Summary
marquage isotopique de précurseur combiné et le marquage isobare (cPILOT) est une stratégie de protéomique quantitative qui améliore les capacités de multiplexage échantillon d'étiquettes isobares. Ce protocole décrit l'application de cPILOT aux tissus à partir d'un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer et les contrôles de type sauvage.
Abstract
Il y a une demande de plus en plus d'analyser de nombreux échantillons biologiques pour la compréhension des maladies et la découverte de marqueurs biologiques. stratégies protéomiques quantitatives qui permettent la mesure simultanée de plusieurs échantillons se généralisent et réduire considérablement les coûts expérimentaux et les temps. Notre laboratoire a développé une technique appelée précurseur combinée marquage isotopique et de marquage isobarique (cPILOT), ce qui améliore l'échantillon multiplexage de marquage isotopique traditionnel ou des approches de marquage isobares. cPILOT globale peut être appliquée à des échantillons provenant de cellules, des tissus, des fluides corporels ou des organismes entiers et donne des informations sur les abondances de protéines différentes conditions relatives à travers l'échantillon. cPILOT fonctionne en 1) en utilisant des conditions de tampon à faible pH pour sélectivement peptide dimethylate N-terminales et 2) en utilisant des conditions de tampon à pH élevé pour étiqueter des amines primaires des résidus lysine avec des réactifs isobares disponibles dans le commerce (voir le tableau des Matériaux / réactifs). Le degré demultiplexage d'échantillons disponibles dépend du nombre d'étiquettes précurseurs utilisés et le réactif de marquage isobare. Nous présentons ici une analyse 12-plex en utilisant la lumière et déméthylation lourde combinée à six plex réactifs isobares pour analyser 12 échantillons de tissus de souris en une seule analyse. multiplexage amélioré est utile pour réduire le temps et le coût expérimental et plus important encore, ce qui permet la comparaison entre les nombreuses conditions d'échantillons (biologiques, réplicats stade de la maladie, les traitements médicamenteux, génotypes, ou points de temps longitudinaux) avec biais moins expérimental et d'erreurs. Dans ce travail, l'approche globale de cPILOT est utilisé pour analyser le cerveau, le cœur et les tissus du foie à travers réplicats biologiques à partir d'un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer et les contrôles de type sauvage. Mondial cPILOT peut être appliquée à l'étude d'autres processus biologiques et adapté pour augmenter le multiplexage de l'échantillon à plus de 20 échantillons.
Introduction
Proteomics implique souvent l'analyse de nombreux échantillons utilisés pour mieux comprendre les processus de la maladie, la cinétique enzymatique, les modifications post-traductionnelles, réponse aux stimuli environnementaux, la réponse aux traitements thérapeutiques, la découverte de biomarqueurs, ou les mécanismes de la drogue. Les méthodes quantitatives peuvent être utilisées pour mesurer les différences relatives dans les taux de protéine à travers les échantillons et peut être sans étiquette ou comporter un marquage isotopique (métabolique, chimique ou enzymatique). méthodes d'étiquetage des isotopes stables ont gagné en popularité car ils permettent de nombreux échantillons à analyser simultanément et conviennent à des échantillons de différentes cellules, des tissus, des fluides corporels ou des organismes entiers. Méthodes marquage isotopique 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 augmenter le débit expérimental,tout en réduisant le temps d'acquisition, les coûts et l'erreur expérimentale. Ces méthodes utilisent des spectres de masse précurseur pour mesurer les abondances relatives des protéines à partir des pics peptidiques. Au contraire, les réactifs de marquage isobares 8, 9, 10 génèrent des ions rapporteurs qui sont soit détectés dans MS / MS ou MS 3 11 spectres et ces pics sont utilisés pour rendre compte des abondances relatives des protéines.
