Artigo de método

Automated Análise contração do Coração Humano engenharia de tecidos para Screening Cardiac Drug Safety

DOI:

10.3791/55461

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15 de abril de 2017

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1Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, Cardiovascular Research Center, University Medical Center Hamburg-Eppendorf and DZHK (German Center for Cardiovascular Research)

Neste artigo

Resumo

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Aqui, mostramos a geração de tecido do coração humano manipulado a partir de células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSC) derivada de cardiomiócitos. Apresenta-se um método para analisar a força de contração e alteração exemplar de padrão de contracção pelo hERG inibidor do canal de E-4031. Este método apresenta elevado nível de robustez e de aptidão para o rastreio de drogas cardíaca.

Resumo

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engenharia de tecido cardíaco descreve técnicas para constituir três tecidos de engenharia geradores de força dimensional. Para a implementação destes procedimentos em pesquisa básica e desenvolvimento de medicamentos pré-clínico, é importante desenvolver protocolos para geração e análise automatizada sob condições padronizadas. Aqui, apresentam-se de uma técnica para gerar tecido do coração Engineered (EHT) de cardiomiócitos de espécies diferentes (rato, ratinho, humano). A técnica baseia-se na montagem de uma fibrina-gel contendo cardiomiócitos dissociadas entre polidimetilsiloxano elástico (PDMS) postos em um formato de 24 poços. Tridimensionais, EHTs geradores de força constituem dentro de duas semanas após a fundição. Este procedimento permite a geração de várias centenas de EHTs por semana e é tecnicamente limitado apenas pela disponibilidade de cardiomiócitos (0,4-1,0 x 10 6 / EHT). Avaliação das contracções musculares auxotonic é executada numa câmara de incubação modificado com um mechanintertravamento ical para placas de 24 poços e uma câmara colocada no topo desta câmara. Um software controla uma câmara moveu-se sobre um sistema de eixos XYZ para cada EHT. EHT contracções são detectadas por um algoritmo figura reconhecimento automatizado, e força é calculada com base no encurtamento do EHT e a propensão elástica e geometria dos postes PDMS. Este procedimento permite a análise automática de um número elevado de EHT sob condições padronizadas e estéreis. A detecção confiável de efeitos de drogas sobre a contração dos cardiomiócitos é crucial para o desenvolvimento de drogas cardíaca e farmacologia de segurança. Demonstramos, com o exemplo do hERG inibidor do canal de E-4031, de que o sistema EHT humano replica de respostas ao fármaco sobre a cinética de contracção do coração humano, indicando que ele seja uma ferramenta promissora para o rastreio de segurança de medicamentos cardíaca.

Introdução

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efeitos colaterais cardíacos, tais como a síndrome do QT longo induzido por drogas levaram a retiradas do mercado ao longo dos últimos anos. As estatísticas indicam que cerca de 45% de todas as retiradas são devido a efeitos indesejáveis sobre o sistema cardiovascular 1. Esta falha de drogas após o processo de desenvolvimento caro e aprovação é o pior cenário para as empresas farmacêuticas. departamentos de pesquisa e desenvolvimento, portanto, concentrar-se na detecção de tais efeitos cardiovasculares indesejáveis ​​logo no início. Para preocupações econômicas e éticas, os esforços para reduzir as experiências com animais e substituí-los com novos testes de rastreio in vitro estão em andamento.

