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Artigo de método

Purificação de DNA de alto peso molecular genômico de oídio de longo Read Sequencing

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DOI:

10.3791/55463

⸱

31 de março de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California Berkeley, 2John Innes Centre, Norwich Research Park, 3Department of Plant and Microbial Biology, University of Zürich, 4USDA-ARS Sunflower and Plant Biology Research Unit

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Descrito aqui é um método para a extração, purificação e controle de qualidade do DNA genômico do patógeno fúngico biotrófico obrigatório, oídio, para uso em sequenciamento de genoma de leitura longa.

Resumo

Os fungos de oídio são um grupo de economicamente importantes agentes patogénicos fúngicos de plantas. Relativamente pouco se sabe sobre a biologia molecular e genética de estes agentes patogénicos, em parte devido à falta de recursos genéticos e genómicos bem desenvolvidos. Estes organismos possuem grandes genomas, repetitivas, que fizeram a sequenciação e montagem do genoma proibitivamente difícil. Aqui, nós descrevemos métodos para a avaliação de recolha, a extracção, purificação e controle de qualidade de ADN genómico de elevado peso molecular a partir de espécies de míldio em pó, um Golovinomyces cichoracearum. O protocolo descrito inclui ruptura mecânica de esporos seguido por uma extracção de ADN genómico optimizado fenol / clorofórmio. Um rendimento típico foi de 7 g de ADN por 150 mg de conídios. O ADN genómico que é isolado utilizando este procedimento é adequado para a sequenciação de leitura longa (isto é,> 48,5 kpb). medidas de controlo de qualidade para assegurar o tamanho, rendimento e a pureza do ADN genómico são igualmentedescrito neste método. A sequenciação do ADN genómico da qualidade descrito aqui vai permitir a montagem e a comparação dos múltiplos genomas de oídio, que por sua vez irá conduzir a uma melhor compreensão e uma melhor controle deste patogénio agrícola.

Introdução

Oídios são um grupo de obrigatório planta fúngico biotrófica agentes patogénicos que, quando tomados em conjunto, são a maior causa de doenças de plantas em todo o mundo 1. Existem mais de 900 espécies descritas de oídio, que foram taxonomicamente agrupadas em cinco tribos dentro da família Erisyphaceae 2. Devido tanto à sua importância econômica e a íntima relação que desenvolvem com seus anfitriões, doenças de oídio foram objecto de investigação por> 100 anos. Após a infecção, oídio provocar mudanças drásticas na estrutura celular, metabolismo e biologia molecular de seus hospedeiros, para beneficiar deste patógeno. No entanto, o estudo de oídios é particularmente difícil devido ao seu estilo de vida obrigatória, e o crescimento do fungo em cultura pura ainda não foi descrito 3, 4, 5,"xref"> 6, 7, 8. Reliable transformação, estável genética de oídios ainda não foi também conseguida, embora a expressão transiente tem sido relatada em algumas espécies 9, 10.

O sequenciamento e montagem de genomas oídio tem sido difícil devido a uma série de características do próprio genoma. Genomas oídio são grandes (120-180 MBP) em relação a outros genomas de fungos, e consistem em 60 - 90% de elementos repetitivos uniformemente distribuídas 11. Estes elementos incluem repeties terminais longas não, bem como elementos repetitivos não classificadas. Dois speciales formae de uma única espécie de oídio, Blumeria graminis f. sp. hordei e f. sp. tritici (BGH e Bgt, respectivamente), bem como o míldio pulverulento da uva Erysiphe necator, têm abelhan sequenciado, e os projectos de genomas de vários outros foram concluídos 12, 13, 14. A natureza repetitiva dos genomas fez montagem difícil, e o genoma Bgh completada foi montado em 6.989 supercontigs com um L50 de 2 Mb 12.

