Artigo de método

Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

DOI:

10.3791/55445

⸱

3 de abril de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, 2Microscopy and Cytometry Facility, The Huck Institutes of Life Sciences, Pennsylvania State University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo permite que um pesquisador isolar e caracterizar residente em tecido marca de macrófagos em vários tecidos inflamados, extraídos de modelos induzida por dieta de distúrbios metabólicos.

Resumo

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A obesidade promove um estado inflamatório crônico que em grande parte é mediado por macrófagos de tecido-residente, bem como macrófagos derivados de monócitos. Obesidade induzida por dieta (DIO) é um modelo valioso em estudar o papel da heterogeneidade de macrófagos; no entanto, os isolamentos adequados macrófago são difíceis de adquirir de tecidos inflamados. Neste protocolo, descrevem as etapas de isolamento e necessárias diretrizes de solução de problemas derivadas de nossos estudos para a obtenção de uma população adequada de tecido-residente de macrófagos de ratos após 18 semanas de alto teor de gordura (HFD) ou gordura/alta-colesterol ( Intervenção de dieta HFHCD). Este protocolo incide sobre três tecidos de hallmark estudados na obesidade e aterosclerose, incluindo o fígado, os tecidos de adiposo brancos (WAT) e a aorta. Destacamos o uso como dualista de fluxo cytometry pode alcançar uma nova dimensão de isolamento e caracterização de macrófagos de tecido-residente. Uma seção fundamental do presente protocolo aborda a complexidade subjacente digestões enzimáticas de tecido-específica e isolamento do macrófago e subsequente da pilha-superfície anticorpo mancha para análise de fluxo cytometric. Este protocolo aborda existentes complexidades subjacentes fluorescente-ativado da pilha (FACS) de classificação e apresenta esclarecimentos para essas complexidades a fim de obter a caracterização de ampla gama de populações de células adequadamente classificada. Métodos alternativos de enriquecimento estão incluídos para classificação de células, tais como o fígado densa, permitindo a gestão de tempo e flexibilidade quando se trabalha com FACS. Em breve, este protocolo auxilia o pesquisador para avaliar a heterogeneidade de macrófagos de uma infinidade de tecidos inflamados em um determinado estudo e fornece dicas de solução de problemas perspicazes que foram bem sucedidas para caracterização e isolamento celular favorável de células do sistema imunológico em inflamação mediada por DIO.

Introdução

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Modelos de mouse têm sido extensivamente usados para estudar a dinâmica de doenças humanas. Isolamento adequado, residente de células de tecidos de ratos em um estado doente pode fornecer uma plataforma para a compreensão das contribuições moleculares e celulares para a patogênese de uma doença1. Uma doença que é de importância crucial é a obesidade. A incidência de obesidade continua a aumentar em todo o mundo em paralelo com a resistência à insulina e o tipo 2 diabetes mellitus, doença cardiovascular e esteatose hepática2,3. Consumo excessivo de nutrientes é ainda mais distorcido pela diminuição da atividade física, desencadeando alterados sinais provenientes do tecido adiposo, o que pode alterar o meio celular de outros tecidos periféricos como a aorta e fígado4. Tal rompimento da homeostase metabólica resulta em uma crônica de baixo grau de inflamação sistêmica5.

Clássica ativação de macrófagos residentes para a aorta e fígado, bem como o recrutamento para o tecido adiposo branco (WAT) tem demonstrada não só iniciar dysregulation do metabólicos sinais mas também sustentar inflamação6,7. A heterogeneidade fenotípica e funcional de macrófagos é fortemente associada com a patogênese da obesidade relacionada co-morbidades7. A plasticidade dinâmica na polarização do macrófago permite que estas células que exibem uma variedade de fenótipos registrados que coordenam a progressão e a resolução da inflamação8. Enquanto classicamente ativados macrófagos (M1) estão implicados na propagação da inflamação, alternativamente ativados macrófagos (M2) foram associados com resolução e tecido reparação9,10.

Como o corpo sofre estresse metabólico, o tecido adiposo branco anormalmente acumula. O tecido adiposo expandido atrai e retém células inflamatórias que alterar profundamente a função normal dos adipócitos para promover a resistência à insulina, hiperglicemia e, finalmente, diabetes mellitus tipo 2, resistência à insulina ou hiperglicemia11, 12. Em paralelo, tecido adiposo branco remodela em resposta a sinais inflamatórios lançado pela infiltrou-se classicamente registrados (M1) tecido adiposo macrófagos (ATMs)13,14. Este órgão multicelular exerce uma cascata de sinais que desvia a função normal de outros órgãos do corpo tais como a aorta e hepática4.

O fígado é uma potência metabólica que adapta-se em resposta aos estímulos provenientes da vizinha desregulação WAT15. Hepáticos macrófagos ou células de Kupffer, em resposta a alterações metabólicas, secretam citocinas inflamatórias que transformam ambos parenquimatosa e fenótipo de células não-parenquimatosas e promovem a remodelação do tecido. Acúmulo de lipídios hepático, inflamação, depósitos excessivos de matriz extracelular, necrose e função eventual perda segue os insultos inflamatórios, contribuindo para o amplo espectro de danos no fígado associados com doença hepática gordurosa não-alcoólica 16,17,18.

