Summary
Un enfoque inmunohistoquímico de montaje completo, para visualizar la expresión de la proteína neurofilamento en el tracto biliar extrahepático en Suncus murinus. Se presenta aquí. Este protocolo se puede utilizar para analizar la inervación de todos los órganos viscerales en S. murinus u otras especies.
Abstract
Este trabajo describe el método de tinción inmunohistoquímica de montaje completo en detalle, usando anticuerpos de proteína de neurofilamento para marcar la inervación del tracto biliar en Suncus murinus ( S. murinus ). En primer lugar, se disecó el espécimen de S. murinus y se fijó en paraformaldehído al 4% (PFA). En segundo lugar, se realizó un tratamiento enzimático y la inactivación potencial de la peroxidasa endógena. La muestra se expuso entonces al anticuerpo primario, anticuerpo de proteína anti-neurofilamento, durante 3-6 días. A continuación se incubó con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante. La reacción de color se reveló haciendo reaccionar la muestra con un sustrato de 3,3'-diaminobencidina (DAB). Este método se puede aplicar para analizar la inervación de todos los órganos viscerales. Además, este protocolo también puede adaptarse para probar otros anticuerpos neuronales, pero la optimización de los anticuerposDebe hacerse primero. Este método fue introducido originalmente por Kuratani y Tanaka 1 , 2 , 3 .
Introduction
La musaraña almizcle, Suncus murinus , pertenece a la orden Insectivora y la familia Soricidae. Este diminuto mamífero se distribuye por todo el sudeste asiático y habita en casas y zonas de césped situadas cerca de viviendas humanas o corrales de ganado 4 . Esta especie presenta características morfológicas generales más similares a las humanas que otros animales de laboratorio, como el ratón, la rata y el conejo 5 . Anteriormente, se utilizó inmunotinción de montaje completo con un marcador de neurona periférica para la proteína del neurofilamento de S. murinus (NFP) para marcar los nervios periféricos en el páncreas 6 , la papila duodenal principal 7 , el píloro 8 , la vesícula biliar 5 y el tracto biliar extrahepático 9 .
NFP es un complejo macromolecular que forma parte del citoesqueleto neuronal maduro. Proteína relacionada con los neurofilamentosS median las interacciones entre NFP y el zygosome. Tanto la función enzimática como la estructura de las proteínas de unión están reguladas por el NFP 10 . El complejo NFP está compuesto por tres polipéptidos: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) y NF-H (200 kDa). NFP se puede encontrar en axones neuronales en el sistema nervioso central y periférico. Se ha demostrado que el anticuerpo anti-NFP humano marca los axones del sistema nervioso central y periférico. Las investigaciones anatómicas y electrofisiológicas han demostrado que el esfínter, la vesícula biliar y el tracto gastrointestinal proximal están conectados 11 , 12 , 13 , 14 . Sin embargo, las características morfológicas de sus conexiones neuronales aún no se han definido.
Este trabajo demuestra el uso de un método de tinción inmunohistoquímica de montaje completo para etiquetar la inervación de S. murinus bilCon un anticuerpo NFP.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Metropolitana de Tokio (IACUC). Los animales fueron alojados y manejados de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Utilizamos animales criados y mantenidos en el Laboratorio de Morfología Funcional, Departamento de Ciencias de la Salud Fronteriza, Universidad Metropolitana de Tokio, Japón.
1. Cuidado de Animales y Vivienda
- Obtener 7 S. murinus (3 hembras y 4 machos pesando 70-90 g) de una colonia de cría cerrada.
- Cage el S. murinus individualmente después del destete (20 d después del nacimiento) en jaulas de plástico equipadas con un nido de madera que contiene tiras de papel. Manténgalos en una sala de animales acondicionado convencionalmente: 23-27 ° C, sin control de humedad, y un ciclo de 12:12 h light: dark. Suministro comercialPellets de trucha y agua ad libitum.
2. Preparación del tejido
- Para preparar paraformaldehído al 4% (p / v) (PFA), disolver 40 g de PFA en 1.000 ml de solución salina tamponada con fosfato 0,01 M (PBS, pH 7,4). En una campana de humos, mezclar con un vórtice hasta que la solución esté despejada. Guarde el 4% PFA O / N a 4 ° C.