L'état actuel de l'art dans le multiplexage de la protéomique est soit un 10-plexe 12 ou 12-plexe analyse de balise isobare 13. Multiplexage d'échantillon amélioré (c. -à > 10 échantillons) méthodes ont été développées par notre laboratoire pour les tissus 14, 15, 16, 17, et par d' autres pour l'analyse des cellules 18 sup>, 19, 20, 21 tissus, ou des peptides cibles 22. Nous avons développé une technique de multiplexage amélioré appelé marquage isotopique précurseur combiné avec le marquage isobarique (de cPILOT). CPILOT mondiale est utile pour obtenir des informations sur les concentrations relatives de toutes les protéines à travers différentes conditions d'échantillon (≥12) 14. La figure 1 montre un flux de production cPILOT général. Trypsiques ou peptides Lys-C sont marqués sélectivement à l'extrémité N-terminale avec diméthylation en utilisant un faible pH 2 et au niveau des résidus de lysine de 6-plex réactifs en utilisant un pH élevé. Cette stratégie double le nombre d'échantillons qui peuvent être analysés avec des réactifs isobares ce qui contribue à réduire les coûts expérimentaux et, en outre, réduit les étapes expérimentales et de temps.
cPILOT est flexible que nous avons développé d'autres méthodes pour étudier l'oxydation modi post-traductionnellefications, y compris les protéines modifiées 3-nitrotyrosine-14 et les peptides contenant des cystéines avec S-nitrosation (oxcyscPILOT) 23. Nous avons également mis au point une approche sélective d' acides aminés, cPILOT cystéine (cyscPILOT) 17. Acquisition MS 3 avec un haut-ion ou 11-y sélective 1 d' ion de procédé 15 peut aider à réduire l' interférence d'ions rapporteur et d' améliorer la précision quantitative des cPILOT. L'utilisation de MS 3 dans le procédé d'acquisition nécessite un instrument à haute résolution avec un analyseur de masse Orbitrap bien que les instruments de piégeage d'ions à basse résolution peuvent également travailler 24.
Auparavant, cPILOT a été utilisé pour étudier les protéines du foie à partir d' un 16 modèle de souris de la maladie d'Alzheimer. Nous décrivons ici comment effectuer une analyse globale de l'aide cPILOT cerveau, le cœur, et homogénats de foie pour étudier le rôle de la periphery dans la maladie d'Alzheimer. Cette expérience intègre la réplication biologique. En raison de la polyvalence des cPILOT, les utilisateurs intéressés peuvent utiliser la technique pour étudier d'autres tissus pour une série de problèmes biologiques et des systèmes.
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Protocol
Déclaration d'éthique: Les souris ont été achetés auprès d'un institut de recherche indépendant, biomédicale à but non lucratif et logés dans la Division des ressources animales de laboratoire à l'Université de Pittsburgh. Tous les protocoles animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation des institutions à l'Université de Pittsburgh.
1. extraction des protéines et la production de produits chimiques pour Peptides marquage
- Extrait de protéines à partir de tissus, des cellules ou des fluides corporels.
- Homogénéiser 60-90 mg de tissu (par exemple le cerveau, le cœur et le foie) dans une solution saline de tampon phosphate (PBS 1x) avec 8 M d' urée (500 pi) en utilisant un homogénéisateur mécanique. Les inhibiteurs de protéase ou phosphatase peuvent être ajoutés au tampon si nécessaire. Dans ce projet, ils ne sont pas utilisés. Utiliser les paramètres suivants pour la homogénéiseur: matrice des billes de lyse A, 4 m / s, 20 s. le tissu cardiaque peut nécessiter jusqu'à 9 cycles d'homogénéisation.
REMARQUE: Protease ou inhibiteur de phosphatase s peut être ajouté à la mémoire tampon, si nécessaire. Ils ne sont pas utilisés dans cette étude.- Retirer homogénat de tissu à partir du tube de lyse et transférer dans un tube de micro-centrifugeuse. Rincer les tubes de lyse avec 100 à 500 pi de PBS avec 8 M d'urée et de combiner la solution de rinçage avec le tissu homogénat.
- Centrifuger les tissus homogénéisés (9447 xg, 4 ° C, 15 min) et recueillir le surnageant.
- Homogénéiser 60-90 mg de tissu (par exemple le cerveau, le cœur et le foie) dans une solution saline de tampon phosphate (PBS 1x) avec 8 M d' urée (500 pi) en utilisant un homogénéisateur mécanique. Les inhibiteurs de protéase ou phosphatase peuvent être ajoutés au tampon si nécessaire. Dans ce projet, ils ne sont pas utilisés. Utiliser les paramètres suivants pour la homogénéiseur: matrice des billes de lyse A, 4 m / s, 20 s. le tissu cardiaque peut nécessiter jusqu'à 9 cycles d'homogénéisation.