Em paralelo a WAT comprometido e função hepática, grandes artérias acumulam lipídios dentro da parede arterial como o corpo sofre de estresse metabólico crônico19. Acúmulo de lipídios arterial desencadeia a secreção de quimiocinas pelas células endoteliais ativadas e subsequente recrutamento de monócitos20. Uma vez recrutados, monócitos proliferam, diferenciam, ingerem lipoproteínas e tornar-se células de espuma. Atherogenesis é iniciada e sustentada pela atividade pró-inflamatória dos recrutados e macrófagos residentes tecido de lipídios-carregados. Sucumbir a sinais de estresse extracelular e intracelular, retransmitidos neste microambiente aterogênico, esses macrófagos então se envolver em uma cascata de sinalização de apoptotic. Como essas células espuma morrem, eles contribuem seu conteúdo lipídico preenchido para o núcleo necrótico da lesão, que então leva a ruptura da placa, infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral.

Coletivamente, a heterogeneidade dos fenótipos de macrófagos em parte organiza a obesidade induzida por alterações inflamatórias observadas nos tecidos de desregulação como WAT, fígado e aorta8,21. Caracterização de recrutados e macrófagos residentes tecido poderiam fornecer insights sobre potenciais alvos moleculares que manipulam o macrófago fenótipo1. Para efetivamente caracterizar os macrófagos dos tecidos inflamados induzida pela obesidade, uma suspensão de célula única pode ser obtida através de digestão enzimática. Esses protocolos de dissociação devem ser eficazes em suficientemente degradante do tecido conjuntivo, minimizando a morte celular imune e oferece um rendimento de célula ideal. A mistura de enzima é dependente do tipo de tecido e seu tornar-se estrutural. Tecidos resistentes, tais como a aorta requer mais forte atividade enzimática, em comparação com o fígado e o WAT, para alcançar a dissociação de tecido. Da suspensão de célula única, macrófagos residentes de tecido podem ser inequivocamente caracterizados ou isolados para ainda mais a jusante análises tais como criação de perfil transcricional.

Aqui um protocolo específico de tecido é descrito que usa tecido dependente de colagenase digestão e citometria de fluxo policromático efetivamente isolar e caracterizar macrófagos residentes tecido obtidos de obesidade dieta tradicional induzida, aterosclerose, simples esteatose e esteatohepatite mouse modelos. Simultânea de coloração de marcadores de superfície celular com anticorpos contra leucócitos-(CD45 e/ou CD11b) e macrófago - antígenos específicos (F4/80) é frequentemente usado para identificar as populações de macrófagos22. Fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação é uma poderosa estratégia usada para classificar essas populações identificadas em elevado grau de pureza. População classificada, então, pode ser avaliada para perfis de fenótipo gene específico usando a jusante análise molecular (tais como a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa)23. Apesar de citometria de fluxo padrão e classificação de celulares baseados em citometria de fluxo são ferramentas poderosas na distinção entre macrófagos dentro de uma suspensão de células vastamente heterogêneos, os antigos protocolos devem ser otimizados para garantir uma saída bem sucedida. Neste estudo, são descritos os protocolos que efetivamente isolar e caracterizam os macrófagos específicos do tecido viável; mais importante, este estudo fornece insight crucial sobre questões técnicas que muitas vezes surgem, bem como estratégias proativas e resolução de problemas para prevenir e/ou resolvê-los.

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Protocolo

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Todos os protocolos experimentais (seções 1, 1.2 e 1.3) foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) na Universidade Estadual da Pensilvânia.

TecidoPreparação de Buffers de dissociaçãoVolume finalArmazenamento
Tecido adiposo branco (WAT) Buffer de dissociação: 2,5% HEPES, albumina de soro bovino (BSA) de 10 mg/mL, 3 mg/mL (0,3%) Colagenase tipo II em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) com glicose de 4,5 g/L, sem piruvato de sódio e e L-glutamina500 mLmenos 80° C (alíquotas de 10 mL)
Fígado 25 x concentrado de tampão de perfusão (PBC): 3,55 M NaCl, 168 mM KCl, 240 mM HEPES, 150mm de NaOH em água destilada deionizada H2O500 mLmenos 20° C (alíquotas de 40 mL)
Buffer de preservação (PRB): BSA de 1% em tampão de perfusão 1x1 L4 ° C
Buffer de dissociação: 1 x perfusão Buffer suplementado com 4,76 mM CaCl2 e 72 U/mL colagenase tipo IV50 mL (por rato)Prepare-se imediatamente antes da utilização
Aorta Buffer de dissociação: 125 U/mL colagenase tipo XI, 60 U/mL hialuronidase tipo I, 60 U/mL DNase eu, 450 U/mL colagenase tipo I, 20 mM HEPES 1 x salino de tampão fosfato (PBS)500 mLmenos 80° C (alíquotas de 10 mL)

Tabela 1: Receitas do amortecedor tecido específico de perfusão.