Um conjunto de ensaios estabelecidos estão incluídas nos Estados Unidos Food and Drug Administration (FDA) e da Agência Europeia de Medicamentos (EMA) diretrizes para a avaliação pré-clínica de efeitos de drogas pró-arrítmicos 2. A tecnologia de reprogramação de células somáticas seguido por diferenciação dehumanas induzidas células estaminais pluripotentes (hiPSC) impulsionado a investigação neste campo 3. Ele agora oferece a possibilidade de filtrar candidatos a novos fármacos em cardiomiócitos humanos in vitro e evita problemas com diferenças inter-espécies. Protocolos de diferenciação cardíacos recentes 4, 5 fornecem suprimento ilimitado de cardiomiócitos, sem preocupação ética. No entanto, a medição da força contráctil, o mais importante e mais bem caracterizado no parâmetro vivo de cardiomiócitos, não está bem estabelecida. Isto está relacionado com a relativa imaturidade 6 de cardiomiócitos humanos induzida estaminais pluripotentes derivadas de células (hiPSC-CM), em comparação com o cardiomiócito adulto. Um avanço possível é para a engenharia de tecidos do coração 3-dimensional a partir de células individuais 7 (tecido cardíaco engenharia, EHT). O protocolo EHT é baseado sobre a incorporação de murino único ou cardiomiócitos humanos 8 sup>, 9, 10 em hidrogel de fibrina entre dois polidimetilsiloxano flexível (PDMS) 11 mensagens no formato de 24 poços. Dentro de poucos dias os cardiomiócitos começar a se contrair espontaneamente como células individuais e começam a se formar redes celulares. Depois de 7-10 dias, as contracções macroscópicas de todo o tecido são visíveis. Durante este processo, a matriz extracelular é remodelado, o que leva a uma diminuição do diâmetro e comprimento. O encurtamento dos resultados EHT em flexão do PDMS deixar mesmo durante o repouso, submetendo o composto EHT cardiomiócitos em desenvolvimento a carga contínua. EHTs continuar a realizar contrações musculares auxotonic longo de várias semanas. EHTs humanos mostram respostas à estimulação fisiológica e farmacológica que indicam a sua adequação para o rastreio de drogas e doença modelar 7.

Neste manuscrito apresentamos um protocolo robusto e fácil para os geraçãno do composto EHT humano, e a análise da contractilidade automatizado de alterações dependentes da concentração do padrão de contracção na presença de inibidores do canal hERG.

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Protocolo

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NOTA: Os passos seguintes descrevem um protocolo de cultura de células. Por favor realizar sob condições estéreis e usar meios de pré-aquecido.