- Déterminer la concentration en protéine en utilisant un dosage de l' acide bicinchoninique (BCA) selon les instructions du fabricant.
REMARQUE: dilution plus avec le tampon peut être nécessaire si la concentration en protéines est trop élevée. Les concentrations résultantes pour les échantillons provenant de ces tissus ont été dans l'intervalle 6-13 ug / ul.- Facultatif: ajouter un étalon de contrôle interne de la qualité (par exemple de la caséine alpha bovine ou une autre protéine exogène) avec le rapport standard de 1 ug: échantillon de protéine de 100 ug.
- Ajouter 100 ug (100 x 10 -6 g) de protéine de chaque échantillon de repérage individuel des tubes de micro-centrifugation. Le volume est fonction de la concentration en protéine (voir étape 1.2).
- Ajouter dithiothréitol (DTT) (40: 1 réactif à l'échantillon rapport mol) à chaque échantillon. Incuber à 37 ° C pendant 2 h. Le calcul pour le rapport molaire est basé sur la masse de la protéine d'albumine de sérum bovin (BSA), qui est de 66,5 x 10 3 g / mol.
- Ajouter iodoacétamide (IAM) (80: 1 réactif à l'échantillon rapport mol) à chaque échantillon. Incuber sur la glace dans l'obscurité pendant 2 h. Cette réaction est réalisée sur de la glace pendant 2 h pour éviter des réactions secondaires.
- Ajouter la L-cystéine (40: 1 réactif à l'échantillon rapport mol) à chaque échantillon. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Ajouter du tampon Tris 20 mM avec 10 mM de CaCl2 (pH 8,2) pour diluer l' urée à une concentration finale de 2 M.
- Ajouter L-1-tosylamido-2-cétone de chlorométhyle phényléthyle (TPCK) traité à la trypsine (50: 1 substrat à l'enzyme rapport mol) à chaque échantillon et incuber à 37 ° C pendant 24 h.
- Stopper la digestion des protéines par flash-congélation de l'échantillon dans l'azote liquide et stocker à -80 ° C jusqu'à traitement ultérieur.
3. Exemple de dessalage
- Re-acidifier les échantillons par addition d'acide formique (FA). Ajouter suffisamment FA pour obtenir une concentration finale de 0,1%. Si les échantillons sont à l'origine à -80 ° C, dégel des échantillons sur la glace avant de re-acidification.
- De-sel en utilisant les peptides C 18 hydrophile - lipophile équilibrée (HLB) des cartouches de 10 mg comme décrit précédemment 16.
- Sécher les échantillons par centrifugation sous vide (5 torr, 45 ° C, 77 x g) à un volume de ~ 10 pi.
4. diméthylation d'étiquetage (N-terminales)
- Reconstituer peptides dans 1% d'acide acétique (0,25 pg / ul) dissous dans une Chromatographie liquide à haute performance (HPLC) ou de l'eau de qualité nano-pure. Supprimer un 50 μ; G portion dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse (1,5 ml) et stocker le reste à -80 ° C.
- Ajouter 8 ul de 60 mM (4%) CH 2 O (37% en poids / volume) ou 60 mM (4%) 13 CD 2 O (20% en poids / v) pour les échantillons pour le marquage avec la lumière ou diméthylation lourde, respectivement . Typiquement, 4 pl de réactif est ajouté par 25 ug de peptides (étapes 4.2, 4.3, 4.6).
- Ajouter 8 ul de 24 mM de NaBH 3 CN ou 24 mM NaBD 3 CN pour les échantillons marqués avec de la lumière ou diméthylation lourde, respectivement.
- Vortex et secouer sur un agitateur de tube pour ~ 10 min à température ambiante.
- Stopper la réaction en ajoutant 16 pl de 1% d'ammoniac (~ 28-30% v / v) pendant 5 min. Typiquement, 8 pl de réactif est ajouté par 25 ug de peptides.
- Re-acidifier les mélanges réactionnels par addition de 8 pi de 5% FA (98% v / v).
- Combiner la lumière et peptides lourds diméthylées (figure 1) pour générer un total de six échantillons. Voir le tableau 1
- Effectuer échantillon dessalage selon les étapes 3.2 et 3.3.
5. isobare étiquetage (résidus Lys)
- Reconstituer 100 ug de peptides diméthylées (1 ug / ul) dans un tampon de 100 mM de bicarbonate d'ammonium tri-éthyle (TEAB) (pH ~ 8,5).
