Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Resumo

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Resumo

Entendimento tráfico de membrana proteína, reunião e expressão requer uma abordagem que diferencia entre aqueles que residem em organelas intracelulares e as localizadas na membrana plasmática. medidas tradicionais baseados em fluorescência não têm a capacidade de distinguir as proteínas da membrana que residem em diferentes organelos. metodologias de ponta transcender os métodos tradicionais por acoplamento fluoróforos sensíveis ao pH com microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM). TIRF iluminação excita a amostra até cerca de 150 nm a partir da interface de amostra de vidro, diminuindo, assim, o fundo, aumentando a relação sinal-ruído, e aumentando resolução. O volume de excitação em TIRFM abrange a membrana plasmática e organelas nas proximidades, tal como o ER periférica. Superecliptic pHluorin (SEP) é uma versão sensível ao pH da GFP. Geneticamente que codifica setembro para o domínio extracelular de uma proteína de membrana de interesse posiciona o fluoróforo sobreo lado luminal do RE e na região extracelular da célula. Setembro é fluorescente quando o pH é maior do que 6, mas permanece num estado desligado a valores de pH mais baixos. Portanto, os receptores marcados com fluorescência quando setembro residente no retículo endoplasmático (ER) ou após a inserção na membrana do plasma (PM), mas não quando confinado a uma vesícula de tráfico ou outros organelos tais como Golgi. O pH extracelular pode ser ajustado para ditar a fluorescência de receptores na membrana plasmática. A diferença na fluorescência entre as imagens TIRF a pH extracelular neutros e ácidos para a mesma célula corresponde a um número relativo de receptores na membrana plasmática. Isto permite a medição simultânea de receptores residentes intracelulares e de membrana de plasma. eventos de inserção de vesículas standard também pode ser medida quando o pH extracelular é neutra, correspondendo a uma vesícula de baixo pH o tráfico de fusão com a membrana plasmática e a transição para um estado fluorescente. este versatile técnica pode ser explorada para estudar a localização, a expressão, e o tráfico de proteínas de membrana.

Introdução

As alterações na expressão do receptor, distribuição e montagem ter sido ligado a uma grande variedade de doenças, incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, fibrose cística, e dependência de drogas ^{1, 2, 3, 4, 5.} Por exemplo, a nicotina e outros ligandos nicotínicos influenciar o tráfico de receptores de acetilcolina nicotínicos (nAChR) que conduzem a mudanças no tráfico, expressão, e regulação positiva ^{1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10.} A nicotina aumenta o número total de nAChRs montados dentro de uma célula, aumenta tráfico para a membrana plasmática, umad altera a montagem de subunidades para favorecer uma versão de alta sensibilidade de alguns subtipos. Resolvendo alterações distintas no tráfico, montagem e expressão de receptores em um modelo de doença fornece detalhes mecanicistas cruciais que são essenciais para definir alvos de drogas. Uma abordagem ideal seria rapidamente diferenciar entre receptores intracelulares e as localizadas na membrana plasmática. Isto é particularmente difícil nos casos em que uma maior parte de uma proteína particular reside intracelularmente, tais como com os nAChRs. Uma vez que a maioria dos nAChRs são localizados no retículo endoplasmático, as medidas tradicionais não têm a resolução espaço-temporal necessário para identificar alterações de localização e de tráfico ao longo da via secretora. Tráfico receptor e estudos de expressão de nAChRs foram essencialmente realizados utilizando radioligandos de ligação ^{11, 12} Os ensaios de biotinilação, Western blotting ^13, ou imunoprecipitação Techniq ues ^12. Estes dependem da especificidade de ligação de uma molécula repórter ou a fixação das células e não têm a capacidade de distinguir entre simultaneamente membrana plasmática residente e receptores intracelulares. Portanto, estudos de montagem canal iônico e vesículas dinâmica em grande parte contou com baixo rendimento técnicas eletrofisiológicas ^14.

