Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

Resumo

Aqui, os autores apresentam um protocolo simples e eficiente para definir um epítopo antigênico linear usando um anticorpo monoclonal purificado e varredura peptídica por meio de hibridização dot-blot. O epítopo identificado pode então ser usado em aplicações terapêuticas e diagnósticas.

Resumo

A identificação de um epítopo antigénico pelo sistema imunológico permite a compreensão do mecanismo de protecção de anticorpos que podem facilitar o desenvolvimento de vacinas e de drogas peptídicas neutralizantes. Péptido de varrimento é um método simples e eficiente, que diretamente mapeia o epitopo linear reconhecido por um anticorpo monoclonal (mAb). Aqui, os autores apresentam uma metodologia de determinação epitopo envolvendo proteínas em série truncadas recombinantes, design peptídeo sintético, e hibridação dot-blot para o reconhecimento antigênico da proteína de revestimento do vírus da necrose nervoso usando um mAb neutralizante. Esta técnica baseia-se na hibridação dot-blot de péptidos sintéticos e os mAbs em um (PVDF) de membrana de fluoreto de polivinilideno. A região mínima antigénico de uma proteína de revestimento virai reconhecido pelo mAb M56-RG pode ser reduzida por passo-a-passo aparado mapeamento do péptido para um epitopo peptidico 6-mer. Além disso, a mutagénese de varrimento de alanina e o resíduo subtuição pode ser realizado para caracterizar a importância de ligação de cada resíduo de aminoácidos que constituem o epítopo. Os resíduos que flanqueiam o local de epitopo foram encontrados para jogar um papel crítico na regulação da conformação peptídica. O péptido epitopo identificado podem ser usadas para formar cristais de complexos de péptido-anticorpo epitopo para um estudo de difracção de raios-X e a competição funcional, ou para terapêutica.

Introdução

No sistema imunitário, a recombinação de segmentos V, D, J e permite a anticorpos para criar grandes variações de regiões determinantes de complementaridade (CDR) para se ligar a vários antigénios para proteger o hospedeiro contra a infecção patogénica. A defesa de neutralização de anticorpos contra antigénios depende da complementaridade espacial entre as CDR dos anticorpos e os epítopos de antigénios. Portanto, o conhecimento desta interacção irá ajudar molecular concepção de uma vacina profilática e desenvolvimento de fármacos péptido terapêutico. No entanto, esta interacção de neutralização pode ser influenciada tanto por vários domínios antigénicos a partir de um único antigénio e por vários CDRs de anticorpos, os quais, por conseguinte, tornam o processo de determinação epitopo mais complexo. Felizmente, o desenvolvimento da tecnologia do hibridoma, o qual funde a células produtoras de anticorpos com células de mieloma individuais, permite um lote constante dividindo de células para segrete um anticorpo específico, conhecido como um anticorpo monoclonal (mAb) ^1. As células de hibridoma produzem estes puros, mAb de elevada afinidade para se ligar a um único domínio antigénico de um antigénio específico. Com a relação do anticorpo-antigénio estabelecida, várias abordagens, incluindo varrimento de péptidos, pode ser utilizado para determinar o epítopo de um antigénio usando o mAb correspondente. Desenvolvimentos recentes na tecnologia peptídeo sintético fizeram a técnica de exploração peptídeo mais acessível e mais conveniente para executar. Resumidamente, uma série de péptidos sintéticos que se sobrepõem são produzidos de acordo com uma sequência do antigénio alvo e estão associados a uma membrana em suporte sido para a hibridação de mAb. digitalização péptido não só oferece uma maneira simples para mapear a região de ligação do anticorpo, mas também facilita o aminoácido (AA) por meio de mutagénese de varrimento resíduo ou substituição para avaliar a interacção de ligação entre cada resíduo AA do péptido epítopo e as CDR do anticorpo.