1. dissociação e isolamento de tecido

  1. Dissociação e isolamento de WAT
    1. Preparar os buffers de tecido-específica, conforme tabela 1e armazená-los conforme descrito.
    2. Preparem-se os seguintes reagentes.
      1. Prepare o tampão de digestão por descongelar o volume apropriado de buffer de dissociação de WAT e loja a 4 ° C até o uso. Imediatamente antes do uso, aquecer o buffer para 37 ° C. Prepare o buffer de FACS, preparando 1x tampão fosfato salino (PBS) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS).
    3. Isolamento de WAT
      1. Eutanásia em uma câmara de rato em um dióxido de carbono (CO2) preenchido. Verifique se há eficácia antes de continuar para a fase de dissecação.
      2. Mergulhe o mouse euthanized brevemente em um béquer contendo 70% de etanol até completamente encharcado e revestidos com etanol. Coloque a superfície ventral do mouse acima na fase de dissecação e aperte o mouse antes e as patas traseiras para o tabuleiro de dissecação usando agulhas G 21.
      3. Use pinça de ponta de ponto médio para agarrar a pele abdominal anterior a abertura uretral e, em seguida, usar tesoura afiada de dissecação para fazer um corte na pele abdominal compreendida.
      4. Insira a lâmina inferior da tesoura a pequena incisão entre a pele e o peritônio e fazer uma incisão lateral do abdome para o tórax.
      5. Suavemente, puxe a pele para expor a cavidade peritoneal intacta e fazer uma incisão lateral através do peritônio e também dobre a membrana transparente ou excisar o tecido para expor o WAT abdominal.
      6. Recolher as almofadas de gordura perigonadal, conforme descrito em Mann et al . 24
        1. As almofadas de gordura perigonadal em camundongos machos são vagamente vinculadas para o epidídimo e testículos. Primeiro Localize os testículos com meio ponto de fórceps, agarrar a preensão da cabeça do epidídimo e puxe suavemente.
        2. Usando a tesoura afiada de dissecação, impostos especiais de consumo cada almofada gorda epidídimo por corte ao longo da superfície do epidídimo (cabeça, corpo e cauda) e os testículos.
        3. Com a pinça, puxe com cuidado a almofada de gordura enquanto corte através do tecido conjuntivo, diretamente ligado à estrutura do epidídimo.
        4. Usando a pinça, segure firmemente o fim da gordura almofada proximal para o epidídimo e descasque delicadamente a almofada de gordura longe as gônadas
        5. Em ratos fêmeas, as almofadas de gordura de perigonadal são vagamente bond para o corpo do útero e o corno uterino.
        6. Usando a pinça de ponto médio, aderência do tecido adiposo perigonadal e puxe delicadamente o tecido longe do corpo do útero e trompa uterina.
        7. Impostos especiais de consumo cada almofada gorda por corte ao longo do corpo do útero e o corno uterino usando tesoura afiada de dissecação.
      7. Coloque a gordura almofadas em um prato de petri preenchida com PBS e mantém no gelo para manter o tecido úmido.
    4. Dissociação de WAT em suspensões celulares simples
      1. Remova a placa de Petri PBS em excesso e usar uma lâmina única borda para picar o WAT abdominal em pedaços pequenos.
      2. Com a ponta afiada da lâmina da navalha, lixe ligeiramente o picada WAT abdominal em um tubo de polipropileno coleção rotulado de 15 mL contendo 2 mL de tampão de dissociação WAT.
      3. Incube a esta mistura de tampão de digestão do tecido sob rotação contínua lenta a 37 ° C por 45 min.
      4. Filtrar o tecido digerido através de um filtro de célula de 70 µm num tubo de colheita 50ml enquanto move o êmbolo de borracha de um êmbolo da seringa em um movimento circular e continuar a peneira a suspensão de células através do filtro.
      5. Pipetar 2 mL de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) para um tubo de coleta de 15 mL, pipeta suavemente acima e para baixo e lavar o filtro com a suspensão de célula única.
      6. Lavar o filtro duas vezes adicionais com DMEM frio e coloque a suspensão única célula no gelo.
      7. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 x g a 4 ° C, durante 8 min.
      8. Use um aspirador a vácuo para retirar cuidadosamente adipócitos flutuantes (primeiro) e restante sobrenadante. Certifique-se para não perturbar a fração vascular do estroma peletizada (SVF).
      9. Com uma pipeta de 1.000 µ l, delicadamente Ressuspender o pellet em tampão de cloreto de amônio-potássio (ACK) para lisar eritrócitos de acordo com as instruções do fabricante.
      10. Diluir a suspensão de células acima com DMEM e centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 g a 4 ° C, durante 8 min.
      11. Ressuspender as células em frio PBS contendo 2% FBS (FACS Buffer) e contar as células em uma câmara Burker/hemocytometer.
      12. Transferi 1 x 106 células (por citometria de fluxo básico) ou a suspensão de toda a célula (por FACS) para rotulado 5ml tubos de poliestireno de fundo redondo. Continue a seção 2 para citometria de fluxo que mancha o protocolo.
  2. Dissociação e isolamento do tecido do fígado
    Nota: Este protocolo foi adaptado de Smedsrød25.