resolução espacial e temporal superior é possível com os avanços na microscopia de fluorescência. Moléculas repórter codificados geneticamente, tais como a proteína fluorescente verde (GFP) e suas variantes, eliminar os problemas de ligação não específicos e aumentar a sensibilidade ^15. Uma variante sensível ao pH da GFP, conhecido como pHluorin superecliptic (SEP), pode ser utilizada para explorar as diferenças inerentes entre os compartimentos de pH dentro de uma célula para determinar a localização ^{5, 7, 8,}Ref "> ^{9, 16, 17, 18.} setembro fluoresce quando o pH é maior do que 6, mas permanece num estado desligado, a pH baixo. Assim, os receptores marcados com setembro do seu lado luminal são detectados quando presente no retículo endoplasmático ( ER) ou após a inserção na membrana do plasma (PM), mas não quando confinado a uma vesícula de tráfico. a manipulação do pH extracelular em contacto com receptores na membrana plasmática, por conseguinte, altera a fluorescência e, portanto, a detecção destes receptores. Se a mesma célula é fotografada sequencialmente a ambos um pH extracelular neutra e, em seguida, um pH inferior a 6, a diferença entre as imagens é atribuída a receptores localizados na membrana plasmática. Isto permite a medição simultânea de intracelular (ER periférica) e receptores de membrana residentes de plasma ^{5, 7, 8} p>, ^9. eventos de inserção de vesículas standard também pode ser resolvido quando o pH extracelular é neutro. Uma vez que um baixo pH tráfico de vesículas funde com a membrana plasmática, o lado luminal da vesícula é exposto à solução extracelular neutro, fazendo com que uma transição detectado como uma explosão de fluorescência ^{7, 18, 19, 20.} Setembro permite a medição dos receptores localizados na membrana plasmática e do retículo endoplasmático periférica, e proporciona um meio para medir o tráfico de receptores entre estas regiões subcelulares ^{5, 7, 18.}

Para alcançar maior resolução na membrana plasmática, um receptor com a SEP geneticamente codificado é fotografada por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM). Este método é particularmenteútil se a maioria dos receptores são localizada em regiões intracelulares, uma vez que TIRFM aumenta a visibilidade da membrana do plasma. TIRFM também permite a resolução da dinâmica do tráfico de vesículas simples que transportem receptores SEP-marcados mediante inserção no PM. A reflexão interna total ocorre na interface entre materiais com diferentes índices de refracção, tal como entre uma célula e uma lamela de vidro ^{21, 22.} Setembro fluoresce quando irradiado com 488 nm de excitação, que é orientada para alcançar reflexão interna total na interface da solução de vidro e de células. Isto produz uma onda evanescente que penetra cerca de 150 nm para a amostra, apenas fluoróforos excitantes no interior deste volume. Apenas setembro contendo receptores num ambiente de pH neutro dentro desta gama de excitação são detectados, correspondentes àqueles que residem na membrana plasmática ou retículo endoplasmático periférica. Uma vez que a detecção é limitado tO excitação por onda evanescente, a fluorescência de fundo da região intracelular é reduzida e a relação sinal-ruído é aumentada ^{21, 22.} Além disso, uma vez que a radiação não penetra na massa da célula, fotodano é minimizado o que permite imagens de células vivas ao longo do tempo. Como resultado, acoplado com TIRFM geneticamente codificado setembro fornece a alta resolução e sensibilidade requerida para medir a localização subcelular e tráfico dinâmica de receptores da membrana ao longo da via secretora.