Aqui, o presente estudo descreve um protocolo para a identificação eficiente do epitopo linear da proteína de revestimento garoupa amarelo vírus da necrose nervoso (YGNNV) usando um mAb neutralizante ^{2, 3, 4.} O protocolo inclui mAb preparação, a construção e expressão de proteínas recombinantes em série truncadas, de criação de péptidos sintéticos sobrepostos, hibridação dot-blot, o varrimento de alanina, e mutagénese de substituição. Considerando o elevado custo da síntese de péptidos, o passo de truncagem em série das proteínas recombinantes de uma proteína alvo desejado foi modificado, e a região antigénica foi reduzida para cerca de 100 a 200 resíduos aa antes da análise dot-blot matriz peptídica sintética foi realizada.

Protocolo

1. Preparação de Anticorpos Monoclonais

1. Cultura dos monoclonais de rato células de hibridoma RG-M56 ² em meio livre de soro em frascos de 175T a 37 ºC com 5% de suplemento de CO _2. Recolhe-se o sobrenadante quando a cor do meio torna-se amarelo após cinco dias de incubação.
   NOTA: As células de hibridoma foram cultivadas em meio isento de soro a fim de evitar a contaminação de anticorpos a partir de soro fetal de bovino.
2. Centrifuga-se o sobrenadante a 4500 xg durante 30 min a 4 ºC e descartar o sedimento de restos de células.
3. Adicionar 2 ml de agarose a proteína G (fornecido como uma pasta a 50%) a uma coluna de 5 mL e equilibrar-se com 10 volumes de resina (10 ml) de PBS gelado.
4. Carga de 200 ml de sobrenadante de anticorpo (passo 1.2) para a coluna e descartar o repasse.
5. Adicionam-se 10 mL de PBS arrefecido em gelo para a coluna de lavá-lo. Repita duas vezes.
6. Adicionar 10 ml de glicina 50 mM, pH 2,7 à coluna para eluir o anticorpo da proteína G-associado. Colcionar 900 fracções ul num tubo de microcentrífuga contendo 100 pL de 10x tampão de neutralização (Tris 1 M, NaCl 1,5 M, e EDTA 1 mM, pH 8,0).
7. Armazenar o anticorpo purificado em glicerol a 50% com 0,03% de _NaN3 a -20 ºC.