    1. Preparar os buffers de tecido-específica, conforme tabela 1 e armazená-los conforme descrito.
    2. Preparem-se os seguintes reagentes.
      1. Prepare 1 x perfusão Buffer (PB), por diluição 40ml de PBC em 960 mL ultrapura H2O. pré-aquecer uma seringa preenchida com 50 mL de PB a 37 ° C, antes de começa a perfusão. Elimine quaisquer bolhas de ar presentes.
        1. Para eliminar as bolhas de ar, inverta a seringa onde a dica de bloqueio de leur está apontando para cima. Bata ou agite a seringa até que as bolhas de ar para a pf superior a seringa. Empurre suavemente o êmbolo para expulsar o ar
      2. Preparar o tampão de digestão diluindo-se 0,5 mL de 476 mM CaCl2 soluçãoa 49,5 mL 1 x buffer de perfusão. Adicione 3600U de colagenase tipo IV a 4,76 mM CaCl2 – solução de PB. Pré-aqueça uma seringa preenchida com 50 mL de tampão de digestão a 37 ° C antes de começa a perfusão. Elimine quaisquer bolhas de ar presentes conforme descrito na etapa 1.2.2.1.1.
      3. Prepare a preservação Buffer (PRB) dissolvendo-se 2,5 g albumina de soro bovino (BSA) em 250 mL de tampão de perfusão 1x. Armazenar a 4 ° C ou manter no gelo até o uso.
      4. Prepare o Buffer de FACS com 1X PBS e 2% FBS.
    3. Isolamento do tecido do fígado
      1. Eutanásia em um rato por asfixia de CO2 , saturar o rato com etanol a 70% para evitar a contaminação dos órgãos intra-abdominais com peles.
      2. Posição da rato ventral para cima em um poliestireno dissecando a placa de espuma e segura o mouse dianteira e traseiro as patas para o tabuleiro de dissecação usando agulhas G 21.
      3. Para expor a parede torácica e a cavidade peritoneal, agarre a pele abdominal perto da abertura uretral, usando uma pinça de ponta de ponto médio. Em seguida, use uma tesoura afiada de dissecação para criar uma pequena incisão na pele abdominal compreendidos.
      4. Insira a lâmina inferior da tesoura a pequena incisão entre a pele e o peritônio e fazer uma incisão lateral da virilha no queixo.
      5. Suavemente, puxe a pele para expor a cavidade peritoneal intacta e a parede torácica, faça uma incisão lateral através do peritônio e excisar a membrana.
      6. Levantar o esterno e cuidadosamente entalhar o diafragma, certifique-se para não perturbar a veia cava inferior (VCI). Mover os órgãos gastrointestinais para o lado e localizar a veia cava inferior subhepatic. Use a pinça hemostática para fixar o suprahepatic veia cava inferior para manter a perfusão localizada.
        Nota: A acumulação excessiva de visceral tecido adiposo branco, muitas vezes pode mascarar a veia cava inferior. Para visualizar melhor este navio, uma pequena área de tecido adiposo junto a veia cava inferior pode ser extirpada. A incisão no janela dentro do tecido adiposo maleável então pode ser posicionada sobre a veia cava inferior para expor o recipiente para a canulação.
      7. Anexe a seringa cheia de PB previamente aquecido para o conjunto de coleta e infusão de sangue 23G. Empurre suavemente o êmbolo até que o tubo e agulha estão cheias de PB.
      8. Insira a agulha 23G, paralela da subhepatic veia cava inferior. Fixe a agulha no lugar usando uma pinça hemostática de 4 cm.
        Nota: Canulação do subhepatic que IVC é preferido em ratos alimentados com dieta em que a veia cava inferior pode ser melhor visualizado e canulados dentro da cavidade cheia de gordura.
      9. Empurre suavemente o êmbolo para iniciar a perfusão, a cor irá liberar rapidamente do fígado (o lóbulo direito primeiro) se a agulha está devidamente posicionada no vaso. Alargamento dos lóbulos é também visível, se a agulha está correctamente inserida a veia cava inferior subhepatic.
      10. Prontamente, corte a veia porta para permitir que o PB flua livremente através do fígado.
      11. Perfundir o fígado até o sangue não é mais visível. De vez em quando delicadamente massagem lóbulos fígados entre tona-dedo indicador e o polegar para facilitar a perfusão.
        Nota: É importante usar sem serra sem corte ferramentas afiadas para lidar com o fígado para evitar danos aos tecidos.
      12. Quando 5 mL de PB permanece dentro da seringa, mude para a seringa cheia de buffer de dissociação previamente aquecido. Não perturbe a posição da agulha protegida durante este tempo.
        Nota: Ampliado significativamente superior a 1,5 g deve ser pintada com um maior volume de tampão de digestão pré-aquecido a garantia de dissociação de fígado bem sucedida de fígados.
      13. Perfundir o fígado até totalmente digerida. Massageie suavemente o fígado lóbulos para facilitar a perfusão.
        Nota: A separação da cápsula de Glisson do parênquima é observável em um fígado com êxito digerido. Para avaliar isso, use a borda romba de um par de pinças, para pressione suavemente o lóbulo lateral esquerdo. Uma impressão deve aparecer na superfície e o recuo deveria encher lentamente, uma vez que a pinça é removida.
      14. Remova a agulha da veia cava inferior subhepatic. Não retire a pinça hemostática aperto o suprahepatic veia cava inferior.