1. cardíaca Diferenciação de hiPSC

  1. Cultivar a hiPSC
    1. Revestir placas de 6 poços (1 ml / cavidade) ou frascos T75 (7 ml / frasco) com matriz de membrana basal reduzida do factor de crescimento (por exemplo geltrex, 1: 200; ver tabela de materiais) diluída em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) para 30 min a 37 ° C. Preparar o meio FTDA 12 através da mistura de DMEM básico / meio F-12 com 2 mM de L-glutamina, 0,5% de penicilina / estreptomicina, 5 mg / L de transferrina, 5 mg / L de selénio, 0,1% de albumina de soro humano, 1x lípido de mistura, 5 mg / L de insulina, 50 nM dorsomorphin, TGFß1 2,5 ng / ml de activina A, 0,5 ng / ml humano e 30 ng / mL de FGF2.
    2. HiPSC semente (~ 3 x 10 5/10 cm) em FTDA meio e cultura a 37 ° C, 5% de CO2, 21% O2, com mudança de meio dia (Figura 1A). A 80% de conflucia, passagem (1: 2-1: 6) com etileno-diamina tetra-acético (EDTA; 0,5 mM; tempo de incubação ~ 4 min).
  2. Formação de corpos embrióides (EB)
    1. Cultivar hiPSC em frascos T75 a alta densidade.
      1. Lavar frascos com células confluentes duas vezes com solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio (PBS) e incuba-se em EDTA 0,5 mM durante ~ 10 min. Certifique-se as células não destacar do fundo do frasco.
      2. Remover EDTA com pipeta de vidro, lavar as células com 10 ml de PBS, toque em frascos no banco para separar células.
        NOTA: Use raspador de células, se necessário.
      3. Recolher as células em 50 ml de tubo cónica, adicionar ¼ do volume (por exemplo, 10 mL de RPMI a 40 mL de suspens celular) meio RPMI 1640 (ou qualquer outro meio convencional contendo cálcio 1,8 mM) e centrifugar a 250 xg durante 5 min.
    2. Ressuspender o sedimento de células em meio FTDA suplementado com 4 mg / mL de álcool polivinílico (PVA) e10 uM Y27632 e contar as células numa câmara de Neubauer.
    3. Encher o balão rotativo com a suspensão de células (30 x 10 6 culas / 100 ml de meio suplementado com FTDA PVA e Y-27632; ver passo 1.2.2) e iniciar a formação de EB em frascos rotativos (ajustar a velocidade do rotor de um agitador magnético a 40 rpm ) na incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% CO 2, 5% de O2) durante a noite.
  3. diferenciação mesodérmica
    1. Durante a formação EB, cultura de células de revestimento apropriado para frascos de cultura em suspensão com surfactante não iónico (14 mL / T175) durante a noite a 37 ° C.
    2. Na manhã seguinte, lavar frascos revestidos com tensioactivo duas vezes com PBS (30 ml / T175). Adicionar PBS novamente e manter na incubadora até que seja necessário.
    3. Retirar o frasco de rotação a partir do incubador.
      NOTA: A suspensão de células deve ser claro com pequenas EBs macroscopicamente visíveis (Figura 1B).
    4. Transferir 50 ml de suspensão de uma banheira cónico de 50 mle e permitem resolver EBs para 5-20 min.
    5. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento com 7 mL de meio RPMI 1640 suplementado com 2% de PVA e 10? M Y-27632. suspensão de transferência para um graduado tubo de 15 ml e a estimativa do volume EB (~ 50-100 mL).
    6. Transferir o conteúdo dos frascos rotativos para frascos T175 não revestidos e deixar este no bastidor em forma de V para sedimentação durante até 20 min. Remover o sobrenadante e lavar corpos embrióides como indicado acima. Não encha o frasco T175 com mais de 200 mL como sedimentação levaria muito tempo. Se o volume inicial frasco de rotação superior a 200 mL, dividido suspensão EB para vários frascos T175 e combinar EBs novamente após a lavagem.
    7. Remover o meio de lavagem e ressuspender em meio de diferenciação da mesoderme, que é meio RPMI suplementado com 4 mg / ml de PVA, 0,5% de penicilina / estreptomicina, 10 mM de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES), 0,05% de soro humano albumina, 5 ug / ml de transferrina, 5 ng / ml de selenito de sódio, 0,1% de mistura de lípidos, 250 uM fosfo-ascorbato, 10? M Y-27632, de 10 ng / mL de proteína morfogénica do osso-4 (BMP-4), e 3 ng / ml de activina A, 5 ng / mL de FGF2 estável.