- Préparer les réactifs isobares comme indiqué dans le protocole du fabricant (voir le tableau des Matériaux / réactifs).
- Ajouter des réactifs isobares solubilisées (41 ul) à des peptides et des vortex pendant 10 s ~. Secouer les échantillons sur un agitateur à tubes micro-centrifugeuse pendant environ 1 h. Stopper la réaction avec 8 ul d'hydroxylamine (10% p / v) et on incube les échantillons pendant 15 min à température ambiante.
- Regrouper les six échantillons marqués en un seul mélange et dessaler (étapes 3.1 à 3.3) ou conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
NOTE: Pour améliorer la couverture protéome et de la profondeur, une stratégie de séparation multi-dimensionnelle est suggérécomme échangeur de cations forte (SCX).
6. Échange de Cation forte
- Effectuer SCX selon le protocole du fabricant (voir tableau des matériaux).
- Préparer ~ 1 ml de solution de formiate d'ammonium (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, et 500 mM) avec 10% d'acétonitrile (ACN), 0,1% FA (pH 3).
- Retirer le bouchon rouge de la partie supérieure de l'embout de pipette et appuyez sur l'embout de pipette avec la suspension d'emballage pour garantir que le matériau de garnissage est vers le bas de la pointe de pipette.
REMARQUE: Critique: Ne jetez pas la pointe de la pipette jusqu'à la fin du protocole. - Placez l'adaptateur de centrifugation sur la partie supérieure d'un tube de micro-centrifugeuse (2 ml) et de fixer la pointe de la pipette à l'intérieur.
- Ajouter 150 pi de tampon de reconstitution SCX à pointes de pipette.
- Centrifuger les embouts de pipette pour 6 min à température ambiante (4000 x g). Répétez cette étape deux fois et jeter les déchets.
- Dissoudre le peptides dans 150 ul de tampon de reconstitution SCX. Assurez-vous que le pH est 3.
- Ajouter peptides aux embouts de pipette, centrifugeuse (voir 6.1.5), et conserver l'éluant.
- Transférer le filtre et la pipette dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse (2 ml) et ajouter 150 ul de 20 mM de solution de formiate d'ammonium. Centrifuger pendant 6 min à température ambiante (4000 x g) et conserver l'éluant.
- Répétez l' étape 6.1.8 un sept fois supplémentaires, en utilisant des concentrations successives ( par exemple 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM et 500 mM) de formiate d'ammonium.
- Transfert des huit fractions SCX à tubes micro-centrifugeuse (1,5 ml) et de les concentrer en utilisant l'évaporation centrifuge (voir étape 3.3).
7. Chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS / MS) et MS 3
- Reconstituer les peptides dans l'eau de qualité par spectrométrie de masse avec 0,1% de FA, filtrer et placer dans un flacon auto-échantillonneur. Filtrer les peptides comme follOWS:
- Ajouter peptides reconstitués dans un tube de micro-centrifugation contenant un filtre de 0,65 pm (voir Matériaux tableau).
- peptides Centrifuger à 12 000 g pendant 1 min. Retirer le filtre, jeter et ajouter des peptides filtrés dans un flacon échantillonneur automatique.
- Préparer les tampons de phase mobile comme suit: 3% (v / v) avec 0,1% d'ACN FA (A) et 100% d'ACN avec 0,1% FA (B).
- Injecter 6 uL de chaque échantillon de la fraction sur une colonne SCX de piège emballé à 2 cm à C 18 matériau (5 um, 200 Â de taille de pore).
REMARQUE: le nettoyage de l'échantillon sur le piège est le suivant: 3 min, 0% B; 3 ul / min en utilisant un système de Chromatographie liquide 2D (voir Matériaux tableau). - Exécuter le procédé de séparation analytique. Utiliser un identifiant 75 um x 13,2 cm colonne de silice fondue laser à pointe tiré capillaire garnie d' un matériau C 18 (5 um, 100 Â). Le gradient est la suivante: 0-5 min, 10% B; 5-40 min, 10-15% de B; 40-90 min, 15 à 25% de B; 90-115 min, 25-30% de B; 115-130 min, 30-60% de B; 130-135 min, 60-80% de B; 135-145 min, 80% B, 145-150 min, 80-10% de B; 150-180 min, 10% B; 300 nL / min, 180 min.