      15. Excisar o fígado inteiro cortando cuidadosamente através da conexão ligamentos usando uma lâmina reta curta, dissecando a tesoura e remover a vesícula biliar.
      16. Coloque o fígado inteiro em um 10-cm-placa de Petri contendo 10 mL Buffer de preservação gelada e loja em 4 оC até prontos para libertar as células.
    4. Dissociação de células hepáticas
      1. Transferir o fígado de um prato de 10 cm, contendo 10 mL DMEM gelada.
      2. Segure o suprahepatic decepada que IVC anexado ao fígado extirpado usando uma pinça dentada. Use pinça de ponto médio para liberar as células da cápsula de Glisson aplicando movimento acariciando rápido para cada lóbulo.
      3. Passe o DMEM saturado através de um filtro de célula 70 µm ligado a um tubo de coleta de 50 mL.
      4. Pipetar 10 mL gelada DMEM para o prato de petri de 10 cm e repita os passos de 1.2.4.1 para 1.2.4.3 até saturação da mídia já não é observada. Coloque a suspensão de células no gelo ou a 4 ° C.
      5. Misture suavemente a suspensão de eritrócitos por inversão do tubo de coleta e centrifugar a 54 x g por 2 min a 4 ° C.
      6. Recolha o sobrenadante em um tubo de coleta de 50ml limpo. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 54 x g por 2 min a 4 ° C.
      7. Repita a etapa 1.2.4.6 duas vezes adicionais antes de prosseguir para a etapa 1.2.4.8.
      8. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo 50 mL-coleção e centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
      9. Ressuspender o pellet de células não-parenquimatosas no buffer de FACS e contá-las em uma câmara Burker/hemocytometer.
      10. Transferi 1 x 106 células (por citometria de fluxo básico) ou 15 x 106 - 20 x 106 células (FACS) para rotulado tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL. Continue a seção 2 para citometria de fluxo que mancha o protocolo.
  3. Dissociação e isolamento da aorta
    Nota: Este protocolo foi adaptado do açougueiroet al.26
    1. Preparar os buffers de tecido-específica com base em receitas fornecidas na tabela 1 e armazená-los conforme descrito.
    2. Preparem-se os seguintes reagentes.
      1. Prepare o tampão de digestão por descongelar o volume apropriado de buffer de dissociação de WAT e loja a 4 ° C até o uso. Imediatamente antes do uso, aquecer o buffer para 37 ° C.
      2. Prepare uma solução de heparina 10 x dissolvendo heparina sal sódico em 1X PBS em uma concentração de 200 U/mL. Dilua a solução de heparina com PBS 1x para preparar uma solução de heparina de 1x de 10x. Armazene o x 10 e 1 x soluções de heparina em 4 ° C até o uso.
      3. Preparar o Buffer de FACS com 1X PBS contendo 2% FBS.
    3. Dissecação da aorta
      1. Eutanásia em um rato em uma câmara de dióxido de carbono preenchido e lavagem com etanol 70%.
      2. Coloque o lado ventral do mouse na fase de dissecação, espalhar o mouse antes e as patas traseiras e fixá-las à Diretoria de dissecação, usando agulhas de 21 G.
      3. Imediatamente após a eutanásia o rato, realize punção cardíaca. Consulte os passos 1.3.3.4 para 1.3.3.9, se necessário.
      4. Localize o processo xifoide, na extremidade inferior do esterno
      5. Para fazer isso, coloque um ponto médio do dedo ao longo da largura do pescoço do animal. Rastrear ao longo da linha média ventral do pescoço à extremidade caudal do esterno até sente uma extensão cartilaginoso.
      6. Use pinça de ponto médio para compreender a extensão cartilaginosa e se necessário marcar a localização do processo xifoide, removendo o pedaço de cabelo ou a pele na área.
      7. Parcialmente inserir uma agulha 26G sob o processo xifoide em 20-30° ângulo.
      8. Gentilmente aplique pressão negativa na seringa, retirando lentamente o êmbolo e, em seguida, introduza a agulha ainda mais dentro da cavidade até fluxos de sangue.
      9. Se o fluxo de sangue parar, lentamente girar a agulha ou mova ligeiramente em e para fora.
      10. Uso o par de pinças para agarrar as mãos a pele abdominal anterior uretral abrindo e usar um par de tesouras de dissecação afiadas para cortar ao longo da linha média ventral através do peritônio da virilha no queixo.
      11. Puxe a pele para expor os órgãos abdominais e torácica, com os dedos ou pinça romba movimente suavemente órgãos abdominais para o lado.
      12. Uso a pinça para agarrar as mãos do processo xifoide, levante o esterno e entalha o diafragma.
      13. Usando a tesoura dissecar, cortar as costelas laterais em ambos os lados. Segurando o esterno, inverter as costelas para cima e corte através da base de ligação. Remova a caixa torácica expondo os órgãos torácicos subjacentes.
      14. Perfundir a aorta com uma agulha de calibre 26 anexada um 10 mL seringa preenchida com 1 x solução de heparina pela injeção de 1 a 2 mL de solução para o ventrículo esquerdo (LV) do coração.
        Nota: Certifique-se de perfundir em ritmo lento, com pouca pressão para assegurar lesões da aorta ateroscleróticas intactas.
      15. Impostos especiais de consumo a timo, pulmões e tecido conjuntivo. Consulte os passos de 1.3.3.16 e 1.3.3.17, se necessário.