2. Construção e Expressão da série truncadas Proteínas Recombinantes

1. Prepara-se uma mistura reaccional de PCR: 5? L de 10x tampão Pfu, 0,2 mM de cada dNTP, 0,2 uM de iniciadores para a frente ^3, 0,2 fiM de primer reverso ^3, MgSO 2 mM de _4, 1 ng de pET20b 1A59 ^ADN-3 plasmídeo, e 2,5 L ( unidade) de polimerase de ADN Pfu; adicionar _ddH2O para um volume final de 50 uL.
   1. amostras de execução em um termociclador automático, utilizando os seguintes parâmetros: Ciclo 1 (94 ºC por 5 min); ciclos 2-36 (94 ºC durante 30 s, 63 ° C durante 30 s, e 72 ºC durante 60 s); e ciclo de 37 (72 ºC durante 7 min).
2. Extrai-se a reacção em cadeia da polimerase (PCR) produtos usando um kit de purificação de PCR para facilitar a ⁵ após a digestão com enzimas de restrição.
3. Digerir os fragmentos de ADN amplificados por PCR com Ndel e Xhol as enzimas de restrição e ligar cada um destes fragmentos de ADN Ndel e Xhol clivado-enzima pET-20b (+) do vetor. Transformar as construções em células de Escherichia coli-DH-5a competente ^6.
   1. Preparar a mistura de digestão em tampão de digestão (20 mM Tris-acetato, Mg 10 mM _{(CH3COO) 2,} KCH 50 mM ₃ COO, e DTT 1 mM, pH 7,9) com 1 ug de ADN amplificado por PCR ou pET-20b (+) DNA do vector, e 2 U de Ndel e Xhol as enzimas de restrição, num volume final de 20 uL.
   2. Misture a mistura de digestão suave e rapidamente girar para baixo. Incubar a 37 ° C durante 2 h num banho seco de corte para assegurar a completa da restrição sentares.
   3. Extrair os fragmentos de ADN digerido com enzimas de restrição, utilizando um kit de purificação de PCR ⁵ para facilitar a seguinte construção de plasmídeo.
   4. Preparar a mistura de ligação em tampão de ligação (Tris 66 mM, _MgCl2 5 mM, ATP 1 mM, e DTT 5 mM, pH 7,5) com 100 ng de ADN pré-digeridas, amplificado por PCR, 10 ng de pré-digerido pET-20b (+) ADN do vector, e 5 L de ligase de ADN de T4 num volume final de 10 uL.
   5. Misture a mistura de ligação com cuidado e rapidamente girar para baixo. Incubar a 16 ° C durante 18 h num banho de água.
   6. Coloque 10 uL das amostras de ligação em 100 ul de células DH-5α-competentes e misturar suavemente antes da colocação do tubo de microcentrífuga em gelo durante 30 min. Coloque o tubo de microcentrífuga em um banho seco a 42 ºC durante 90 s para induzir choque ^de calor ^7. Imediatamente transferir o tubo em gelo durante 2 min.
   7. Adicionar 900 uL de meio de Luria-Bertani (LB) (1% de Bacto-triptona, 0,5% de Bacto levedura extracT, e 0,5% de NaCl, pH 7,0) ao tubo. Incubar a 37 ° C com agitação 150 rpm durante 45 min. Agregar as células por centrifugação a 4000 x g durante 10 min e desprezar o sobrenadante.
   8. Ressuspender o sedimento com 50 ul de caldo LB e espalhar cada transformação em placas pré-aquecido LB contendo 100 ug / ml de ampicilina. Incubar as placas a 37 ºC durante 16 h.
   9. Pegar uma única colónia usando uma ponta de 200 mL e colocá-lo em caldo 3 ml de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina em um tubo de 15 frouxamente tapado mL. Incubar a 37 ° C com agitação 150 rpm durante 12 h.
   10. Extrai-se a ADN de plasmídeo a partir de ⁸ cada cultura e sequenciar-lo utilizando um promotor de T7 e iniciadores de terminador T7 para confirmar a sequência ^9.
4. Após confirmação da sequência, transformar 10 ng de DNA de pET-20b estes (+) plasmídeos com diferentes comprimentos de gene da proteína de revestimento YGNNV na estirpe BL-21 (DE3) de E. coli por nósing o método de choque de calor ^7. Siga os passos 2.3.6-2.3.8 para realizar a transformação.
5. Transferir uma única colónia de cada um de E. coli transformada BL-21 de células em caldo de 3 ml de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina num tubo de 15 ml tapado frouxamente. Incubar a cultura a 37 ° C com 150 rpm tremendo.
6. Arrefece-se a cultura a 25 ° C quando a _OD600 da cultura é de cerca de 0,6 e adicionar IPTG para uma concentração final de 0,4 mM para induzir a expressão da proteína recombinante. Incubar a cultura para um extra de 4 h a 25 ºC com 200 rpm tremendo.
7. Transferir 1 ml da cultura para um tubo de microcentrífuga. Agregar as células por centrifugação a 12000 xg durante 1 min e desprezar o sobrenadante.
8. Ressuspender o sedimento celular em 100 uL de tampão de desnaturação (ureia 8 M, fosfato de sódio 20 mM, e NaCl 0,5 M, pH 7,4) por pipetagem para cima e para baixo com uma micropipeta. Misturar em vórtice vigoroso.
   NOTA: O sol da amostradoras deve agora ser semi-transparente, um pouco pegajoso, e pronto para o ensaio de hibridação dot-blot.