    8. Remover PBS a partir de frascos T175 revestidos com tensioactivo e encher com suspensão de células (200 uL EBs em 40 mL). Use frascos menores para menor volume de EB.
    9. Cultivar EBs em suspensão durante três dias (37 ° C, 5% CO 2, 5% de O2). Troca de 50% do meio (mesma composição que no passo 1.3.7) todos os dias (rack de sedimentação em forma de V uso). Prepare meio fresco a cada dia antes da alimentação.
  4. diferenciação cardíaca
    1. Preparar novos vasos revestidos com tensioactivo antes do dia e manusear como indicado acima (1.3.2).
    2. Depois de três dias de indução mesodérmica, deixar EBs contentar com até 5 minutos na cremalheira de sedimentação. Remover a maior parte do meio e lava-se com RPMI 1640 suplementado com 0,5% de penicilina / estreptomicina e HEPES 10 mM.
    3. Transferem-se 10 ml de suspensão de EB formou15 mL tubo e a estimativa do volume EB após sedimentação.
    4. Ressuspender EBs cuidadosamente em meio de diferenciação cardíaca que consiste em meio RPMI 1640 suplementado com 0,5% de penicilina / estreptomicina, HEPES 10 mM, 0,05% de albumina de soro humano, 5 ug / ml de transferrina, 5 ng / ml de selenito de sódio, 0,1% de mistura de lípidos, 250 uM fosfo ascorbato, 1? M Y-27632, 100 nM de inibidor de Wnt-DS-I-7 13.
    5. Transferir EBS para novos frascos de cultura de células revestidas com surfactante (~ 200 mL EBs em 46 mL / T175).
    6. Incuba-se durante três dias (37 ° C, 5% de CO 2, 21% de O 2) com 50% de variação média (composição do meio veja passo 1.4.4) sobre o segundo e terceiro dias. Não mude o meio nas primeiras 48 h.
    7. Incubar em meio consistindo em meio RPMI 1640 suplementado com 500? M 1-tioglicerol, HEPES 10 mM, 0,5% de penicilina / estreptomicina, 1? M Y-27632, 2% de suplemento de cultura de células neurais isento de soro (por exemplo B27) com insulina, 100 nM de Wnt -inhibitor DS-I-7 com troca de meio por dia 50% para os quatro dias seguintes. EBs deve começar a bater dentro deste período.
    8. Após uma semana de diferenciação cardíaca, mudar para o mesmo meio, sem a inibição de Wnt e com suplemento de cultura de células neurais isento de soro. Mudar 50% do meio todos os dias, exceto para o primeiro dia.
  5. Dissociação de cardiomiócitos humanos
    NOTA: Depois de duas semanas de protocolo de diferenciação, EBs deve mostrar contracções espontâneas (Figura 1C). Se assim for, começar a dissociação e preparar solução de colagenase.
    1. Preparar a soluo de colagenase por pesagem e solução de 200 U / mL em solução de sal equilibrada isenta de cálcio de Hank sem cálcio / magnésio (HBSS) e adicionar HEPES 1 mM, 10? M Y-27632, de 30 uM sulfonamida-N-benzil-p-tolueno ( BTS). Esterilizar por filtração (filtro de 0,2 um) e alíquotas armazenar a -20 ° C. Descongelar alíquotas a 4 ° C durante a noite.
    2. Settle EBS em rack de sedimentação,meio aspirado e substituir com HBSS 20-25 mL de pré-aquecido. Repetir esta etapa de lavagem mais uma vez.
    3. Aspirar HBSS e substituir com solução de colagenase pré-aquecido (15 mL / T175). Incuba-se durante 4 horas na incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% de CO2, 21% de O2).
    4. Preparar tampão de bloqueio com DMEM suplementado com 1% de penicilina / estreptomicina e ADNase (12 ug / mL).
    5. Toque nos frascos de cultura celular no banco, dissociada EBs deve desintegrar-se e cair (se não, aumentar o tempo de incubação). suspensão de células suavemente triturado e transferência para um tubo cónico de 50 mL. Lavar frascos com tampão (15 mL / T175) de bloqueio e transferir para o tubo.
    6. Centrifugar durante 10 minutos a 100 x g. Ressuspender as células em DMEM quente, triturar e contagem de células.