        1. Anterior do coração, localize o branco bi-lobada (ou em forma de borboleta) órgão e firmemente agarrar espera do Timo com a pinça. Afastar-se ambos os lóbulos para cima da cavidade e corte na base com a tesoura.
        2. Para remover os pulmões, beliscar um lóbulo do pulmão com a pinça, puxe o tecido fora da cavidade torácica e corte na base. Repita para cada lóbulo restante.
      16. Use um microscópio de dissecação e microdissecando ferramentas e coletar que arco da aorta (incluindo a innominate artéria, artéria carótida comum esquerda e artéria subclávia esquerda), o ascendente, descendente, aorta torácica e abdominal.
        1. Localize a aorta ascendente no ventrículo esquerdo do coração.
        2. Com um par de curvas 0,07 x 0,04 mm-ponta pinça Segure cuidadosamente a parte da aorta ascendente emergindo do ventrículo esquerdo.
          Nota: Em comparação com o tecido adiposo circundante-amarelado, a aorta será um navio branco brilhante, proveniente do LV quando suficientemente liberado com a solução de heparina.
          1. Se a aorta não foi devidamente liberada pela perfusão cardíaca, lave a aorta novamente enquanto a aorta permanece conectada à cavidade. Para fazer isso, cortar perto da junção do coração-aorta, retirar o coração e depois cortar horizontalmente através da baixo-extremidade da aorta abdominal. Inserir uma agulha 26G na abertura da aorta ascendente e lave delicadamente a aorta com o 1 x solução de heparina.
          2. Suavemente puxe-a para melhor discriminar entre o tecido adiposo e incorporado a aorta, a aorta ascendente.
          3. Ainda puxando na aorta ascendente, use a ponta da mola fechada dissecando tesoura para limpar a gordura que encapsulam a aorta ascendente e arco aórtico. Para fazer isso, curso do tecido adiposo com a ponta das lâminas da tesoura fechada a rasgar a conexão gordura.
            Nota: Abster-se de excisão qualquer tecido adiposo cortando até a aorta ascendente e o arco podem ser visualizados claramente. Isso é para evitar cortar a aorta.
          4. Se a aorta ascendente e o arco podem ser claramente delineados a partir do tecido adiposo de bordadura, use o Primavera dissecando tesoura para retirar o excesso de gordura.
          5. Delicadamente agarra o arco aórtico com a pinça. Novamente usando a ponta da tesoura primavera, braçada a gordura ao longo do comprimento da aorta descendente, torácica e abdominal à extremidade caudal da aorta abdominal, assim, no lado direito da capa de gordura.
          6. Continue a agarrar-se ao longo da aorta quando rasgar a gordura. Certifique-se de fazer tão cuidadosamente para evitar danificar a aorta.
          7. Puxe delicadamente a aorta para cima em direção ao microscópio, para que a gordura está agora posicionada atrás da aorta.
          8. Inserir as lâminas da tesoura fechada entre a interface de gordura-aorta perto da extremidade anterior da aorta descendente, grave fixação do tecido adiposo superfície da aorta, sem rodeios, usando um movimento de varredura.
            Nota: Cuidadosamente removendo o excesso de gordura e tecido de ligação, enquanto a aorta está ainda dentro da cavidade é recomendado.
          9. Excisar o coração e cortar transversalmente na extremidade caudal da aorta abdominal. Remova a aorta toda.
          10. Coloque a aorta em um prato de 35mm e tease fora qualquer excesso de gordura na aorta usando duas agulhas de calibre 21. Coloque a aorta extirpada em tubo de microcentrifuga 1,7 mL no gelo.
    4. Dissociação da Aorta em suspensões celulares simples
      1. Pipetar 0,2 mL aorta dissociação de tampão para o tubo contendo a aorta. Inserir as lâminas de tesoura de mola no final do tubo cônico e picar rapidamente a aorta para facilitar a digestão enzimática.
      2. Transfira a mistura de tecido-solução para um 15 mL coleção tubo e pipeta 1,8 mL aorta dissociação buffer para um volume total de 2 mL.
        Nota: Para fácil transferência de suspensão de tecido, corte a 1 cm fora da extremidade afilada de uma padrão ponta da pipeta 1.000 µ l. Use a ponta encurtada para transferir a suspensão com uma micropipeta.
      3. Incube a aorta picada no buffer de dissociação de aorta para 55 min a 37 ° C, agitando a 220 rpm (0.514 x g).
      4. Passe a suspensão através de filtro de 50 µm célula em um tubo de polipropileno coleção de 15 mL. Use o êmbolo de borracha de um êmbolo da seringa para facilitar a filtragem.
      5. Lavar o tubo de coleta de 15 mL com 1 mL de FACS, recolher a suspensão e passar através do filtro de célula.
      6. Lave o filtro de célula 50 µm duas vezes adicionais com 1 mL de tampão de FACS.
      7. Pelotas as células por centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células no Buffer de FACS frio. Conte as células em uma câmara Burker/hemocytometer.
      8. Transferi ou células de 1 x 106 (por citometria de fluxo básico) ou a suspensão de toda a célula (por FACS) para um tubos de poliestireno de fundo redondo de 5ml rotulada. Continue a seção 2 para citometria de fluxo que mancha o protocolo.