Protocolo

1. Cultura de Células e Transfecção

1. Manter as células do rato neuroblastoma 2a (N2a) em meio de crescimento.
   1. Adicione 500 ml N2a meio de crescimento a partir de 200 ml de meio de Eagle da Dulbecco (DMEM) com elevado teor de glucose, 250 ml de meio de soro reduzido, 50 ml de soro fetal de bovino (FBS), e 5 mL de penicilina / estreptomicina (100x).
   2. Manter as células num frasco de T75 a 37 ° C numa incubadora de _CO2 a 5%.
   3. células divididas 1:15, quando necessário, ou em cerca de 80-90% de confluência. Isto é tipicamente 2-3 vezes por semana.
2. Brasão 35 milímetros prato de vidro de fundo com poli-D-lisina.
   1. Em uma cabine de segurança biológica de fluxo laminar, adicionar 200 ul de 0,1 ug / ml de poli-D-lisina sobre vidro região inferior do prato estéril de 35 mm.
   2. Coloque um prato em 37 ° C incubadora durante 1 h.
   3. Cuidadosamente lavar prato com _ddH2O 3-4 vezes.
   4. Permitir pratos para secar completamente durante mais de 1 h.
   5. Sterilize pratos com luz UV na cabine de segurança biológica, se necessário.
3. Placa célula N2A para imagens TIRFM.
   1. Remover o meio de crescimento a partir de células aderentes.
   2. Separe as células a partir do balão por incubação com 1 ml de 1x tripsina (+ EDTA) durante 5 min a 37 ° C numa incubadora de _CO2 a 5%.
   3. Inactivar a tripsina por adição de 9 ml de meio de crescimento. Misture meios, tripsina e as células descoladas utilizando uma pipeta.
   4. Visualmente contagem de células usando um hemocitômetro e calcular o volume correto para adicionar 90.000 células a cada vidro revestido prato inferior poli-D lisina. Esta densidade é necessário para a transfecção eficiente e imagiologia TIRF célula única.
   5. Adicione 2 ml meio de crescimento a cada prato com fundo de vidro contendo 90.000 células.
   6. Incubar a placa a 37 ° C numa incubadora de _CO2 a 5% durante 16-24 horas.
4. N2a transfecção
   1. Obter uma construção de plasmídeo contendo um fluoróforo setembro incorporadapara a região extracelular da proteína de interesse. Técnicas de clonagem convencionais, tais como amplificação por PCR ⁵ pode ser usado para gerar a construção.
      NOTA: setembro deve ser incorporado na região extracelular da proteína de membrana de modo a que reside no interior do lúmen do retículo endoplasmático ou tráfico de vesículas e é exposto à solução extracelular, quando na membrana plasmática. Setembro é semelhante em tamanho a GFP e estratégias de clonagem semelhantes pode ser utilizado.
   2. Substituir o meio de crescimento em células plaqueadas com 1,5 ml de meio de soro reduzido (por exemplo, Opti-MEM), aproximadamente 30 minutos antes da adição do reagente de transfecção.
      NOTA: Para estudar mudanças induzidas droga em receptores, uma concentração adequada da droga pode ser adicionado no momento da transfecção.
   3. Adicionar 500 ng de cada plasmídeo desejado construir a 250 ul de meio de soro reduzido (tubo 1).
   4. Adicionar 2 mL de reagente de transfecção para um tubo separado containing 250 ul de meio de soro reduzido. Incubar tubo 2 à temperatura ambiente durante 5 min. A proporção de reagente de transfecção de plasmídeo de ADN devem ser optimizados para expressar cada proteína de interesse.
   5. Combine tubos 1 e 2 para fazer uma solução contendo 500 mL de reagente de transfecção e mix de plasmídeo. Incubar à temperatura ambiente durante 25 min.
   6. Adicionar 500 ul da mistura de transfecção para células pré-revestida para um volume total de 2 ml por placa.
   7. Incubar as células a 37 ° C numa incubadora de _CO2 a 5% durante 24 h.
   8. Após 24 horas, retire a mistura de transfecção e lavar as células com meio de crescimento e, em seguida, adicionar 2 ml de meio de crescimento para cada prato.
      NOTA: Se uma droga foi adicionada no momento da transfecção, que pode ser reposta novamente neste passo.
   9. Incubar as células a 37 ° C numa incubadora de _CO2 a 5% durante 24 h.
   10. células de imagem 48 h após a transfecção.