2. Geração de Engineered coração Tissue (EHT)

  1. Autoclave cremalheiras PDMS comercialmente disponíveis e politetrafluoretileno (PTFE) espaçadores (ver Materiais ePlanilha equipamentos; Figura 2) e preparar as seguintes soluções sob condições de esterilidade, um dia antes da geração EHT.
    1. Preparar 2% de agarose por pesagem e dissolução num volume apropriado de PBS, autoclave, armazenar imediatamente a 60 ° C.
    2. Prepare aprotinina (33 mg / mL) por pesagem e dissolução num volume apropriado de Aqua ad iniectabilia, filtro estéril (filtro de 0,22 um), alíquota e armazenar a -20 ° C.
    3. Preparar fibrinogénio (200 mg / ml) por dissolução de fibrinogénio estéril num volume apropriado de 0,9% de NaCl (morna), alíquota e armazenar a -20 ° C.
    4. Prepare de trombina (100 U / ml) por dissolução de trombina estéril em três partes de PBS estéril e 2 partes iniectabilia ad aqua, partes alíquotas de 3 mL em tubos pequenos e armazenar a -20 ° C.
    5. Prepare 10x DMEM por dissolução de 670 mg de 10x DMEM em pó em 5 mL de anúncios iniectabilia aqua, filtro estéril e armazenar a 4 ° C.
    6. Prepare 2x DMEMpor mistura de 2 ml de 10x DMEM com 2 ml de soro de cavalo inactivado pelo calor, 0,2 ml de penicilina / estreptomicina e 5,8 mL iniectabilia ad aqua, filtro estéril e armazenar a 4 ° C.
    7. Prepare EHT de fundição de forma (ECM) por mistura de DMEM com 10% de soro inactivado por calor fetal de vitelo, 1% de penicilina / estreptomicina e 1% de L-glutamina (200 mM), armazenar a 4 ° C.
  2. Preparar moldes de vazamento em placas de 24 poços, pipetando 1,6 mL de agarose quente (2%, PBS) e colocando o PTFE espaçador (Figura 2A) para os poços.
    NOTA: Coloque espaçador imediatamente após pipetagem para um máximo de 8 poços - agarose solidifica muito rápido. Não deixar a agarose à temperatura ambiente durante mais de 5 min.
  3. Após a solidificação de agarose (~ 10 min, agarose girará opaco), remover os espaçadores de PTFE (Figura 2C) e colocar os PDMS cremalheiras (Figura 2B) para dentro dos moldes de fundição de modo a que pares de postes de PDMS atingir em cada um dos moldes (Figura 2D).
  4. Ressuspender as cardiomiócitos em ECM com uma concentração mínima de 15 x 10 6 culas / mL.
  5. Preparar 110% do volume estimado de mistura reconstituição num tubo de fundo redondo de 15 ml em 24 ice.For EHTs, pipetar a mistura reconstituição listados na Tabela 1 para humanos, rato ou ratinho cardiomiócitos, respectivamente (10% extra está incluído).
    NOTA: A concentração celular da mistura de reconstituição é diferente de (6,8 x 10 6 culas / mL) EHTs humano (10 x 10 6 culas / mL), de rato (4,1 x 10 6 culas / mL) e de ratinho. Dependendo da concentração da suspensão de células, adicionar ECM adicional para um volume final de 2640 uL. Fibrinogênio tem que ser morna por pipetagem. Lentamente encher a ponta da pipeta e não toque a superfície da mistura de reconstituição frio com a pipeta contendo fibrinogénio fibrinogénio ao adicionar à mistura reconstituição - a viscosidade do fibrinogénio na ponta da pipeta aumentaria imediatamente.
  6. Tritura-se a mistura de reconstituição 10 - 15 vezes com uma pipeta serológica até que o coágulo de fibrinogénio é dissolvido. Verifique a mistura reconstituição na pipeta de homogeneidade.
  7. Para cada composto EHT, pipeta 100 uL mistura reconstituição em uma aliquota de trombina (3 uL em 200 uL de tubo), misturar e pipetar a mistura em agarose-intervalos tão rapidamente quanto possível (Figura 2E). Utilize uma nova ponta de filtro para cada EHT. Ressuspender a mistura reconstituição (trituração com pipeta serológica 5-10 vezes) depois de cada 8 EHTs.
  8. Uma vez que todas as ranhuras são cheias com uma mistura de reconstituição, fechar a tampa do prato de cultura de células e incubar a 37 ° C, 7% de CO 2 durante 2 h.
  9. Remova a placa do incubador e coloca-se sob uma cobertura estéril. Cobrir cada poço com uma pequena quantidade de meio (por exemplo, DMEM, aproximadamente 200-500 mL), agitar a placa suavemente e incuba-se novamente a 37 ° C durante pelo menos 10 min. A adição de DMEM irá facilitar a remoção a partir de geles de fibrina a partir de moldes de fundição de agarose.
  10. Prepara-se uma nova placa de 24 pos com 1,5 mL EHT-meio por cavidade que consiste em DMEM suplementado com 10% de soro de cavalo inactivado termicamente, 1% de penicilina / estreptomicina, 10 pg / ml de insulina, 33 ^ g / mL aprotinina.
  11. Cuidadosamente remover as prateleiras de PDMS a partir dos moldes de fundição de agarose e transferi-los para a placa de 24 poços cheios com meio (Figura 2F). Colocar o prato de volta na incubadora (37 ° C, 7% de CO2, 40% de O 2 para EHTs humanos e de rato, 21% de O 2 para EHTs rato) e alimentação segundas, quartas e sextas-feiras com EHT-meio preparado de fresco. EHTs deve mostrar as contracções espontâneas de desvio aos pilares das cremalheiras PDMS 7-10 dias após a fundição (Figura 1D, 2G).
    1. Para rato EHTs adicionar 25? G / mL de βDarabinofuranoside 5-citosina para meio de cultura durante 48 h para limitar a proliferação de fibroblastos.

Análise 3. Contração

NOTA: A análise de contração é baseado emvídeo-óptico de gravação em um instrumento de análise EHT disponível comercialmente (ver Tabela de materiais). A unidade central deste aparelho é uma câmara de incubação (Figura 3A). O software fornecido com o instrumento calcula a força de contração com base na deflexão das mensagens de PDMS com módulo de elasticidade conhecido e geometria 11 (Recurso Figura 1).