Precaución: Use equipo protector personal (PPE) apropiado cuando maneje PFA. - Para perfundir y fijar el animal, anestesiarlo con éter y luego darle una inyección intraperitoneal de somnopentilo (pentobarbital sódico, 0,6 ml / kg de peso corporal).
- Después de que el animal esté completamente narcotizado, abra la cavidad abdominal con un bisturí, creando una incisión abdominal de línea media de 3 cm de largo. Mientras incisión de la vena cava inferior para exsanguinating, insertar un catéter retrogradely en la aorta abdominal en el nivel inmediatamente por encima de la bifurcación de esta arteria en las arterias ilíacas comunes.
- Inyectar somnopentilo (pentobarbitalDium, 1,0 ml / kg de peso corporal). Después de la eutanasia completa, perfundir con PBS 0,01 M (pH 7,4) y luego con PFA al 4% en una chimenea.
- Después de la perfusión, inyectar 2-3 ml de látex de neopreno blanco (látex de neopreno blanco diluido 3: 2 con agua destilada (DW)) para etiquetar los vasos sanguíneos.
- Extraer los órganos abdominales, incluyendo el hígado, vesícula biliar, conducto biliar común, duodeno y páncreas en bloque, con los nervios y vasos relacionados.
- Inyecte aproximadamente 0,1 ml de látex de neopreno azul (agregue una gota de tinta azul a 10 ml del látex de neopreno blanco diluido) a la vesícula biliar para etiquetar el sistema biliar.
- Post-fijación durante toda la noche con 4% de PFA a 4 ° C para inmunotinción de montaje completo.
Precaución: La PFA es tóxica. Evite manipular PFA directamente. La PFA debe utilizarse en una chimenea.
3. Inmunohistoquímica de montaje completo
Nota: A lo largo del protocolo, incluyendo durante el lavado, incubación de anticuerpos y coloración,La muestra debe permanecer en el nutator, moviéndose suavemente a RT oa 4 ° C.
- Día 1: Tratamiento enzimático e inactivación de la peroxidasa endógena potencial
- Lavar el espécimen preparado con DW 4x durante 1 h cada uno a RT en un vial de vidrio de tamaño apropiado. Balancee el espécimen suavemente en el nutator para quitar el PFA. Evite dañar la muestra al intercambiar soluciones.
- Para preparar ácido ortoperiódico al 1% (p / v), disolver 1 g de ácido ortopiódico en 100 ml de DW.
- Incubar la muestra en ácido oroperiodico al 1% durante 20 min a TA para prevenir cualquier reacción intrínseca a la peroxidasa.
- Preparar 0,004% (p / v) de papaína disolviendo 0,004 g de papaína en 100 ml de tampón Tris-HCl 0,025 mol / L (pH 7,6).
- Lavar la muestra con DW durante 10 minutos a TA.
- Incubar la muestra en papaína recién preparada al 0,004% durante 2 ha 37 ° C en un baño a temperatura constante con balanceo suave.
- Lave la muestra con DW durante 50-60 minutos a TA.
- Guarde la muestra en 4% de PFA a 4 ° CO / N.
- Día 2: Tratamiento enzimático
- Lave el espécimen almacenado con DW 4 veces durante 1 h cada vez a RT.
- Incubar la muestra en papaína recién preparada al 0,004% durante 2 ha 37 ° C en un baño a temperatura constante con balanceo suave.
- Lave la muestra con DW durante 50-60 minutos a RT. Guarde la muestra en 4% de PFA a 4 ° CO / N.
- Día 3: Tratamiento de congelación
- Lave el espécimen almacenado con DW 4x durante 1 h cada uno a RT, como se indica arriba.
- Preparar una sacarosa al 2,5% (p / v), al 5% (p / v) y al 10% (p / v) disolviendo 2,5 g, 5 gy 10 g de sacarosa respectivamente en 100 ml de PBS 0,01 M PH 7,4).
- Sumergir el espécimen en sacarosa al 2,5% (p / v), 5% (p / v) y 10% (p / v) durante 30 minutos cada uno.
- Congelar la muestra a -20 ° C durante 30 - 60 min y luego descongelar completamente a RT; Repetir el ciclo 3x.
- Parte superiorRepare 2% de Triton X-100 (v / v), agregue 2 mL de Triton X-100 a 100 mL de PBS 0,01 M (pH 7,4).
- Guarde la muestra en Triton X-100 al 2% a 4 ° CO / N.