- Exécuter l'acquisition de données pour le spectromètre de masse pendant le procédé de séparation analytique est en cours d'exécution.
REMARQUE: Les paramètres pour l'analyse de l' enquête MS sont les suivantes: 400-1,600 m / z, 60 000 de résolution, commande automatique de gain (AGC) Cible 1 x 10 6 ions, le temps d'injection maximale de 500 ms. Paramètres pour CID-MS / MS sont les suivantes: Haut 1-7 ou 8-14 Haut données acquisition dépendant (DDA), 3 m / z largeur d'isolement, 500 signal minimum, l' énergie de collision normalisée de 35% (NCE), 0,25 activation q , 10 ms de temps d'activation, 3 x 10 4 AGC, 50 ms temps d'injection maximale. Paramètres pour HCD-MS 3 sont les suivantes: 200 signal minimum, 4 m / z largeur d'isolement, 60% RCE, 0,1 heure d'activation, 3 x 10 5 AGC, 250 ms IT, 300-1,300 m / z plage de sélection MS / MS exclure ion parent non fragmenté.
8. Analyse des données 16
- Rechercher les fichiers RAW à l'aide du logiciel d'analyse de protéines contre une base de données appropriée, telle que la souris Uniprot.
NOTE: Il est important de créer deux flux de travail pour chaque fichier RAW afin de rechercher la lumière et des peptides diméthylés lourds. - Rechercher les fichiers RAW en utilisant les paramètres suivants: la trypsine avec deux manqués clivages, la gamme de masse peptidique 300-6,000 Da, la tolérance masse parente de 15 ppm, une tolérance à la fragmentation Da. modifications statiques: la lumière diméthylation (28,031, peptide N-terminale) ou heavy diméthylation (36,076 Da, peptide N-terminal), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
REMARQUE: Parfois, le pic diméthylé lourd est ~ 7 Da (35,069 Da, peptide N-terminale) est du pic de lumière diméthylé et devrait être incorporé ainsi dans le flux de travail de recherche de peptides diméthylés lourds. modifications dynamiques: oxydation (15,995 Da, M), une étiquette 6-plex isobare (229,163 Da, K). Inclure une recherche de base de données leurre pour donner des taux de fausses découvertes (par exemple 1 à 5%) et un noeud de quantification pour rechercher les intensités d'ions rapporteurs d'étiquettes isobares. - Statistiques
- Exporter des données dans un programme de feuille de calcul électronique afin de normaliser les valeurs d'ions rapporteurs de la protéine. Pour chaque protéine, soit diviser les rapports d'ions rapporteurs médianes ou les intensités d'ions rapporteurs brut par le rapport entre la médiane de l'étalon interne ou les intensités d'ions reporter premières de l'étalon interne, respectivement. Utilisez le logiciel statistique approprié comme un programme de feuille de calcul électronique, PersEUS ou R pour déterminer des changements importants entre les conditions échantillons.
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Representative Results
cPILOT utilise la chimie à base d'amine de peptides chimiquement de l'étiquette à l'extrémité N-terminale et les résidus de lysine et améliore les capacités de multiplexage d'échantillons. La figure 2 montre des données représentatives de MS qui est obtenu à partir d' une analyse de cPILOT 12-Plex du cerveau, le cœur et les tissus du foie à partir d' un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer et les contrôles de type sauvage. Comme le montre le tableau 1, deux réplicats biologiques pour la maladie d'Alzheimer et les souris de type sauvage sont inclus dans cette analyse 12-plexe. La figure 2A montre une paire pic doublement chargée qui est séparé par m / z espacement de 4 indiquant un seul groupe de diméthyle a été incorporé dans le peptide. Tant la lumière et lourds pics diméthylés pour cette paire sont indépendamment isolé et fragmenté avec CID. Les données MS / MS pour chacun des peptides diméthylées est représenté sur les figures 2B et C. Résultats de la recherche indiquent que cette pair de sommets appartient à la T (diméthyl) ELNYFAK (isobare-tag 6) peptide de la phosphoglycérate kinase de la protéine 1. L'ion fragment le plus intense est y 3+ qui est similaire à la fois pour la lumière et lourds pics diméthylés. Ces pics sont isolés en outre pour HCD-MS 3 et les ions rapporteurs (m / z 126-131) sont observés comme le montrent les figures 2D et 2E. Les deux séries de spectres MS 3 sont nécessaires pour obtenir des informations sur les 12 échantillons. Dans cet exemple, les rapports d'ions rapporteur (AD / WT) (maladie d'Alzheimer / contrôle de type sauvage) pour le cerveau, le foie et les tissus cardiaques sont similaires pour les deux répétitions biologiques. Les valeurs de changement de pliage pour chacune des comparaisons indiquent que la phosphoglycérate kinase 1 niveaux dans le cerveau et le coeur sont plus élevés chez les souris de la MA, alors que dans le foie, les niveaux sont inférieurs.