  1. Ligar o dispositivo de aquecimento da máquina de 2 h antes da medição. Ligue o fornecimento de gás de alimentação e electrónico do sistema de eixos imediatamente antes da análise contracção.
  2. Para a gravação da linha de base (ponto de referência para a análise), colocar a poços de placa 24 com as EHTs em EHT-forma para o instrumento de análise EHT e iniciar o software de análise de contracção de acordo com o manual do fornecedor.
    1. Clique na guia "Protocolo" no painel da direita e digite as informações pertinentes relativas nome estudo, usuário, espécie, ceTipo II, idade, tempo de gravação e observações adicionais.
    2. Clique na guia "view Camera" no painel esquerdo e iniciar o modo de viver câmera com modo de detecção figura automático. Clique na guia "Setup" no painel da direita andadjust a posição da câmera com o xyz coordenadas para cada poço na 24 bem-prato. Verifique se o EHT está no centro da janela e no foco da câmera.
      1. Verifique se a tampa da placa de cultura de células não é nebuloso pois isso irá prejudicar o reconhecimento figura e análise de contração.
        NOTA: O algoritmo figura reconhecimento é baseado na detecção de áreas de alto contraste e monitorizar a sua mudança de posição. No software estas áreas de reconhecimento figura será marcado com uma cruz azul que se move com as contrações do EHT.
      2. Certifique-se de que as posições das cruzes azuis são em ambas as extremidades superior e inferior das EHTs e movendo-se apenas verticalmente correspondentes as contracções dos EHTs (Figura 3B). Sposições de instalação ave de cada bem, pressionando o botão "posição ok".
    3. Em seguida, clique na guia "Parâmetros" no painel esquerdo. Os parâmetros exibidos aqui definir os critérios pelos quais o software identifica um pico de contração e marca-lo com um quadrado verde. Estes valores são muito importantes para a identificação correcta de picos de contracção (Figura 3C) e não há pontos de dados falsos (Figura 3E-F).
      NOTA: uma lista de espécies parâmetros dependentes e exemplos está representado na Figura 3H. Para mais detalhes, consulte o manual do software.
    4. Clique na guia "Automatic" no painel da direita e iniciar a análise, ativando o botão "Iniciar". O software irá mover sequencialmente de um bem para os próximos, ficha contrações EHT e calcular a força durante a gravação (exibida na guia "tempo real" no painel esquerdo). Ao final da análise, um relatório pdf summariXing, os resultados serão gerados automaticamente.
  3. Guardar e analisar o pdf denunciar o sistema gerado para resumir os resultados.
  4. Monitorar os parâmetros contráteis por medição repetida ao longo de vários dias. O composto EHT irá aumentar em força de contracção até que tenha atingido um patamar (normalmente por volta do dia 15 de cultura).
  5. o rastreio de drogas
    1. Preparar a solução de Tyrode livre de proteína no dia anterior à medição e equilibrar em placas de 24 poços (2 ml / po) numa incubadora de cultura de células (37 ° C, 7% de CO2, 40% de O2) durante a noite: 120 mM de NaCl, KCl 5,4 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2 0,1-5, 0,4 mM de NaH 2 PO 4, 22,6 mM de NaHCO3, 5 mM de glucose, 0,05 mM Na 2 EDTA, 25 mM de HEPES. Adicionar cálcio até 1,8 mM ou o previamente determinado [EC50] para investigar os efeitos inotrópicos positivos.
    2. Pesar e dissolve-se o fármaco em DMSO e filtrar esterilizado, se necessário.Prepare soluções diferentes 6 1000x-sub-banco (em DMSO) dos concentração de trabalho (por exemplo, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 ^ M para o respectivo gama nanomolar).