2. Imagens de células vivas pela Total EmReflexão terna microscopia de fluorescência (TIRFM)

1. Imagiologia configurado
   1. Realizar imagem com um microscópio de fluorescência invertido set-up com uma plataforma de varrimento como se mostra na Figura 1. Isto requer o alinhamento de uma fonte de laser de DPSS 488 nm, um motor passo a passo para ajustar a posição do feixe de 488 nm e uma abertura numérica elevada (1.49 NA) ou 60X 100X objectiva de imersão em óleo.
   2. Passar o feixe de laser através do filtro de excitação apropriada (488/10 nm passa-banda). Alinhar o feixe de laser polarizada por meio de uma fibra de modo único ligado a um lançador montado um motor de passo. No modo de epifluorescência, o feixe de excitação é centrado no meio da abertura traseira do objectivo.
   3. Para atingir TIRF, utilizar o motor de passo para converter o feixe de laser focado através da abertura da parte de trás da lente objectiva até que o ângulo crítico é atingido e o feixe não é transmitida através da amostra e em vez disso é totalmente reflectida do vidro-cell interface.
   4. Capturar imagens usando um EMCCD (512 x 512 pixels) controlada com software de imagem (por exemplo, Metamorph) com o filtro de emissão apropriado montado na via emissão (525/50 nm).
2. Preparar a solução de imagem
   1. Preparar 200 ml solução extracelular (ECS) por mistura de NaCl 150 mM, KCl a 4 mM, 2 mM de _MgCl2, 2 mM de _CaCl2, 10 mM de HEPES e 10 mM de glucose em ddH ₂ O. As soluções stock de NaCl, KCl, _MgCl2, e _CaCl2 pode ser preparado antecipadamente e combinado com HEPES fresco e de glucose no dia da imagiologia.
   2. Ajustar o pH de uma solução contendo 100 ml de ECS para pH 7,4. Ajustar os restantes 100 ml de ECS para um pH de 5,4. Lavar as células transfectadas com 2 ml de ECS (pH 7,4).
   3. Adicionar 2 ml de ECS (pH 7,4) para as células transfectadas antes de imagem.
3. Imagens de células vivas em TIRF
   1. Ligue todo o sistema, incluindg 488 a laser nm, câmera, fase de tradução e programa de imagem. Focar o feixe de epifluorescência e ajustar a potência para aproximadamente 1 mW ao objetivo 60X.
   2. Adicione o óleo para o objectivo e coloque uma placa de células transfectadas na fase de tradução. Fixar o prato no lugar utilizando montagens de palco para garantir que ele não se move em relação à fase de modo que as células podem ser trabalhada várias vezes.
   3. No modo de epifluorescência, focar o microscópio e localizar as células fluorescentes, transfectadas. Células continuará focada em vários planos focais. Localize células individuais, isolados para prosseguir com TIRF.
   4. No programa de imagem, definir o tempo de exposição a 200 ms e otimizar a intensidade de fluorescência, definindo o ganho de EM.
   5. Transição do feixe de laser em TIRF ao traduzir o feixe através do objectivo de uma forma passo a passo utilizando o motor passo a passo. Como as abordagens ângulo crítico, visivelmente o feixe vai traduzir em toda a borda do prato até que converge no the ponto de reflexão interna total sobre o plano da amostra.
   6. Verifique se as células estão em modo de TIRF, ajustando o botão de foco. Em TIRF, apenas um plano de células pode ser focado (isto é, aproximadamente a 150 nm, a partir da interface de vidro), a produção de uma imagem bem definida com alta resolução da membrana plasmática.
4. Imagiologia setembro para determinar a localização subcelular
   1. Localize as células saudáveis, transfectadas, único no plano de imagem.
   2. Adquirir uma imagem focalizada de celular em pH 7,4. Setembro marcado receptores na membrana plasmática e do retículo endoplasmático deve ser visível.
   3. bloquear rapidamente o feixe de laser de atingir a amostra para evitar a fotodegradação.
   4. Memorizar as posições de palco correspondentes a cada célula usando software de imagem de microscópio capaz de gravar vários locais XY.
   5. Repetir passos 20-30 2.4.1-2.4.4 para células por prato, enquanto utilizando o software para gravar a posição de cada célula.
   6. AfTer todas as imagens de células a pH 7,4 são recolhidos, remover manualmente a solução de pH 7,4 ECS utilizando uma pipeta. Não toque o prato, pois isso pode mover as posições de palco memorizadas.
   7. Adiciona-se cuidadosamente 2 ml de pH 5,4 ECS para o prato e esperar 10 min. Durante este tempo, salvar imagens adquiridas anteriormente.
   8. Sob um conjunto idêntico de condições utilizadas para recolher imagens a pH 7,4, mover o palco para cada posição guardada e adquirir uma imagem da mesma célula a um pH de 5,4. As células devem olhar menos definida uma vez que todos fluorescência detectada é proveniente de retículo endoplasmático confinados setembro marcado receptores. Salve as imagens de células pH 5.4.
5. Eventos de inserção vesícula individuais de imagem em células vivas
   1. Substituir o meio de crescimento de células transfectadas com 2 ml pH 7,4 a ECS, ou com meio L-15 de Leibovitz. O pH dos meios de L-15 de Leibovitz é CO ₂ independente, permitindo que a imagem ter lugar ao longo de um longo período de tempo, se necessário.
   2. PlacPT A placa de células transfectadas no palco de microscópio. Seguros e focar uma única célula na TIRF seguinte Passo 2.3 acima.
   3. Se equipado, ajustar o foco automático para que o foco não deriva ao longo do período de geração de imagens.
   4. Gravar uma série de 1.000 quadros, capturando continuamente imagens em um frame rate de 200 ms. Rajadas de fluorescência será visível durante este tempo, correspondendo a vesículas de baixo pH de tráfico de fusão com a membrana plasmática, expondo o SEP para o pH extracelular 7,4.
   5. Localizar outro única célula e repita o passo acima. Repor a focagem automática, se necessário.