3. Projeto e Síntese de péptidos sobrepostos

1. Concepção e sintetizar ³ série peptídeos 20-meros que cada coincidem com o seu sucessor por 10 resíduos de aa da região de 195-338 aa da proteína de revestimento YGNNV para diminuir a região do epitopo de RG-M56 mAb por transferência de pontos.
2. Concepção e sintetizar peptídeos ³ três 8-Mer ₍₁₉₅ VNVSVLCR _{202, 197} VSVLCRWS _204, e ₁₉₉ VLCRWSVR ₂₀₆₎ com uma sobreposição de 6 resíduos aa para o próximo peptídeo sintético para diminuir a região do epitopo de 195-206 aa por transferência de pontos.
3. Concepção e sintetizar ³ 7-mer ₍₁₉₆ NVSVLCR ₂₀₂ e ₁₉₅ VNVSVLC _201), 6-mer ₍₁₉₅ VNVSVL _{200, 196} NVSVLC _201, e ₁97 VSVLCR _202), e 5-meros péptidos ₍₁₉₅ VNVSV _{199, 196} NVSVL _{200, 197} VSVLC _201, e ₁₉₈ SVLCR ₂₀₂₎ com uma sobreposição de 6, 5, e 4 resíduos de aa, respectivamente, Onto seus péptidos vizinhos para minimizar o região de epítopo por dot blotting.

4. Dot-blot hibridação

1. Dissolve-se cada péptido sintetizado em sulfóxido de dimetilo (DMSO) a uma concentração final de 10 mg / mL.
   NOTA: Para superar a solubilidade variada de péptidos sintéticos, todos os péptidos sintéticos devem ser dissolvidos em DMSO. DMSO é um bom solvente para dissolver completamente péptidos hidrofóbicos ou hidrofílicos.
2. Embeber a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) com metanol durante 2 min.
   NOTA: membrana PVDF é até resistente a DMSO 100%; outros podem não ser assim.
3. Equilibrar a membrana de PVDF com tampão Towbin modificado (Tris 25 mM, glicina 192 mM e SDS a 0,1%, pH 8,3) para2 minutos.
   NOTA: 10-20% (v / v) de metanol pode ser adicionado ao tampão Towbin modificados para melhorar os resultados de transferência.
4. Lavar um pedaço de papel de cromatografia com o tampão Towbin modificado. Colocar a membrana de PVDF sobre o papel de cromatografia. Espere até que o tampão Towbin modificado tenha desaparecido da superfície da membrana de PVDF antes de continuar para a próxima etapa.
5. Adicionar 2 mL de cada amostra de péptido para a membrana com uma ponta de 10 uL. Ar seco a membrana de PVDF sobre o papel de cromatografia durante 10 min. Adicionar a cada amostra de péptido lenta e gradualmente para a membrana para evitar o excesso de difusão.
6. Bloquear a membrana em tampão TBST (0,05% (v / v) de Tween-20, Tris 20 mM, e NaCl 150 mM, pH 7,4) com leite magro a 5% durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave.
7. Adicionar RG-M56 mAb a uma diluição final de 1: 1000 em tampão TBST com 5% de leite desnatado à membrana. Incubar a membrana a 37 ° C durante 1 h com agitação suave.
8. Remover o anticorpo assimlução. Lava-se a membrana em tampão TBST durante 5 min com agitação suave. Repita duas vezes.
9. Adicionar o anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho, Fe, conjugado com fosfatase alcalina) numa diluição final de 1: 5000 em tampão TBST com 5% de leite desnatado à membrana. Incubar a membrana a 37 ° C durante 1 h com agitação suave.
10. Descartar a solução do anticorpo. Lava-se a membrana em tampão TBST durante 5 min com agitação suave. Repita o passo de lavagem duas vezes.
11. Desenvolver a membrana com uma solução de substrato BCIP / NBT temperatura ambiente durante 15 min no escuro. Parar o desenvolvimento por lavagem da membrana com _ddH2O quando o sinal aparece.
12. Ar seco da membrana e capturar a imagem dot-blot utilizando um sistema de imagem.
13. Medir a intensidade de cada dot blot usando uma imagem análise de software ^3.

