Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Ashley M. Fox-Loe; Brandon J. Henderson; Christopher I. Richards

doi:10.3791/55466

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Artigo de método

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

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DOI:

10.3791/55466

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16 de março de 2017

Ashley M. Fox-Loe¹ , Brandon J. Henderson² , Christopher I. Richards¹

¹Department of Chemistry, University of Kentucky, ²Department of Biomedical Sciences, Marshall University

Neste artigo

Resumo

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Resumo

Entendimento tráfico de membrana proteína, reunião e expressão requer uma abordagem que diferencia entre aqueles que residem em organelas intracelulares e as localizadas na membrana plasmática. medidas tradicionais baseados em fluorescência não têm a capacidade de distinguir as proteínas da membrana que residem em diferentes organelos. metodologias de ponta transcender os métodos tradicionais por acoplamento fluoróforos sensíveis ao pH com microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM). TIRF iluminação excita a amostra até cerca de 150 nm a partir da interface de amostra de vidro, diminuindo, assim, o fundo, aumentando a relação sinal-ruído, e aumentando resolução. O volume de excitação em TIRFM abrange a membrana plasmática e organelas nas proximidades, tal como o ER periférica. Superecliptic pHluorin (SEP) é uma versão sensível ao pH da GFP. Geneticamente que codifica setembro para o domínio extracelular de uma proteína de membrana de interesse posiciona o fluoróforo sobreo lado luminal do RE e na região extracelular da célula. Setembro é fluorescente quando o pH é maior do que 6, mas permanece num estado desligado a valores de pH mais baixos. Portanto, os receptores marcados com fluorescência quando setembro residente no retículo endoplasmático (ER) ou após a inserção na membrana do plasma (PM), mas não quando confinado a uma vesícula de tráfico ou outros organelos tais como Golgi. O pH extracelular pode ser ajustado para ditar a fluorescência de receptores na membrana plasmática. A diferença na fluorescência entre as imagens TIRF a pH extracelular neutros e ácidos para a mesma célula corresponde a um número relativo de receptores na membrana plasmática. Isto permite a medição simultânea de receptores residentes intracelulares e de membrana de plasma. eventos de inserção de vesículas standard também pode ser medida quando o pH extracelular é neutra, correspondendo a uma vesícula de baixo pH o tráfico de fusão com a membrana plasmática e a transição para um estado fluorescente. este versatile técnica pode ser explorada para estudar a localização, a expressão, e o tráfico de proteínas de membrana.

Introdução

As alterações na expressão do receptor, distribuição e montagem ter sido ligado a uma grande variedade de doenças, incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, fibrose cística, e dependência de drogas ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^5. Por exemplo, a nicotina e outros ligandos nicotínicos influenciar o tráfico de receptores de acetilcolina nicotínicos (nAChR) que conduzem a mudanças no tráfico, expressão, e regulação positiva ^{^1,} ^{^2,}