- Día 4: Incubación de anticuerpos primarios
- Preparar la disolución de dilución del anticuerpo primario disolviendo 0,2 g de albúmina de suero bovino (BSA), 0,3 ml de Triton X-100 y 0,1 g de azida de sodio en 100 ml de PBS 0,01 M (pH 7,4).
Precaución: La azida sódica es extremadamente tóxica. Se debe evitar la inhalación y el contacto. Use el EPP apropiado. - Diluir el anticuerpo primario (NFP) 1: 600 en el tampón de dilución anterior (etapa 3.4.1). Incubar la muestra con anticuerpo NFP a 4 ° C durante 3-6 días, manteniendo la muestra suavemente balanceando en el nutator. Los especímenes más grandes requerirán tiempos de incubación aumentados.
- Preparar la disolución de dilución del anticuerpo primario disolviendo 0,2 g de albúmina de suero bovino (BSA), 0,3 ml de Triton X-100 y 0,1 g de azida de sodio en 100 ml de PBS 0,01 M (pH 7,4).
- Incubación de anticuerpos secundarios
- Lavar la muestra en PBS 4x durante 1 h cada vez a RT para eliminar el anticuerpo primario no unido. Preparar la solución de dilución para el anticuerpo secundario disolviendo 0,2 g de BSA y 0,3 ml de Triton X-100 en 100 ml de PBS 0,01 M (pH 7,4).
- Diluir el anticuerpo secundario (conjugado con peroxidasa, IgG anti-ratón IgG-HRP purificado por afinidad) 1: 600 en el tampón de dilución (paso 3.5.2). Incubar la muestra con el anticuerpo secundario a 4 ° C durante 3 días, y mantener la muestra balanceando suavemente en el nutator.
- Coloración
- Preparar la solución de coloración DAB añadiendo 0,002 g de tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAB) a 100 mL de tampón Tris-HCl 0,05 mol / L (pH 7,6) bajo una campana de humos, manteniendo la solución en la oscuridad.
- Lavar los especímenes a RT en PBS 4x durante 1 h cada uno.
- Añadir 10 μl de H 2 O 2 al 30% en una solución de coloración DAB recién preparada e incubar con la solución a 4 ° CO / N o durante 3 d mientras se balancea suavemente sobre el nutator.
- Detener la reacción por plaCing la muestra en PBS con azida sódica al 0,04% cuando se alcanza la intensidad óptima de tinción.
NOTA: Evite el uso de azida de sodio hasta este paso, ya que inhibe la peroxidasa de rábano picante.
- Imaging el tejido manchado
- Transferir con cuidado la muestra a una placa de vidrio petri (5 cm de alto, 10 cm de diámetro) que contenga PBS. Capture imágenes de montaje completo usando una cámara montada en un estereomicroscopio.
NOTA: El tejido manchado de toda la superficie debe ser fotografiado mientras se sumerge completamente en PBS en un plato de vidrio transparente.
- Transferir con cuidado la muestra a una placa de vidrio petri (5 cm de alto, 10 cm de diámetro) que contenga PBS. Capture imágenes de montaje completo usando una cámara montada en un estereomicroscopio.
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Representative Results
Las Figuras 1 - 4 muestran resultados típicos para fibras nerviosas NFP-positivas en el tracto biliar extrahepático en S. murinus . El anticuerpo contra la NFP identificó de forma reproducible la inervación en toda la imagen del tracto biliar extrahepático ( Figura 1 ), la vesícula biliar ( Figura 2 ), el conducto biliar superior ( Figura 3 ) y el área de la papila duodenal ( Figura 4 ), con alta especificidad y mínima fondo.
Para todos los tejidos de la muestra, independientemente de su forma y tamaño, los nervios tegmentales pueden ser teñidos al mismo tiempo. Además de la inervación del tracto biliar extrahepático, la densidad de funcionamiento y distribución del vago del esófago y del estómago se exhibieron sin ambigüedad ( Figura 1 ).
Figura 2 ).
En el conducto biliar superior, dos tipos de haces nerviosos fueron etiquetados. Los finos haces de nervios formaban una red irregular y densa de nervios, corrían adhesivamente y residían en el tracto biliar; Los haces neurales más gruesos se distribuyeron paralelos a la superficie del tracto biliar ( Figura 3 ).
El conducto biliar común se marcó con látex de neopreno azul y los vasos con látex de neopreno blanco. Las finas fibras nerviosas en el extremo del conducto biliar común y el área de la papila duodenal se demostraron claramente con altos niveles de c Ontrast ( Figura 4 ).