2. fluxo Cytometry e FACS coloração

FluoróforoR-ficoeritrina (PE)PE/cianina (Cy) 7PE/cianina (Cy) 5Azul (PB)
Laser (nm)Azul (488 nm) / amarelo (561-570 nm) - verde (532 nm)Azul (488 nm) / amarelo (561-570 nm) - verde (532 nm)Azul (488 nm) / amarelo (561-570 nm) - verde (532 nm)Violeta (405 nm)
ExcitaçãoMAX (nm)496496496401
Emissão deMAX (nm)578785667455
Marcador fenotípicaF4/80CD11cCD11bCD45
EMR1, Ly71ΑX integrina, integrina αX cadeia, CR4, p150, ITGAXΑM integrina, Mac-1 Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAMT200, Ly-5, LCA
Tipo de célula alvoMacrófagos residentes de tecidoMacrófagos classicamente registrados (M1)Monócitos / macrófagosLeucócitos (macrófagos / monócitos, linfócitos e granulócitos)
Subconjunto de células dendríticasCélulas dendríticas, células NK, células T ativadas e um subconjunto de linfócitos intraepiteliais intestinais (IEL)Granulócitos, células dendríticas, células NK e subconjuntos de células T e B
Factor de diluição01:501: 1001: 1001: 100
ISOTYPE controlesPE rato IgG2aPE/Cy7 armênio Hamster IgGPE/Cy5 Rat IgG2bIgG2c rato azul do Pacífico

Tabela 2: Lista de fluoróforo etiquetado anticorpos específicos para discriminar os macrófagos residentes de tecido.

  1. Coletar e preparar os seguintes itens: tubos de poliestireno de fundo redondo FACS Buffer 5 mL, receptor de Fc CD16/32 de antibloqueio rato de anticorpo, fluoróforo conjugado ou anticorpos primários, anticorpos secundarios conjugados fluoróforo (se não-conjugados necessário), 1x tampão fosfato salino (PBS).
    Nota: Para grandes quantidades de células de coloração, concentração de anticorpos é mais crítica ao invés de número de celular. Por exemplo, se a coloração de 10 x 106 células o volume de tampão a coloração e a concentração de anticorpos deve ser o mesmo como se coloração 1.0 x 106 células no volume de reserva de 100 µ l. Para a coloração 1.0 x 108 células, aumentando a quantidade de anticorpo 5-fold é recomendado.
  2. Adicionar adicionais gelada FACS Buffer para cada tubo de FACS, se necessário, as células de pelotas por centrifugação a 751 x g por 5 min (4 ° C). Aspire a sobrenadante centrifugação seguinte.
  3. Adicione o receptor de Fc CD16/CD32 de antibloqueio rato de anticorpo para todas as amostras de acordo com as instruções do fabricante. Incube por 15 min a 4 ° C ou em gelo.
  4. Adicione o fluoróforo primário anticorpo conjugado cocktail diretamente ao receptor Fc contendo anticorpos bloqueio suspensão de células e incubar amostras a 4 ° C por 30 min. amostras de proteger da luz para minimizar o descoramento de anticorpos conjugados fluoróforo.
    1. No caso de unconjugated anticorpos primários foram utilizados, siga estas etapas após completar a etapa 2.4.
    2. Anticorpo primário de lavagem manchado amostras por centrifugação a 751 x g por 5 min (4 ° C).
    3. Remover o sobrenadante por decantação e ressuspender o pellet em buffer de FACS 100 µ l.
    4. Adicione o anticorpo secundário conjugado para todas as amostras necessárias e incube por 30 min a 4 ° C. Prossiga para a etapa 2.5.
  5. Seguir incubação do anticorpo, adicionar 2 mL de tampão de FACS frio gelo depois da pelota células a 751 x g por 5 minutos (4 ° C). Decante o sobrenadante e certifique-se para não perturbar o sedimento.
  6. Misture-os delicadamente as células e então re-suspender com 200-400 µ l de tampão de FACS, em seguida, manter isso no escuro a 4 ° C até análise de citometria de fluxo padrão ou célula de classificação.
  7. Para a fixação de curto prazo de células coradas, proceda à passos 2.8 a 2.10. Fixação de uso por citometria de fluxo padrão somente.
  8. Imediatamente após a etapa 2.5, re-suspender as células em paraformaldeído de 2-4% de 0,5 mL (PFA) por 15-30 min em 4 ° C.
    Nota: Atenção: PFA é um irritante conhecido com efeitos cancerígenos e tóxicos. Quando usando o PFA, manipular com extremo cuidado. Certifique-se de usar o equipamento de protecção adequado e ventilação de exaustão.
  9. Fixação seguinte, lavar as células adicionando FACS de 2 mL de tampão para todas as amostras e centrifugar a 751 x g em 4 ° C por 5 min. remover sobrenadante seguir centrifugação.
  10. Ressuspender as células fixas em 200 µ l de tampão de FACS frio gelo e em 4 ° C. Correção de loja células até 1 semana a 4 ° C, idealmente realizar aquisição de citometria de fluxo dentro de 48 horas para minimizar autofluorescência.
  11. Adquirir dados de citometria de fluxo de acordo com as instruções do fabricante de citômetro de fluxo ou executar fluorescente ativado celular classificação conforme descrito por Brum et al. 23