Análise 3. Imagem e Processamento de Dados

1. Analisando setembro de fluorescência para determinar a localização subcelular
   1. Abra as imagens de células usando um software de análise de imagem, tais como Metamorph ou ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Subtrair o fundo de ambos os pH 5,4 e pH 7,4 imagens usando a configuração de bola rolando.
   2. Usar um limiar baseado intensidade de fluorescência de quantificar a partir de uma única célula. selecionar manualmente uma região de interesse em torno da célula na imagem do pH 7,4.
   3. Medir a área da célula, intensidade média, e densidade integrada usando um plugin no ImageJ ou usando o construído em função de "Medida" sob a guia Analisar.
   4. Repetir passos 3.1.1-3.1.3 para a mesma célula, a pH 5,4, ajustando cuidadosamente o limiar de intensidade e baseadas região de interesse da mesma maneira.
   5. Depois de a densidade integrada é obtido para as imagens das células, tanto a pH 7,4 e 5,4, calcular a membrana plasmática densidade integrada subtraindo-se o valor de pH de 5,4 a 7,4 do valor do pH. A diferença corresponde aos receptores número relativo sobre a membrana de plasma no interior da região de excitação TIRF.
   6. Como uma medida de tráfico, calcular a percentagem relativa de setembro marcado receptores localizados na membrana do plasma em comparação com os restantes receptores visíveis nas excitati TIRFem volume de dividindo a membrana plasmática densidade integrada por a densidade total integrada a pH 7,4, multiplicado por 100.
2. Analisando os eventos de inserção única vesícula
   1. Abrir a série de 1.000 imagens TIFF usando o software de análise de imagem. Subtrair o fundo de todos os quadros usando a configuração de bola rolando.
   2. Ajustar o equilíbrio de cores da gravação para maximizar regiões intensas correspondentes a vesícula eventos de inserção. contar manualmente as rajadas de fluorescência com duração superior a 3 quadros (> 600 ms).

Resultados

Setembro incorporação num receptor permite a detecção directa de que o receptor de uma célula viva. Juntamente com TIRFM, isto permite a avaliação dos níveis de expressão relativa na membrana do plasma e a distribuição de receptores dentro dos locais subcelulares na região de excitação TIRF. eventos individuais tráfego de vesículas pode também ser resolvido.

Níveis de expressão relativa de receptores SEP-marcados no Plasma Membra...

Discussão

A sensibilidade de setembro pH permite receptores que residem na membrana plasmática de ser distinguido de receptores intracelulares no retículo endoplasmático, e pode ser usado para resolver eventos de inserção de vesículas ^{5, 7, 8, 9, 18, 19, 20} receptor de transporte . Várias técnicas, i...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagent/Material
Cell Culture Frascos com tampa de filtro, estéreis, Greiner Bio One, 75 cm2	VWR	82050-856
Placas de Petri com fundo de vidro de 35 mm, estéril	Cell E& G	GBD00002-200
Poly-D-lysine	vwr	215017510
Dulbecco Modified Eagle Medium‎ (DMEM), Alta Glicose	Fisher Scientific	11-965-084
Opti-MEM I Soro Reduzido	Médio Gibco / Fisher Scientific	31-985-088
Soro Fetal Bovino, Certificado, Origem nos EUA, Padrão (Filtrado Estéril)	Gibco / Fisher Scientific	16-000-044
Enzima TrypLE Express (1x), sem vermelho de fenol	Fisher Scientific	12604-021
	VWR	45000-652
Meio L-15 de Leibovitz, sem vermelho de fenol	Gibco / Fisher Scientific	21083027
Lipofectamina	Fisher Scientific	11668030	Misture delicadamente; Não vórtice
Cloreto de sódio	Fisher Scientific	BP358-1
Cloreto de potássio	Fisher Scientific	P217-10
Cloreto de magnésio	Fisher Scientific	BP214-500
Cloreto de cálcio	Fisher Scientific	C79-500
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Objective	Olympus	Tipo F
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Equipamento
Microscópio	Câmera Olympus	IX81
	Andor	iXon Ultra 897
60X, 1,49 NA objetiva de imersão em óleo	Olympus	APON 60XOTIRF
Estágio motorizado	Atuador motorizado IXPROXY
(motor de passo)	Thorlabs	ZST213
MetaMorph (ou outro programa de imagem)	Laser Metamorfo
488 nm	Tecnologia de mercado
Fibra	monomodoThorlabs	SM450
Espelhos	Thorlabs	BB1-E01
Dicróico 488 nm LP	Semrock	Di02-R488-25x36
Filtro passa-banda, 488 nm	Semrock	LL01-488-12.5
Filtro passa-banda, 525/50	Semrock	FF03-525/50-25