Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

Resumo

Aqui, os autores apresentam um protocolo simples e eficiente para definir um epítopo antigênico linear usando um anticorpo monoclonal purificado e varredura peptídica por meio de hibridização dot-blot. O epítopo identificado pode então ser usado em aplicações terapêuticas e diagnósticas.

Resumo

A identificação de um epítopo antigénico pelo sistema imunológico permite a compreensão do mecanismo de protecção de anticorpos que podem facilitar o desenvolvimento de vacinas e de drogas peptídicas neutralizantes. Péptido de varrimento é um método simples e eficiente, que diretamente mapeia o epitopo linear reconhecido por um anticorpo monoclonal (mAb). Aqui, os autores apresentam uma metodologia de determinação epitopo envolvendo proteínas em série truncadas recombinantes, design peptídeo sintético, e hibridação dot-blot para o reconhecimento antigênico da proteína de revestimento do vírus da necrose nervoso usando um mAb neutralizante. Esta técnica baseia-se na hibridação dot-blot de péptidos sintéticos e os mAbs em um (PVDF) de membrana de fluoreto de polivinilideno. A região mínima antigénico de uma proteína de revestimento virai reconhecido pelo mAb M56-RG pode ser reduzida por passo-a-passo aparado mapeamento do péptido para um epitopo peptidico 6-mer. Além disso, a mutagénese de varrimento de alanina e o resíduo subtuição pode ser realizado para caracterizar a importância de ligação de cada resíduo de aminoácidos que constituem o epítopo. Os resíduos que flanqueiam o local de epitopo foram encontrados para jogar um papel crítico na regulação da conformação peptídica. O péptido epitopo identificado podem ser usadas para formar cristais de complexos de péptido-anticorpo epitopo para um estudo de difracção de raios-X e a competição funcional, ou para terapêutica.

Introdução

No sistema imunitário, a recombinação de segmentos V, D, J e permite a anticorpos para criar grandes variações de regiões determinantes de complementaridade (CDR) para se ligar a vários antigénios para proteger o hospedeiro contra a infecção patogénica. A defesa de neutralização de anticorpos contra antigénios depende da complementaridade espacial entre as CDR dos anticorpos e os epítopos de antigénios. Portanto, o conhecimento desta interacção irá ajudar molecular concepção de uma vacina profilática e desenvolvimento de fármacos péptido terapêutico. No entanto, esta interacção de neutralização pode ser influenciada tanto por vários domínio....

Protocolo

1. Preparação de Anticorpos Monoclonais

1. Cultura dos monoclonais de rato células de hibridoma RG-M56 ² em meio livre de soro em frascos de 175T a 37 ºC com 5% de suplemento de CO _2. Recolhe-se o sobrenadante quando a cor do meio torna-se amarelo após cinco dias de incubação.
   NOTA: As células de hibridoma foram cultivadas em meio isento de soro a fim de evitar a contaminação de anticorpos a partir de soro fetal de bovino.
2. Centrifuga-se o sobrenadante a 4500 xg durante 30 min a 4 ºC e descartar o sedimento de restos de células.
3. Adicionar 2 ml de agarose a proteína G (fornecido como uma pasta a 50%)....

Resultados

O objetivo deste experimento foi identificar um epitopo através Dot blot usando mAb. Para limitar rapidamente e eficientemente para baixo da região antigénica reconhecido por mAb, a todo o comprimento e proteínas de revestimento recombinante YGNNV truncados em série com uma marcação de fusão 6xHis no terminal C foram expressos a partir de um sistema de expressão de E. coli de PET ¹⁰ (Figura 1A). As proteínas recombinantes resultantes fora.......

Discussão

Este protocolo oferece uma técnica rápida e simples para identificar um epitopo linear reconhecido-mAb. Tomando em consideração o custo da síntese de péptidos e da eficiência da produção de péptidos que sintetizam, da região antigénica da proteína de revestimento de vírus foi reduzido por expressão de proteínas recombinantes em série truncados antes da análise de varrimento de péptidos. Como tal, o sistema de expressão pET de E. coli fiável e eficiente foi usado para produzir estas proteínas recombinantes em sé.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio Hybrid-SFM	Gibco	12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	21600-069
Pfu DNA Polymerase	Thermo Scientific	EP0502	Incluindo buffers
T4 DNA Ligase	Roche	10799009001	Incluindo tampões
NdeI	New England Biolabs	R0111S	Incluindo tampões
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Incluindo tampões
pET-20b (+) vetor	Novagen, Merck Millipore	69739
E. coli DH-5α célula competente	RBC Bioscience	RH617
E. coli BL-21(DE3) célula competente	RBC Bioscience	RH217
Ampicilina	Amresco	0339-25G
LB caldo	Invitrongen	12780-052
Isopropiltio-β-D-tiogalactosídeo (IPTG)	MDBio, Inc.	101-367-93-1
Metanol	Merck Millipore	106009
Polioxietileno 20 Monolaurato de Sorbitano (Tween-20)	J.T.Baker	X251-07
Dimetil sulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650
Glicina	Amresco	0167-5KG
Tris	Affymetrix, USB	75825
NaCl	Amresco	0241-1KG
EDTA	Amresco	0105-1KG
Glicerol	Amresco	0854-1L
NaN3	Sigma	S2002-500G
BCIP/NBT	PerkinElmer	NEL937001PK
cabra Anti-rato IgG, anticorpo Jackson	ImmunoResearch	115-055-008
Immobilon-P (fluoreto de polivinilideno, PVDF)	Merck Millipore	IPVH00010
Proteína G Agarose Fast Flow	Merck Millipore	16-266
QIAquick PCR Kit de purificação	Qiagen	28106
UVP BioSpectrum 600 Sistema de imagem	UVP	n/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8	UVP	n/a
Termociclador MyCycler	BioRad	1709713

do fragmento do Fc