    3. Dilui-se a respectiva estoque em placas de Tyrode (2 uL em cada poço 2 ml) e misturar bem. Colocar as placas de novo na incubadora até ser necessário.
    4. Inicie a medição da linha de base, tendo o primeiro de 24 poços de placa cheia de Tyrode sob os eléctrodos de capuz e carbono posição estéreis nos poços. Transferir os cestos de PDMS com as EHTs colocados no topo de eléctrodos de carbono, fechar a tampa, colocar a placa de volta na incubadora e esperar por um período de equilíbrio de ~ 30 min.
    5. Transferir os EHTs da incubadora para o encravamento no instrumento de análise EHT. Fechar o instrumento e gravar contractilidade espontânea de linha de base (20 s / EHT).
    6. Ligar os eléctrodos de carbono para o cabo de estimulação e iniciar a estimulação eléctrica das EHTs (2,5 V, 4 ms de duração de impulso, humana: ~ 1 Hz, ratazana: ~ 2Hz, rato: ~ 4 Hz). Registar a linha de base "acelerado" (10 s / EHT). Assegurar que todos os EHTs estão devidamente passeado. frequência de estimulação e a tensão pode variar de linha celular para linha celular.
    7. Após a gravação da linha de base, remover os EHTs do instrumento e transferir os eléctrodos com as cremalheiras PDMS em cima, para o bem-placa de 24 com a primeira concentração de droga. Transferir a EHTs de volta para o encravamento do instrumento de análise EHT imediatamente e incubar lá (padrão de incubação da droga o tempo, por exemplo 20 minutos).
    8. Ligar os cabos de estimulação, ajustar reconhecimento figura e gravar contracções EHT respondendo à primeira concentração do fármaco.
    9. Para as seguintes concentrações de droga, repetir o passo 3.5.7 e 3.5.8 com o 24-well-placas contendo concentrações mais elevadas da droga.
    10. Salve todas as gravações pdf. Verificar cada gravação para reconhecimento figura, o posicionamento correcto dos quadrados verde identificar picos da contração e artefactos (ver 3.2.1 e Figura 3 ).
    11. Realizar análise offline adicionais, se necessário.
      1. Escolha o respectivo prazo do banco de dados "Funciona" no painel esquerdo, clicando em "Select run". Na aba "parâmetro", à esquerda, alterar o parâmetro para a análise de contração. Agora escolha "análise off-line" no separador "off-line" no painel direito de reanalisar os vídeos.
      2. Para ajustar o reconhecimento figura e, portanto, gravar um novo arquivo de vídeo, escolha "revisão Sample" depois de ajustar o reconhecimento figura na guia "em tempo real". NOTA: revisão Amostra só pode reanalisar um poço de cada vez, enquanto que a análise offline pode aplicar novo parâmetro para todos os poços clicando no botão "Use parâmetro em todos os poços" botão no painel "Parâmetro" na esquerda. Ambos os tipos de análises off-line irá criar automaticamente novos arquivos de dados e pdf exibindo os resultados.
    12. Analisar o experimento, combinando os resultados da biological replica e resumir os dados em curvas de resposta à concentração para a frequência, a força de contração, tempo de contração e tempo de relaxação (Figura 5D) e de exibição / ou gráfico de picos de contracção média (Figura 5C).
      NOTA: As cremalheiras do PDMS e PTFE espaçador pode ser usado repetidamente (PDMS prateleiras no máximo 5 vezes, e PTFE espaçador indefinidamente.). Após a utilização, limpá-los manualmente com água, ferver duas vezes em água desmineralizada e autoclave. Estar ciente dos potenciais efeitos de transferência, quando re-utilizando as prateleiras, como drogas pode ser absorvido pelos PDMS.

