilidade de poço-a-poço na morfologia e crescimento MCTS devido à perda irregular induzida por evaporação do meio de barreiras são comuns que acompanham o lote utilizando placas de microtitulação (MPS). Consequentemente, a formação de MCTSes não uniforme compromete a importância e relevânciade dados de ensaios farmacológicos ^{8, 12, 13.} Além dos problemas de reprodutibilidade, um outro problema prático que afecta ensaios de alto rendimento à base de lote é o revestimento das MPs com agarose quando se utiliza líquido automático unidades de fornecimento. Embora a unidade de distribuição pode ser mantido aquecido para evitar a gelificação de agarose, o entupimento da cassete de distribuição e tubagem é uma preocupação potencial para sistemas robóticos ^6.

Para superar alguns desses desafios, que recentemente inventou algumas modificações no lote de MCTS cultura ^8. Estas modificações são baseadas principalmente em possíveis maneiras de evitar a perda de meio irregular das MPs, usando instrumentos que são comumente encontrados em laboratórios de rastreio de alto rendimento. Um procedimento pormenorizado do lote modificado para a geração de MCTSes de tamanho uniforme e reprodutível através trêsplacas de 84 poços (WPS) é aqui apresentado. O manuscrito apresenta também uma rotina semi-automatizado para a avaliação do tamanho de MCTS, particularmente em MCTSes parcialmente desintegradas, tratados com o fármaco que não têm um limite bem definido para a medição de área de secção transversal.

1. Preparação de placas de agarose revestidas

1. Pesar 0,75 g de agarose de baixo ponto de fusão e adicioná-lo para 100 mL de meio de McCoy 5A (com ou sem vermelho de fenol) sem soro. Aquece-se a solução num forno de microondas e agite a cada 1-2 minutos para dissolver completamente a agarose. Autoclave a solução para esterilizá-lo.
2. Arrefece-se a autoclave de agarose a cerca de 70 ° C e filtra-se por uma de 500 ml, 0,22 um filtro de topo por filtração sob vácuo em uma caixa de fluxo laminar. Alíquota da solução de agarose filtrada 0,75% (FAS) em volumes menores se não estiver usando a solução inteira de uma vez. Conserva-se a solução de agarose de forma asséptica pronta-para-utilização numa sala fria a 4 ° C ou frigorífico durante até 4 semanas.
3. Anexar um pequeno tubo com uma cassete de plástico- ou dispensar com ponta de metal para um dispensador de reagente Combi e escorvar a cassete com 70% de etanol (EtOH) e, em seguida, com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) numa caixa de fluxo.
4. Antes da utilização, aquecer uma aliquota armazenado do FAS i n o microondas para derreter-lo. Primeiro a cassete de distribuição com a solução de agarose e revestimento de 384 poços, cultura de tecidos (TC) tenha sido tratada com "especial" microplacas com 15 mL de FAS. Permitir que o de agarose em placa de arrefecer para 15-20 min antes de semear as células. Armazenar as placas revestidas com agarose assepticamente, envolvido num saco de polietileno em um quarto frio ou a 4 ° C e ao abrigo da luz directa.
   NOTA: Evitar o aquecimento repetido do FAS 0,75% para evitar uma mudança na concentração de agarose na solução estoque. placas revestidas com agarose pode ser armazenado durante até 2 semanas, quando armazenado sob as condições acima mencionadas. O FAS não requerem aquecimento durante o revestimento de placas.
5. Limpar a gaveta de distribuição por aprontá-lo com 70-80 ° C água estéril para remover qualquer agarose restante nas pontas cassete e tubos.