Figure 1: Proteomics flux de travail en utilisant cPILOT. À titre d'exemple, ce flux de travail décrit l'analyse de 12 échantillons individuels. Les protéines provenant de tissus, de cellules ou de fluides corporels sont extraits et un étalon de protéine approprié (par exemple l' alpha-caséine bovine) est ajouté. Les protéines sont digérées en utilisant de la trypsine. Les peptides sont marqués à l'extrémité N-terminale en utilisant légère ou lourde diméthylation (pH ~ 2,5) et au niveau des résidus de lysine en utilisant TMT 6 -plex (pH ~ 8,5). Peptides marqués sont réunies en un seul mélange et soumis à SCX RP-LC-MS / MS et MS 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Exemple de données cPILOT de peptides à partir de cerveau, le cœur et les tissus du foie d'un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer et les témoins de type sauvage. (A) représente la lumière et peptides lourds diméthylées, représentés par les pics à m / z 643,854 et 647,875. Ces peptides ont été choisis, isolé et fragmenté, générant ainsi des spectres CID-MS / MS (B et C), qui fournit l' identification des peptides. Une sélection supplémentaire, l' isolement et la fragmentation de l'ion de fragment le plus intense de la lumière et des peptides diméthylés lourds au stade MS / MS spectres générés HCD-MS 3 (D et E), respectivement. La séquence peptidique est T (diméthyl) ELNYFAK (isobarique-étiquette 6) et appartient à phosphoglycérate kinase 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| réactif isobarique0; | ||||||
| 126 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | |
| lumière déméthylation | WT a | AD b | WT | UN D | WT | UN D |
| cerveau | cœur | foie | ||||
| déméthylation lourd | WT | UN D | WT | UN D | WT | UN D |
| cœur | foie | cerveau | ||||
| Le tissu est soit à partir d' un contrôle de type sauvage (WT) ou une souris de la maladie d'Alzheimer (AD) b. | ||||||
Tableau 1: groupement cPILOT de la MA et WT cerveau, le cœur et le foie Tissues.
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Discussion
cPILOT permet la mesure simultanée de plus de 12 échantillons uniques. Afin d'assurer le marquage avec succès à la fois l'extrémité N-terminale et les résidus lysine de peptides, il est impératif d'avoir le pH correct pour chaque ensemble de réactions et d'effectuer la réaction de diméthylation première pour le marquage des peptides. diméthylation sélective à l'extrémité N-terminale est réalisée en ayant un pH à ~ 2,5 (± 0,2). Ceci est obtenu en tirant parti des différences de pKa des groupes amino sur la lysine et l'extrémité N-terminale. A pH 2,5, la lysine est inactif (pKa ~ 10,5); Cependant, si le pH est légèrement acide ( par exemple pH 5-7) ou de base, les deux extrémités N-terminales et les résidus de lysine sont diméthylé. En outre, si le marquage isobare est effectuée d'abord à un pH faible, la N-terminales aura les étiquettes isobares et les résidus lysine sont diméthylé. Cela peut entraîner moins des fragments être sélectionnés pour MS 3 sous forme d' ions B devraient être sélectionnés. Les coûts relatifs du dimethylLes réactions sont peu coûteux par rapport ations aux réactifs isobares commerciaux. Si l'on peut utiliser un flacon de réactif isobarique ensemble par 100 ug, nous avons également eu du succès en utilisant la moitié du flacon de réactif par 100 pg avec efficacité de marquage comparable. Cela permet de réduire considérablement les coûts pour les expériences de cPILOT individuels et permet davantage d'échantillons à analyser. En outre , il est important de noter que d' autres réactifs de marquage isobares peuvent être utilisés à la place du réactif isobarique utilisé dans ce protocole comme nous l' avons déjà démontré 14. Pour garantir un étiquetage élevé et l'efficacité de marquage, il est important d'ajouter des réactifs aux échantillons rapidement. Cela permettra à des échantillons d'avoir à peu près le même temps de réaction. Pour les besoins quantitatifs, chaque échantillon doit être traité de manière identique en particulier avant la mise en commun des échantillons à la diméthylation et les étapes de marquage isobares. Enfin, il convient de noter que le travail avec de nombreux échantillons simultanément dans les étapes initiales requires compétences utilisateur prudent et attention à la manipulation d'échantillons.