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Resultados

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Diferenciação cardíaca e Preparação do composto EHT

HiPSC foram expandidas na matriz de membrana basal factor de crescimento reduzida, dissociadas com EDTA e corpos embrióides (EBS) formadas em frascos rotativos durante a noite. Após a indução mesodérmica durante três dias, a diferenciação cardíaca foi iniciado com o inibidor de Wnt. Depois de ~ 17 dias de protocolo de diferenciação, EBs batendo foram dissociadas em células indiv...

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Discussão

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tecido do coração Engineered oferece uma opção valiosa para a caixa de ferramenta de pesquisa cardiovascular. EHTs no formato de 24 poços provaram valiosa para a modelagem de doença 8, 14, o rastreio de segurança de medicamentos 7, 8, 10, 11, 15, ou de investigação cardiovascular básica

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Divulgações

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IM, TE e AH são co-fundadores da EHT Technologies GmbH, Alemanha.

Agradecimentos

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Os autores são gratos a Alessandra Moretti e Dennis Schade para o seu tipo contribuição de material. Reconhecemos o grande apoio do grupo de trabalho iPS e EHT no Departamento de Farmacologia e Toxicologia Experimental do UKE. O trabalho dos autores é suportado por concessões do DZHK (Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular) e do Ministério da Educação alemão e Pesquisa (BMBF), a Fundação Alemã de Pesquisa (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), Centro Nacional britânico para a substituição Refinamento & Redução de animais em pesquisa (NC3Rs CRACK-IT conceder 35911-259146), a British Heart Foundation RM / 13/30157, o Conselho Europeu de Investigação (Advanced Grant IndivuHeart), a Fundação alemã de coração ea Freie und Hansestadt Hamburg.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Instrumento de análiseEHT EHT Technologies GmbHA0001O software está incluído
Rack EHT PDMSEHT Technologies GmbHC0001
EHT Espaçador de PTFEEHT Technologies GmbHC0002
Eletrodo EHTEHT Technologies GmbHP0001
Adaptador/cabo de estimulaçãoEHT EHT Technologies GmbHP0002
Placa de 24 poçosNunc144530
Placa de cultura de células de 6 poçosNunc140675
tubo de falcão de 15 mL, graduado Sarstedt62,554,502
Raspador de célulasSarstedt831,830
Frasco giratórioIntegra182 101
Agitador Variomag/ Cimarec Biosystem Direct Thermo scientific70101Ajuste a velocidade do rotor para 40 rpm
T175 frasco de cultura de células Sarstedt 831.812.002
Rack de sedimentação em forma de V Feito sob medida no UKE Hamburgna
10× DMEMGibco52100
1-Tioglicerol Sigma AldrichM6145
Sal trissódico de ácido 2-Fosfo-L-ascórbicoSigma Aldrich49752
Activin-A R& D systems338-AC
Agarose Invitrogen15510-019
AprotininSigma AldrichA1153
Aqua ad injectabiliaBaxter GmbH1428
B27 PLUS insulina Gibco17504-044
BMP-4R& D systems314-BP
Collagenase II WorthingtonLS004176
DMEMBiochromF0415
DMSO Sigma AldrichD4540
DNase II, tipo V (de baço bovino)Sigma D8764
Dorsomorfina abcamab120843
EDTA Roth8043.2
Soro fetal para bezerrosGibco10437028
FGF2Miltenyi Biotec130-104-921
Fibrinogênio (bovino)Sigma AldrichF8630
Geltrex GibcoA1413302Para revestimento: diluição 1:200
HBSS sem Ca2+/Mg2+ Gibco14175-053
HEPES Roth9105.4
Soro de cavaloLife technologies26050088
Albumina de soro humano Biological Industries05-720-1B
Insulina, humanaSigma AldrichI9278
L-GlutaminaGibco25030-024
Lipidmix Sigma AldrichL5146
MatrigelBD Biosciences354234Para EHT reconsitutionmix.
N-Benzil-p-ToluenosulfonamidaTCIB3082-25G
PBS sem MgCl2/CaCl2Biochrom14190
Penicilina/EstreptomicinaGibco15140
Plurônico F-127 Sigma AldrichP2443
Álcool polivinílico Sigma AldrichP8136
RPMI 1640 Gibco21875
Selenito de SódioSigma AldrichS5261
TGFß 1Peprotech100-21
TrombinaSigma AldrichT7513
Transferrin Sigma AldrichT8158
Y-27632Biorbytorb6014
hiPSCFeito sob medida no UKE hamburgna
iCell cardiomiócitos kitCellular Dynamics InternationalCMC-100-010-001
Kit de cardiomiócitos pluricitáriosPluriomicsPCK-1.5
Cor.4U - Kit de cardiomiócitos HiPSCAxiogenesis AGAx-C-HC02-FR3
Cardiomiócitos CellartisTakara Bio USA, Inc.Y10075

Referências

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  1. Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines? Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
  2. Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals. , U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm074963.pdf (2005).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  4. Burridge, P. W. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  5. Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).
  6. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  7. Mannhardt, I. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
  8. Eder, A. Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 109 (6), 436(2014).
  9. Stöhr, A. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).
  10. Schaaf, S. Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397(2011).
  11. Hansen, A. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  12. Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PloS One. 7 (7), e41958(2012).
  13. Lanier, M. Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response. J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).
  14. Hirt, M. N. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).
  15. Jacob, F. Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue. PLoS One. 11 (2), e0145937(2016).
  16. Friedrich, F. W. Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).
  17. Crocini, C. Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 108 (3), 349(2013).
  18. Fiedler, J. Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization. J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).
  19. van Meer, B. J. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).
  20. Godier-Furnémont, A. F. G. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  21. Eng, G. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Commun. 7, 10312(2016).
  22. Huebsch, N. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).
  23. Masumoto, H. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).
  24. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues. Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).
  25. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  26. Vandenburgh, H. Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  27. EHT Technologies GmbH. , Available from: http://www.eht-technologies.com Forthcoming.

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