5. varrimento de alanina e Substituição

1. Projetar e sintetizar ³ alanina e methipeptídeos de substituição onine. Substituir cada resíduo aa com alanina para o péptido 8-mer ₁₉₅ VNVSVLCR ₂₀₂ e sintetizar peptídeos ₁₉₅ ANVSVLCR _{202, 195} VAVSVLCR _{202, 195} VNASVLCR _{202, 195} VNVAVLCR _{202, 195} VNVSALCR _{202, 195} VNVSVACR _{202, 195} VNVSVLAR ₂₀₂ e ₁₉₅ VNVSVLCA ₂₀₂ . Substitua resíduo aa leucina 200 a metionina para criar o péptido epitópico SJNNV genótipo ₁₉₅ VNVSVMCR _202.
2. Siga Seção 4 para realizar pesquisa de alanina e mutagénese de substituição dot blot.

Resultados

O objetivo deste experimento foi identificar um epitopo através Dot blot usando mAb. Para limitar rapidamente e eficientemente para baixo da região antigénica reconhecido por mAb, a todo o comprimento e proteínas de revestimento recombinante YGNNV truncados em série com uma marcação de fusão 6xHis no terminal C foram expressos a partir de um sistema de expressão de E. coli de PET ¹⁰ (Figura 1A). As proteínas recombinantes resultantes fora...

Discussão

Este protocolo oferece uma técnica rápida e simples para identificar um epitopo linear reconhecido-mAb. Tomando em consideração o custo da síntese de péptidos e da eficiência da produção de péptidos que sintetizam, da região antigénica da proteína de revestimento de vírus foi reduzido por expressão de proteínas recombinantes em série truncados antes da análise de varrimento de péptidos. Como tal, o sistema de expressão pET de E. coli fiável e eficiente foi usado para produzir estas proteínas recombinantes em sé...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio Hybrid-SFM	Gibco	12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	21600-069
Pfu DNA Polymerase	Thermo Scientific	EP0502	Incluindo buffers
T4 DNA Ligase	Roche	10799009001	Incluindo tampões
NdeI	New England Biolabs	R0111S	Incluindo tampões
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Incluindo tampões
pET-20b (+) vetor	Novagen, Merck Millipore	69739
E. coli DH-5α célula competente	RBC Bioscience	RH617
E. coli BL-21(DE3) célula competente	RBC Bioscience	RH217
Ampicilina	Amresco	0339-25G
LB caldo	Invitrongen	12780-052
Isopropiltio-β-D-tiogalactosídeo (IPTG)	MDBio, Inc.	101-367-93-1
Metanol	Merck Millipore	106009
Polioxietileno 20 Monolaurato de Sorbitano (Tween-20)	J.T.Baker	X251-07
Dimetil sulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650
Glicina	Amresco	0167-5KG
Tris	Affymetrix, USB	75825
NaCl	Amresco	0241-1KG
EDTA	Amresco	0105-1KG
Glicerol	Amresco	0854-1L
NaN3	Sigma	S2002-500G
BCIP/NBT	PerkinElmer	NEL937001PK
cabra Anti-rato IgG, anticorpo Jackson	ImmunoResearch	115-055-008
Immobilon-P (fluoreto de polivinilideno, PVDF)	Merck Millipore	IPVH00010
Proteína G Agarose Fast Flow	Merck Millipore	16-266
QIAquick PCR Kit de purificação	Qiagen	28106
UVP BioSpectrum 600 Sistema de imagem	UVP	n/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8	UVP	n/a
Termociclador MyCycler	BioRad	1709713

do fragmento do Fc