Apesar do grande genoma, os míldios pulverulentos parecem ter um pequeno número de genes que codificam proteínas, com 5.845 e 6.540 genes previstos em Bgh e Bgt, respectivamente. Os oídios sequenciados também parecem carecer de pelo menos 99 genes principais que são essenciais em outros fungos, o que é consistente com a dependência dos fungos na sua planta hospedeira para a sobrevivência de 11, 12, 13, 14.

seqüências repetitivas perto telômeros, centrômeros, RN ribossomalA matrizes e as regiões enriquecidas em elementos transponíveis de genes são mal montada a partir de estratégias de sequenciação de curto-ler e são frequentemente sub-representados em conjuntos de 15 genoma. Tais regiões são pensados para ser responsável por muitas das lacunas que ocorrem em sequências do genoma, e isto aplica-se aos míldios pulverulentos, com o seu grande expansão de elementos repetitivos 16. Altamente regiões do genoma de plástico são freqüentemente encontrados nessas regiões repetitivas 3. Eles servem como um local de rearranjos de cromossomas e muitas vezes codificam genes sob forte pressão selectiva, tais como os genes que codificam para proteínas efectoras e os genes que codificam as enzimas do metabolismo secundário. Advances in única molécula de tecnologias de sequenciação de leitura longa fornecer uma solução potencial para a sequenciação através das regiões repetitivas de genomas 15. Por exemplo, Faino et al. (2015) verificaram que a inclusão de sequência de leitura longa e tecnologias m ópticoapping lhes permitiu produzir uma sequência de genoma lacuna-menos para duas estirpes de planta fúngico patógeno dália Verticillium, triplicando a proporção de sequências repetitivas de ADN no genoma, aumentando o número de notas de genes (e a redução do número de parcial ou ausente anotações gene ) e revelador genoma rearranjos 17.

Para empregar estas tecnologias de sequenciamento de leitura longa, altas concentrações de DNA genômico de alta qualidade, com o mínimo de tamanhos> 20 kbp, são necessários. Descrevemos aqui os nossos métodos para a recolha de conídios, purificação de DNA de alto peso molecular a partir de conídios e nossas avaliações de controlo de qualidade utilizando as espécies de oídio Golovinomyces cichoracearum cultivadas em pepino 18. Este protocolo baseia-se num protocolo desenvolvido no laboratório grupo B. Keller (Universidade de Zurique, Zurique Suíça) 13, 19e inclui várias modificações que levaram ao aumento da produção de ADN e uma proporção mais elevada de ADN de> 48,5 kpb em tamanho. O protocolo também inclui etapas de controle de qualidade com base nas recomendações do Departamento de Estados Unidos da Joint Genome Institute Energia 20, 21, 22.

A função de cada um dos reagentes incluídos no tampão de lise, e a razão para cada passo de purificação, são como descrito em Henry (2008) 23. Disponíveis protocolos publicados para o isolamento de DNA de alto peso molecular genómico a partir de tecidos de plantas e microbianas foram também consultados durante a concepção deste protocolo 24, 25, 26, 27, 28.

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Protocolo

1. Preparação do material Fúngica

  1. Crescer Oídio
    1. Cultivar plantas em câmaras de crescimento com as seguintes condições: 22 ° C dia temperatura, 20 ° C Temperatura de noite, 80% de humidade relativa, 14 h duração do dia e uma intensidade de luz de 125 μE / m 2 / s (fornecida pela iluminação fluorescente ).
    2. Infectar plantas de pepino (Cucumis sativa variedade de Bush Champion) com Golovinomyces cichoracearum UCSC1 estirpe como descrito 18, 29.
  2. Colheita Oídio conídios
    1. Colheita conídios de plantas infectadas em 7 - 10 dias após a inoculação com um pequeno vácuo com um filtro em linha (11? M) na qual os conídios acumular. Aplicando uma pressão suave, executar a tubeira de vácuo ao longo da superfície da folha de recolher os conídios.
      NOTA: O rendimento médio de G. cichoracearum é de 20 mg de conídios de um fortemente INFECTED folha de pepino de cerca de 130 cm2 de área.
    2. Escova de cerca de 150 mg do conídios (aproximadamente uL de volume 375, ou conídios de 7-8 folhas de pepino infectadas) a partir do filtro sobre uma folha de papel limpa. A partir daqui, transferir conídios em 2 mL criotubos com diâmetro dois 5/32 polegadas pré-arrefecida (em azoto líquido) bolas de moagem aço. voltar imediatamente para tubos de azoto líquido. tubos de armazenar a -80 ° C.
  3. Breaking Open conídios por moagem
    1. Flash congelar placas de alumínio de moinho de esferas em azoto líquido. Carga criotubos em rack de moinho de bolas. Agitar vigorosamente os criotubos com bolas de aço e conídios em moinho de bolas durante 30 s a 30 ciclos / s (à temperatura ambiente). recongelar imediatamente criotubos em azoto líquido.
      NOTA: Inicialmente, acesso a uma amostra de conídios por microscopia uma ampliação de 100X para a eficiência de ruptura da parede celular durante a moagem. Se necessário, para moer um adicional de 1 - 2 ciclos de 30 s durante 30 ciclos / s, but manter o número de rodadas a um mínimo. A avaliação de rotina de quebra de conídios por microscopia nesta fase é desnecessária uma vez que foram estabelecidas condições ideais.