Le scénario le plus idéal est d'obtenir des ions rapporteurs pour chaque protéine dans le mélange pour les 12 échantillons. Cependant, ce n'est pas le cas pour un grand nombre de protéines. Le nombre de peptides détectés avec des informations de quantification pour cPILOT et d'autres multiplexage amélioré approche dépend de plusieurs facteurs y compris le type de l'échantillon, le fractionnement de l'échantillon et des étapes de traitement, des procédés d'acquisition de données MS et le type d'instrument. Bien que les deux diméthylation et les étapes de marquage isobares ont une haute efficacité de marquage de peptide d'environ 95 à 99%, il reste encore environ 20% des données MS 3 qui ne contiennent pas d' informations d'ions rapporteur. Cela est dû en partie à l'aide de trypsine qui génère des peptides à terminaison arginine qui donnent lieu à aucune incorporation du réactif isobare. Ceci peut être résolu en utilisant d' autres enzymes, telles que LysC, avec un compromis potentiel dans les identifications de protéines 25. Aussi pour les poids lourdspeptides diméthylés, le pic sélectionné pour la fragmentation peut être le pic M ou M-1, qui ont des intensités différentes et auront une incidence sur les intensités d'ions rapporteurs observés dans l'étape 3 MS. Ainsi, il peut y avoir des ions de faible intensité rapporteurs qui ne sont pas détectées pour certains échantillons. De telles situations sont souvent couramment observées pour une faible intensité des fragments MS / MS qui sont isolées pour les étapes MS 3. Une grande solution à ce problème a été incorporée dans spectromètres de masse tribrid, qui, au lieu d'utiliser une seule sélection de gamme pour MS 3, utilisent mutiples ou plusieurs MS / MS fragments 26.
Il y a beaucoup de polyvalence dans l'approche cPILOT en particulier en ce qui concerne le nombre d'échantillons qui peut être comparé à une seule analyse (soit jusqu'à 20 avec des réactifs isobares commerciaux) et les types de tissus utilisés. Nous avons démontré qu'il est facile d'obtenir des informations quantitatives précises du cerveau, le cœur, etles tissus du foie dans la même analyse dans le contexte d'une maladie. Cette méthode, de façon similaire à d'autres méthodes de multiplexage, permet l'analyse de plusieurs échantillons à la fois, et est applicable à des échantillons provenant de cellules, des tissus, des fluides corporels ou des organismes entiers. En outre, les peptides marqués par cPILOT peuvent être analysés en utilisant soit un instrument bas 24 ou haute résolution (60 000). En comparaison, l' obtention de la mesure effectuée à l' aide d' autres méthodes de multiplexage peut être limitée à un type spécifique de l' échantillon ( par exemple des cellules) 18, peuvent nécessiter un instrument avec une très haute résolution 20, ou l' accès à des marqueurs isotopiques stables. cPILOT est idéal pour les utilisateurs intéressés par la compréhension des maladies, la découverte de marqueurs biologiques, réponse à une intervention médicamenteuse ou thérapeutique, ou des changements longitudinaux dans de nombreux points de temps. En outre, pour les grandes analyses protéomiques de fusil de chasse d'échantillons cliniques (où N est grand, des centaines de milliers), cPIlot peut également convenir pour aider à réduire les coûts expérimentaux et de temps. À l'avenir, cPILOT sera étendu à multiplexer un plus grand nombre d'échantillons en utilisant des isotopes et des étiquettes isobares existants et nouveaux.
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Disclosures
Les auteurs ont aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent l'Université de Pittsburgh Fonds de démarrage et NIH, NIGMS R01 subvention (GM 117191-01) à RASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | - | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | - | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
References
- Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
- Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany, Siena. (1998).
- Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
- Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
- Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
- Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
- Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
- Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
- Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
- Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
- Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