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ao usar o apolipoprotein E deficientes camundongos C57BL/6 (ApoE KO) (BL6) mantidos em uma dieta de alta gordura colesterol elevado (HCHFD ou HCD) por 18 semanas, 1 x 104 - 2 x 104 CD45++ de F4/80 macrófagos aórtico podem ser isolados quando duas amostras são em pool. Fígados dissecados de ratos alimentados com HFHCD KO ApoE, produziu maior que 5 x 105 classificados células de Kupffer (que depende do tempo de classificação disponível)...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modelos de desordem metabólica induzida por dieta que imitam co-morbidades, tais como aterosclerose, simples esteatose, esteatohepatite e diabetes tipo 2 são usados extensivamente para melhor compreender os mecanismos moleculares subjacentes de progressão da doença. Digestão dependente de colagenase é muitas vezes usado para dissociar os tecidos para libertar as células da matriz extracelular (ECM)16,27. Enzimas como a colagenase perturbam o colágeno que fornece ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer a facilidade do núcleo citometria de fluxo para a Universidade de Pensilvânia estado Millennium ciência complexa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
26 G x 5/8 in AgulhasBD305115
23 G x 0.75 in agulha x tubo de 12 in. Conjunto de Coleta de SangueBD367297Usado para canulação de VCI sub-hepática durante a perfusão hepática
21 G 1 1/2 pol. AgulhasBD305156
Seringa de 1 mL com batentes de borrachaBD309659
Seringas de 10 mLBD309604
Seringa de 1 mLBD309659
F4/80 PEBiolegend123110
CD11c PE/Cy7Biolegend117318
CD11b PE/Cy5eBioscience15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block Biolegend101320
CD45 Pacific BlueBiolegend103126
PE Rato IgG2aBiolegend400508
PE/Cy7 Hamster Armênio IgGBiolegend400922
PE/Cy5 Rato IgG2bBiolegend400610
Rato Azul Pacífico IgG2cBiolegend400717
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) Cellgro15-017-CV
1x Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Cellgro21-031-CV
70 μ filtros de células mCorning, Inc.352350
Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL DenvilleC2170
-16xMicroscopia EletrônicaSciences CAS #30525-89-4
Tesoura Micro Dissecante, 3.5 polegadas, Reta, 23 mm, Afiada Stoelting52132-10PUsado para fins gerais de dissecação
Micro Fórceps, 4 polegadas, curva completa, 0.8 mmStoelting52102-37P Usado para fins gerais de dissecação
Tesoura de dissecção de mola - 3 mm de corte Ferramenta Fine Science15000-10Usada para dissecção da aorta Passos 1.3.3.17 a 1.3.3.28
Curvado 0.07 mm x 0.04  mm Ponta FórcepsFine Science Tool11297-10Usado para dissecção da aorta Passos 1.3.3.17 a 1.3.3.28
Fórceps Hemostático (Curvo)Fine ScienceTool 13021-12
Heparina Sódica SalFischer Scientific9041-08-1
35 mm Cultura de Células/Placas de PetriFischer Scientific12-565-90
Placas de Petri de Poliestireno (10 cm) c/tampaTubos08-757-100D
Fischer Scientific14-959-53A
 ( Polipropileno)Fischer Scientific14-432-22
Tubos de Poliestireno de Fundo Redondo de 5 mL Fischer Scientific14-959-5
Soro Fetal BovinoGemini Bio-Products100-106
Etanol (Estoque de Álcool Etílico Desnaturado, Anidro)MilliporeEX0285-1
Soro Bovino AlbuminaRocklandBSA-50
HEPESSigma-AldrichH3375
Colagenase Tipo IISigma-AldrichC6885
Colagenase Tipo XISigma-AldrichC7657
Hialuronidase Tipo ISigma-AldrichH3506
DNAseSigma-AldrichDN25
Colagenase Tipo ISigma-AldrichC0130
NaOHSigma Aldrich1310-73-2 
CaCl2Sigma Aldrich449709-10G
Copo de 500 mL Sigma Aldrich02-540M
4 cm Grampo hemostáticoStoelting52120-40
Pinça dentadaStoelting52104-33P
50 μ m Filtros descartáveisSystemex04-0042-2317
Colagenase Tipo IVThermoFischer Scientific17104019
Cloreto de Amônio Potássio (ACK)ThermoFischer Scientific 
Lâminas de barbear (0,22 mm (0,009"))VWRInternational55411-050
Texas Red Mancha viva/morta Manchavermelha de viabilidade (em Figura 1A)
Solução Aquosa Paraformaldeído de Centrífuga Cônicos de 15 mL da Fischer Scientific (Polipropileno)Tubos de Centrífuga Cônicos de 50 mL da A1049201

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (12), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (12), 875-880 (2006).
  4. Jung, U., Choi, M. -S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).
  5. Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
  6. Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).
  8. Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).
  9. Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).
  10. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).
  11. Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).
  12. Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).
  13. Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).
  14. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
  15. Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).
  16. Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).
  17. Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).
  18. Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
  19. Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).
  20. Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).
  21. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  22. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).
  23. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546(2010).
  24. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174(2014).
  25. Smedsrød, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. 1, Available from: http://munin.uit.no/handle/10037/4575 1-10 (2012).
  26. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848(2011).
  27. Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, Matsushita 1994 247-252 (2014).
  28. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
  29. Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).
  30. Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  31. Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).
  32. Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).
  33. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).
  34. Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).
  35. Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
  36. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).
  37. Kim, Y. -J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).
  38. Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).
  39. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6 (3), 13(2014).
  40. Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).
  41. Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).

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