2. Purificao de ADN genómico

  1. conídios de lise
    1. Trabalhar rapidamente para evitar o descongelamento conídios, remover as bolas de aço de criotubos com um ímã. Adicionar 700 uL de 65 ° C, tampão de lise (Tabela 1) e vórtice 5 - 10 s até uma suspensão é formada.
    2. Adicionar 300? L pré-aquecido (65 ° C) 5% (v / v) de sarcosil e inverter cuidadosamente para misturar (uma inversão por 3 s) cinco vezes. Incubar os tubos durante 30 min a 65 ° C; invertido suavemente 3 vezes em 10, 20 e 30 min. Utilizando uma ponta de pipeta de amplo calibre, transferir a solução inteira para novo tubo de microcentrifugação de 2 ml. Em todos os passos subsequentes, misturar por inversão suave, lento e transferir as soluções contendo ADN com pontas de pipeta de grande calibre.
  2. Extração de DNA I
    1. Adicionar um volume de cloroforma: álcool isoamílico (24: 1 v / v) para a soluo de lise e inverter cuidadosamente para misturar cinco vezes. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente, invertendo suavemente para misturar cinco vezes no ponto a meio caminho e novamente no final da incubação. Centrifuga-se a temperatura ambiente durante 15 min a 14.000 x g. Usando ampla-furo ponta de pipeta, transferir cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo de microcentrifugação de 2 ml; evitar a inclusão do material da interface.
  3. DNA Precipitation I
    1. Adicionar um volume de temperatura ambiente a 100% de isopropanol (cerca de 750 mL) e inverter cuidadosamente para misturar seis vezes. Centrifuga-se a temperatura ambiente durante 15 min a 14.000 x g. Remova cuidadosamente o sobrenadante e descartar.
    2. Adicionar 450 mL de pré-refrigerada% de etanol (-20 ° C) 70. Centrifugar durante 5 min à temperatura ambiente a 14000 x g. Remova cuidadosamente o sobrenadante e descartar. Centrifugar a 1.000 xg durante 3 s, remover cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de ponta fina e descartar. Secar o sedimento durante 15 minutos, umatemperatura ambiente t. Não secar por mais de 15 min.
    3. Ressuspender o sedimento em 300 ul de TE (10 mM Tris-Cl, ácido etilenodiaminotetra-acético 1 mM, pH 8,0). Incubar durante a noite a 4 ° C. Agite suavemente para voltar a suspender qualquer material residual que não entrar em solução.
  4. Para eliminar a contaminação de ARN, adicionam-se 10 ul de ARNase A (10 mg / mL). Inverta suavemente para misturar três vezes. Centrifugar a 1.000 xg durante 3 s. Incubar a 37 ° C durante 2 h.
  5. Extracção de DNA II
    1. Adicionar 300 ul de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1 v / v) e inverter cuidadosamente para misturar cinco vezes. Incubar 10 min a temperatura ambiente, invertendo suavemente para misturar cinco vezes a meio caminho e novamente no final da incubação. Centrifugar 15 min a temperatura ambiente a 14000 x g. Utilizando uma ponta de pipeta de amplo calibre, transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL.
  6. ADN Precipitation II
    1. Adicionar 0,01 volume de 3 M de acetato de sódio pH 5,2 (approximately 3 mL), inverter cuidadosamente para misturar cinco vezes. Adicionar 2,5 volumes de pré-arrefecida (-20 ° C) de 100% de etanol (cerca de 750 mL). Inverta suavemente para misturar cinco vezes. Incubar durante a noite a -20 ° C.
    2. Centrifugar 30 min a 4 ° C a 14000 x g. Remova cuidadosamente o sobrenadante e descartar.
    3. Adicionar 450 mL de pré-refrigerada% de etanol (-20 ° C) 70. Centrifugar durante 5 minutos a 4 ° C a 14000 x g. Remova cuidadosamente o sobrenadante e descartar. Centrifugar a 1.000 xg durante 3 s. Remova cuidadosamente o sobrenadante com ponteira fina e descarte.
    4. Secar o sedimento durante 30-60 min à temperatura ambiente. Ressuspender o pellet em 27,5 ul de TE. Incubar durante a noite a 4 ° C. Agite suavemente para voltar a suspender qualquer material residual que não entrar em solução.
    5. Alíquota de 2,5 mL em 22,5 ul de TE (volume final 25 mL) para ensaios de controlo de qualidade (ver abaixo). As amostras de ADN armazenar a 4 ° C até à apresentação para a sequenciação. Para o armazenamento, armazenar amostras a longo prazoa -80 ° C e minimizar a ciclos de congelação-descongelação para evitar distorção.
      NOTA: Tome cuidado ao pipetar nesta etapa como o ADN genómico de elevado peso molecular podem ser difíceis de pipetar adequadamente, e é importante para assegurar que "QC Alíquota" é uma representação precisa da amostra de DNA genómico.