2. celular Cultura e MCTS Formação

1. células HCT116 cultura humana de carcinoma colo-rectal, como descrito anteriormentelass = "xref"> 8.
2. Remover o número necessário de revestidos por agarose, de 384 poços, TC-microplacas tratadas de armazenamento a frio e equilibrar-los à temperatura ambiente (TA) durante 15 min.
3. Prepare o distribuidor de reagente Combi para semeadura de células por priming uma cassete de tubo de distribuição padrão com etanol 70% e PBS estéril. Ajuste o volume de semeadura à ul necessária e a velocidade de distribuição de média usando os botões de ajuste manuais no distribuidor.
   NOTA: O processo inteiro semeadura de células é realizada sob condições estéreis e em uma caixa de fluxo laminar.
4. Separar as células aderentes a partir do frasco de cultura de tecido, utilizando uma enzima recombinante de células-dissociação. Adicione uma suspensão da célula em um recipiente estéril com células de semente a uma densidade de 2,5 x 10 ⁴ culas / mL por cavidade em 50? L de meio de crescimento completo. Quando mais do que uma sementeira 384-WP, agita-se as células utilizando um agitador magnético, para evitar que se deposite no fundo do copo.
5. permitir que oplacas em repouso durante 30 min à temperatura ambiente e, em seguida, centrifuga-se durante 15 min a 4 x g.
6. Enquanto isso, ter uma tampa ambiental-reduzir a evaporação e preenchê-lo com 8 mL de H ₂ O esterilizada ou 5% de dimetil sul f óxido (DMSO) nos lados curtos (esquerda e direita) usando uma pipeta de 5 mL (Figura 1A). Em primeiro lugar, prescindir 4 ml de líquido de enchimento para a calha do lado esquerdo por varrer a ponta da pipeta lentamente cima e para baixo. Repita este passo com a calha do lado direito.
   NOTA: assegurar que o líquido acrescentado para as calhas laterais não se fundem no centro da tampa, e deixar um espaço para a troca de gás (Figura 1A). A adição de uma quantidade em excesso de H ₂ O resulta na infiltração de H ₂ O para o exterior da tampa e, posteriormente, nas cavidades exteriores das placas de 384 poços TC.
7. Encha o reservatório de líquido da placa TC 384 poços com H ₂ O estéril e substituir as tampas de placas regulares com as tampas ambientais cheios de líquido (Figura 2A).
8. Colocar as placas num incubador rotativo a 37 ° C com 95% de humidade, 5% de CO _2, e 20% de _O2, e permitir que as células se agregar em MCTSes durante 4 dias. Evitar a abertura da porta da incubadora durante muito tempo nos dias subsequentes, a fim de evitar que o nível de humidade de cair abruptamente.

3. meio de permuta Usando um sistema robótico

1. No dia 4 após a formação MCTS, adicionar 30 mL de meio de pré-aquecido por poço utilizando um dispensador de microplacas máquina de lavar automática. Permitir que as MCTSes a crescer durante mais 3 dias. Substituir o meio regularmente a cada 3 dias, até atingir o tamanho desejado para a experimentação.
2. Para aspirar um volume definido de meio de cada poço, empiricamente ajustar o Z -Altura da anilha colector. Aspirar 30 ul de meio por poço e substitui-lo com 30 mL de meio fresco, pré-aquecido.
   NOTA: Defina a velocidade de distribuição e a velocidade com que a máquina de lavar colector viaja para baixonos poços, à taxa mais baixa para minimizar a turbulência nos poços.

Imagem 4. Alto conteúdo de MCTS e Análise de Imagem semi-automatizado

1. Imagem do MCTS em um sistema de imagem automatizado de alto conteúdo usando um objetivo ar 4X (NA 16).
2. Defina o tempo de exposição a 11 ms eo binning a 4 x 4. Ajuste o número e espaçamento dos -stacks z ea binning pixel como desejado para o experimento para capturar uma MCTS inteiras por poço.
3. Processar o passo a passo as imagens, conforme descrito no "leia-me", usando uma rotina em casa escrito em linguagem de programação.
   Nota: O código .m e leia-me .txt arquivos estão disponíveis como arquivos de código suplementares (Figura 1B). As medidas de rotina área de MCTS, eixos maiores e menores, perímetro e solidez das imagens 2D.

Figura 1:Preparação de tampas ambientais e um fluxograma da rotina de semi-automático. (A) A imagem de uma tampa ambiental de redução de evaporação preenchido com a correta (à esquerda) e excesso (direita) quantidade de enchimento líquido (neste caso, 5% DMSO). A seta indica a calha-lado curto para a adição de líquido. O asterisco indica o intervalo no meio da tampa, seguindo a adição do volume correcto de DMSO. (B) Um fluxo de trabalho que mostra os passos envolvidos na rotina de análise de imagem semi-automatizada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A perda irregular de meio, principalmente a partir de poços periféricos, é uma questão frequentemente encontrada em MPs com volumes de cultura pequenas. Substancialmente melhores condições de cultura, tais como incubadoras com sistemas bem controlados temperatura / umidificação e deputados de redução de evaporação e tampas de placas, reduzir a perda significativa de meio através poços 8. Para medir a evaporação relativa, volumes iguais de Orange G (OG) foram adicionados a cada poço, e a mudança na absorvância OG durante 3 dias foi gravado em placas com tampas regulares e ambientais em incubadoras convencionais e rotativos. Os poços da placa foram divididos em 6 grupos com base na sua distância a partir do bordo da placa (Figura 2A). Em grupos de 1-4, houve uma alteração significativa na absorvância ao longo do tempo de OG em placas com tampas regulares em uma incubadora normal (Figura 2B). Apesar de haver também uma variação na absorvância de OGgrupo 1 em poços de placas sob a tampa / combinação incubadora rotativa ambiental (Figura 2C), os coeficientes de variação (CV) foram muito mais baixas em comparação com as das placas com tampas regulares em uma incubadora normal (Figura 2D).