Figura 1: Fibras nerviosas NFP-positivas en el tracto biliar, el esófago y el estómago. Las flechas muestran el vago que corre a lo largo del esófago hasta el estómago. CBD, conducto biliar común; Es, esófago; St, estómago. Barra de escala = 1.300 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fibras nerviosas NFP-positivas en la vesícula biliar. Los vasos sanguíneos de la vesícula biliar se marcaron con látex blanco. Abundante inervación se produjo en el cuello de la vesícula biliar (flechas). Barra de escala = 1.000 μm.Ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Fibras nerviosas NFP-positivas en el conducto biliar superior. Se observaron dos tipos de haces nerviosos. Un tipo eran los haces de nervios finos que corrían adhesivamente y residían sobre / en el tracto biliar extrahepático (flechas); El otro tipo eran los paquetes neurales más gruesos que se distribuyeron paralelamente a la superficie del tracto biliar extrahepático y corrían entre la vesícula biliar y el duodeno (triángulos). PV, veta portal. Barra de escala = 650 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Fibras nerviosas NFP-positivas en el área papilar duodenal. El conducto biliar común se marcó con látex azul y los vasos con látex blanco (*). Las flechas muestran la inervación del extremo del conducto biliar común, y los triángulos muestran la inervación del área de la papila duodenal (P), que proviene del conducto biliar común y de los vasos. Barra de escala = 1.000 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este trabajo describe el procedimiento experimental para la visualización de la inervación del tracto biliar extrahepático utilizando un anticuerpo contra la proteína neurofilamento. Este protocolo fue adaptado a partir del protocolo descrito por Kuratani y Tanaka 1 , 2 , 3 .
Para este experimento, planifique la línea de tiempo para cada uno de los experimentos, ya que el enfoque de tinción de montaje completo continúa durante 2-3 semanas. El recipiente que contiene el tejido debe girarse en un nutator en todo momento, excepto durante el proceso de congelación / descongelación. Particularmente durante la incubación con los anticuerpos primario y secundario, la muestra se colocó en una cámara de almacenamiento en frío mientras giraba sobre un nutator para asegurar la exposición uniforme de la muestra a las soluciones de reacción. Varias soluciones - 1% (p / v) de ácido ortoperiodico, 0,004% (p / v) de papaína y el tampón de dilución para el antibo primario / secundarioMuere - se debe hacer fresco para cada experimento. A lo largo del protocolo, para evitar tocar y dañar la muestra al cambiar las soluciones, las soluciones deben ser vertidas en lugar de ser retiradas con una pinza 15 .
Después de fijar con PFA, las muestras se deben lavar suficientemente con DW o PBS. Además, el tratamiento enzimático con la incubación de papaína es importante. El calor y la enzima utilizados para la recuperación del antígeno ayudan a preparar el tejido para la penetración de anticuerpos. Para mejorar la penetración de las soluciones, la membrana externa del tejido debe ser interrumpida por un tratamiento de congelación a -20 ° C durante 30 minutos o -80 ° CO / N 15 .
Es importante sumergir completamente la muestra experimental en volúmenes adecuados de solución tampón para asegurar que la solución pueda incubar toda la muestra. El tiempo de incubación del anticuerpo primario debe determinarse empíricamenteD para diferentes tejidos y tamaños de muestra. Por lo general, debe ser de 3 días para una muestra de 2-3 cm. La dilución óptima debe determinarse empíricamente para cada anticuerpo. Se recomienda una dilución a 1: 600 para los anticuerpos primario y secundario cuando se utiliza el tampón de anticuerpo apropiado.
Este trabajo describe en detalle el protocolo de un enfoque inmunohistoquímico versátil de montaje completo para revelar la expresión de proteína neurofilamento en el tracto biliar de S. murinus . Este método se puede utilizar para analizar la inervación de todos los órganos viscerales en muchas especies. Además, este protocolo también puede adaptarse para probar otros anticuerpos neuronales, pero debe realizarse la optimización de los anticuerpos.
Sin embargo, la técnica fue limitada en el etiquetado de tejido nervioso superficial y en la construcción de un modelo tridimensional de inervación. Además, no pudo identificar las características de las fibras nerviosas ( es decir, simpático o parAsimétrico, motor o sensorial, etc. ).
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores no tienen reconocimientos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
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