3. Controle de Qualidade

  1. Pureza amostra
    1. Usando um TE em branco, avaliar a pureza da amostra de ADN por carregamento de 1 mL da alíquota QC em um espectrofotômetro de pequeno volume. Registro A260 / A280 e A260 / A230 leituras. ADN puro terá uma razão A260 / A280 de cerca de 1,8 e A260 / A230 razão entre 1,8 e 2,2.
  2. Quantificação do ADN genómico
    1. Realizar a quantificação da alíquota QC usando um kit comercial de cadeia dupla do ADN de ensaio de quantificação de acordo com as instruções do fabricante.
  3. DNA Quality Assessment I
    1. Carga de aproximadamente 60 ng de ADN genómico e umaescada de DNA em um gel de agarose a 0,7% em 1x TAE (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, e EDTA 1 mM, pH 8,0). aparelho de gel executar a 70 V durante 40 - 45 minutos até as bandas de ADN genómico são aproximadamente 2 cm da separação bem e banda na escada é aparente. Estas condições podem necessitar de ser ajustada com base no aparelho de electroforese em gel disponível.
  4. DNA Quality Assessment II
    1. Carga de aproximadamente 60 ng de ADN genómico e uma escada de DNA de peso molecular elevado (adequado para electroforese em gel de campo pulsado) sobre um gel de agarose a 1% em TBE 0,5x (Tris 44,5 mM, ido bico 44,5 mM, EDTA 1 mM, pH 8,3) e executado em tampão de corrida 0,5x TBE usando um 5 - de campo pulsado protocolo de electroforese em gel de 80 kpb da forma de onda durante 16 h.
  5. Avaliação de bactérias, fungos e Contaminantes de plantas
    1. Realizar a reacção em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar os espaçadores internos transcritos (ITS) apropriados regiões dos genes ribossomais, utilizando os iniciadores e as condições de amplificação listaed na Tabela 2. Carga de 10 pL da reacção resultante num gel.
      NOTA: Uma banda que representava o oídio região ITS deve ser amplificado com o fúngica SEUS iniciadores. ADN a partir deste amplicão e qualquer amplic gerado com os iniciadores, ou de plantas bacterianas deve ser sequenciado para determinar a origem da contaminação. Apenas oídio sequências ITS deve ser encontrada no amplicon fúngica.

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Resultados

Um exemplo representativo de 60 ng de ADN genómico purificado de G. cichoracearum passado em gel de agarose, utilizando electroforese em gel e usando electroforese em gel de campo pulsado são mostrados nas Figuras 1 e 2, respectivamente. preparações de ADN genómico que passam, marginalmente passam e falham o controlo de qualidade são representados. preparações de ADN genómico que passam completamente o controlo de qualidade são ...