A perda irregular induzida por evaporação do meio é um dos potenciais motivos de variabilidade poço a poço em tamanho MCTS e leitura ensaio em MPs 8. No entanto, placas de 384 poços com a combinação de CT incubadora ambiental tampa / rotativo resultou na formação de MCTSes uniformes entre os 6 grupos de cavidades (Figura 2E). Em contraste, MCTSes em placas com o / combinação incubadora padrão tampa regulares variar significativamente em tamanho e solidez (Figura 3F). A solidez é uma medida de MCTS esfericidade e dá o grau de desintegração da MCTS. A solidez de uma região 2D é a proporção dos pixels na convex casco da região de interesse (ROI) e é determinado pela divisão da área da ROI pela área do casco convexo da ROI. Ambas as regiões circulares e elípticas têm uma solidez de 1, e como o MCTS se desintegra, a solidez diminui. A diferença na área já tem sido relatada em Das et al. (2016) 8. O volume foi calculado a partir dos eixos maior e menor dos MCTSes.

Figura 2: As placas com a sequência mínima evaporação num aumento da reprodutibilidade MCTS. (A) Um mapa da placa é apresentado para mostrar a divisão de poços em 6 grupos. (B e C) Existe uma variação dependente do tempo significativa na absorvância relativa de OG a partir de poços em grupos de 1-4, em placas de cultura numa incubadora padrão regularmente com tampas (B) e a partir de um grupo quells em placas com tampas ambientais em uma incubadora rotativa (C). Absorv�cias Dia 3-5 OG são normalizados ao dia 0. (D) Média de currículos de OG absorção do grupo 1 poços de dias 3-5 são mostrados para as combinações tampa / incubadora duas placas. CVs são médias de 3 experiências independentes. (E) MCTSes formados em placas com a combinação tampa / incubadora rotativa ambiental não diferiram significativamente entre os 6 grupos de poços. (B) No entanto, as placas com tampas regularmente em um incubador padrão formado MCTSes de tamanho variável. Os dados são mostrados para n> 60 MCTSes por grupo. As caixas e barras horizontais dentro das caixas nas boxplots representam os dias 25 e 75 percentis e médio, respectivamente. Os bigodes representam os 5 e 95 percentis e os valores extremos são indicados pelos pontos pretos alinhados nas boxplots. Os valores de p da análise de Kruskal-Wallis, são apresentados abaixo EACh boxplot. Os dados são de pelo menos 3 ensaios independentes por placa combinação tampa / incubadora. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para determinar a potencial aplicabilidade da rotina, MCTSes sete dias de idade foram tratados com paclitaxel (PTX), vincristina (VCR), oxaliplatina (OXA), doxorrubicina (DOX), e 5-fluorouracilo (5-FU) a 3 concentrações diferentes durante 4 dias. As drogas foram obtidos a partir do Hospital Universitário Olomouc, Universidade Palacky. As imagens MCTS foram então analisados, ea área, eixos maior e menor, perímetro e solidez de MCTSes tratados foram comparados com controles (CTLs). Os eixos maior e menor foram utilizados para calcular o volume geométrico. Houve uma redução dependente da concentração na área de MCTS e o volume após o tratamento de droga (Figura 3). Apesar de 0,001 ug / mL VCR e 0,4 ug / ml de DOX e 5-FU resultou em aumento da área de MCTS, o volume aumentou significativamente apenas na sequência de 0,001 ug / ml VCR. MCTS perímetro foi significativamente diferente apenas nas maiores concentrações de PTX, DOX e 5-FU, que afetou completamente o tamanho MCTS. PTX e VCR a 0,25 ug / mL e 0,06 ug / mL e DOX e 5-FU a 100 ug / ml, resultou numa diminuição significativa na solidez, indicando uma desintegração completa-a-parcial das MCTSes (Figura 3).

Figura 3: Medida de efeitos de drogas em MCTSes pela rotina semi-automatizado. (A) Imagens de CTL e MCTSes tratados com a droga são apresentados. Barra de escala = 10 mm. As concentrações em fig / mL são dadas para cada imagem. (B) Os gráficos de barras mostram um efeito dose-dependente da PTX, VCR, OXA, DOX e 5-FU naárea e volume de 7 MCTSes dias de idade após 4 dias de tratamento. perímetros MCTS foram significativamente reduzido após 0,25 ug / ml de PTX e 100 ug / mL de DOX e 5-FU. As concentrações de droga que resultaram na desintegração completa-a-parcial de MCTSes reduziu significativamente MCTS solidez em comparação com CTL. Os dados são a média ± SD de pelo menos 5 MCTSes de 3 placas independentes. * P <0,001, # p <0,01, φ p <0,05 droga-tratado versus CTL, ANOVA de uma via com o teste de comparação múltipla de Dunnett. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.