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Discussão

A fim de se obter alta ADN genómico puro, de peso molecular a partir do obrigatório biotrófica fungos de oídio, uma versão modificada dos métodos anteriormente descritos foi desenvolvido 30. O rendimento médio usando este protocolo optimizado é de 7 g de ADN por 150 mg de conídios, uma duplicação do rendimento obtido com um protocolo anterior. Além disso, o tamanho médio aumentou de cerca de 20 kpb a mais de 48,5 kpb. Este protocolo foi optimizado no sistema cichoracearum G. cucumber-. A...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este protocolo foi desenvolvido em apoio a um Projeto Conjunto de Sequenciamento Comunitário do Instituto do Genoma (# 1657). O trabalho foi apoiado em parte pela Philomathia Foundation, pela National Science Foundation (# 0929226) e pelo Energy Biosciences Institute para S. Somerville; e pela Fundação Nacional de Ciência da Suíça (# 310030_163260) para B. Keller. Gostaríamos de agradecer aos nossos colegas, M. Figureroa e M. Miller (Universidade de Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (Universidade de Copenhague), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (Universidade da Califórnia Berkeley), M. Wildermuth (Universidade da Califórnia Berkeley), R. Wise (Universidade Estadual de Iowa) e S. Xiao (Universidade de Maryland) por seus generosos conselhos e por oferecerem seus protocolos enquanto desenvolvíamos o protocolo descrito aqui.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
MM400 Moinho de BolasRetsch20.745.0001Ou equivalente moinho de bolas
mL tubos para moagem de bolasSarstedt 72.694.007
Esferas de fresagem de aço inoxidável de 5/32"OPS DiagnosticsGBSS 165-5000-01
Banho-maria controlado por microprocessador da série 280 Predefinido para 65 &graus; C Thermo Fisher Scientific2825Ou banho-maria equivalente
Microprocessador controlado Série 280 Banho-maria Predefinido para 37 ° CThermo Fisher Scientific2825Ou banho-maria equivalente
Eppendorf 5417R microcentrífuga refrigeradaKrakeler Scientific 38-022621807Ou microcentrífuga equivalente
Chlorform:IAA (24:1 v/v)Sigma-Aldrich C0549Perigoso em caso de contacto com a pele ou inalação. Use luvas de nitrilo, óculos de proteção, jaleco e trabalhe com capuz químico
Fenol:Clorofórmio:IAA
(25:24:1 v/v)		Thermo Fisher Scientific15593031Perigoso em caso de contato com a pele ou inalação. Use luvas de nitrilo, óculos de proteção, jaleco e trabalhe com capuz químico
100% IsopropanolSigma-Aldrich 
100% EtanolSigma-Aldrich 34923Frio a -20 &graus; C uso prévio
Acetato de SódioSigma-Aldrich S2889
Rnase, sem Dnase (10 mg/mL)Thermo Fisher ScientificEN0531
Metabissulfito de potássioSigma-Aldrich P2522
Lauril Sacroinato de SódioSigma-Aldrich L9150
Base TrisSigma-Aldrich 
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Sigma-Aldrich EDS
Cloreto de sódio (NaCl)Sigma-Aldrich S9888
Brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB)Sigma-Aldrich H6269
Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, UvextremeStaples423263Ou óculos equivalentes
Luvas de nitrilo High Five COBALT, GRANDENeta ScientificHFG-N193Ou luvas equivalentes
GelRed Ácido Nucleico Gel Stain 10.000x em águaBiotium41003
Brometo de Etídio 10 mg/mLBiotium40042Perigoso em caso de contato com a pele. Use luvas de nitrilo e óculos de proteção
Agarose Ultrapure BioreagentVWR International LLCJT4063
GeneRuler 1 kb Plus DNA LadderThermo Fisher ScientificFERSM1332
8 - 48 kb CHEF Padrões de tamanho de DNABio-Rad170-3707
Pippin PrepLife Technologies Corporation4472172Ou aparatus de gel de campo de pulso equivalente
Papel de filtro qualitativo Whatman, Grau 1Sigma-Aldrich WHA1001042Ou câmara de crescimento equivalente
Câmara de Crescimento PercivalPercivalAR66LXC9
NanoDrop 8000 UV-Vis EspectrofotômetroThermo Fisher ScientificND-8000-GLOu espectrofotômetro equivalente
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher ScientificP11496
TAE Buffer (Tris-acetato-EDTA) (50x)Thermo Fisher ScientificB49Dilua 1/50 com água antes de usar (até 1x)
TE BufferThermo Fisher Scientific12090015 
Tris-borato-EDTA, solução 10x (eletroforese)Thermo Fisher ScientificBP13334Diluir 1/10 com água antes de usar (até 1x)
Nitrogênio líquidoNitrogênio líquido (-196 ° C) é um risco de congelamento. Ele também se expandirá rapidamente após o aquecimento e não deve ser mantido em um recipiente bem fechado
2 W29290710708976001

Referências

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