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Artigo de método

Etiquetagem de corantes fluorescentes de eritrócitos e leucócitos para estudar a dinâmica do fluxo na circulação da retina do mouse

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DOI:

10.3791/55495

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3 de julho de 2017

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1National Healthcare Group Eye Institute, Tan Tock Seng Hospital, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore National Eye Center, 3School of Material Science and Engineering, Nanyang Technological University, 4Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University Health Systems, National University of Singapore, 5Ophthalmology Academic Clinical Research Program, DUKE-NUS Graduate Medical School

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A imagem em células vivas das células sanguíneas marcadas na circulação ocular pode fornecer informações sobre inflamação e isquemia na retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade. É descrito um protocolo para rotular as células do sangue e imagem das células rotuladas na circulação da retina.

Resumo

A dinâmica da corrente retiniana e coroidal pode fornecer informações sobre a fisiopatologia e seqüelas de várias doenças oculares, como glaucoma, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD) e outras condições inflamatórias oculares. Também pode ajudar a monitorar as respostas terapêuticas no olho. A rotulagem adequada das células do sangue, juntamente com imagens de células vivas das células rotuladas, permite a investigação da dinâmica do fluxo na circulação retiniana e coróide. Aqui, descrevemos os protocolos padronizados de 1,5% de indocyanina verde (ICG) e 1% de marcação de fluoresceína de sódio de ratos eritrócitos e leucócitos, respectivamente. Foi aplicada a oftalmoscopia laser de varredura (SLO) para visualizar as células rotuladas na circulação da retina de camundongos C57BL / 6J (tipo selvagem). Ambos os métodos demonstraram células distintas marcadas fluorescentemente na circulação da retina do mouse. Estes métodos de rotulagem podem ter aplicações mais amplas em várias doenças ocularesModelos.

Introdução

Estudar a dinâmica do fluxo das células sanguíneas na circulação retiniana e coróide é imperativo para a compreensão da patogênese de doenças oculares potencialmente ameaçadoras de visão e outras condições inflamatórias oculares. No entanto, as técnicas de angiografia convencional, que envolvem a ligação de corantes fluorescentes a proteínas plasmáticas, não fornecem nenhuma informação sobre a dinâmica dos eritrócitos ou leucócitos 1 . A dinâmica do fluxo da retina dos eritrócitos é importante para estudar a circulação metabolicamente eficiente na retina e a dinâmica do fluxo de leucócitos, para entender a migração celular, reconhecimento, adesão e destruição em várias condições inflamatórias 2 . Existem várias moléculas fluorescentes usadas na identificação e caracterização de vários tipos de células 3 . A hemodinâmica das células do sangue pode ser medida por coloração com as fluorescências apropriadasCorantes centrais e aplicando as técnicas adequadas de imagem 4 .

A presença de respostas inflamatórias em doenças intraoculares como a degeneração macular relacionada à idade (AMD) e a retinopatia diabética (DR) envolvem a acumulação de linfócitos na área doente 5,6. O rastreamento das células imunes nos tecidos pode ajudar a compreender os eventos complexos envolvidos no mecanismo da patogênese da doença. Os isótopos radioativos como 51 Cr e 125 I foram utilizados como traçadores celulares em estudos iniciais. Esses corantes são tóxicos e afetam a viabilidade celular. Embora os marcadores radioativos 3 H e 14 C sejam menos tóxicos para as células, devido às suas energias de emissão mais baixas, é difícil detectar seus sinais no sistema 7 , 8 . Uma série de corantes de fluorochrome foram introduzidos para superar os problemas potenciais associados wIth marcadores radioativos e acompanhar a migração de linfócitos in vitro usando microscopia fluorescente e citometria de fluxo 9 , 10 . Hoechst 33342 e laranja de tiazol são corantes fluorescentes que ligam DNA, que são utilizados para rastrear linfócitos in vivo. O Hoechst 33342 liga-se a regiões ricas em AT no DNA, é permeável à membrana, mantém os sinais fluorescentes durante 2 a 4 dias e é resistente à extinção 9 , 10 . As desvantagens do Hoechst 33342 e da laranja de tiazole são a inibição da proliferação de linfócitos 11 e a meia-vida curta, respectivamente 9 .

Calcein-AM, diacetate de fluoresceína (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-carboxietil) -5- (e -6) -carboxifluoresceína, éster de acetoximetilo (BCECF-AM), 5- (e -6) Diacetate de carboxifluoresceína (CFDA) e éster de acetoximetilo de ácido 5- (e -6) -carboxifluoresceína (CFDA-AM)São os corantes fluorescentes citoplasmáticos utilizados para estudos de migração de linfócitos. No entanto, FDA, CFDA e CFDA-AM têm menor retenção nas células 9 . BCECF-AM reduz a resposta proliferativa e influencia a produção de quimiotaxia e superóxido 9 , 12 . Calcein-AM é um corante fluorescente e útil para estudos de migração de linfócitos in vivo a curto prazo. Ele emite sinais fluorescentes fortes, não interfere com a maioria das funções celulares e retém sinais fluorescentes por até 3 dias 12 , 13 . O isotiocianato de fluoresceína (FITC) e o éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFDA-SE) são corantes fluorescentes de acoplamento covalente, que são utilizados para estudos de migração de linfócitos. FITC não exibe nenhum efeito sobre a viabilidade celular e tem maior afinidade com os linfócitos B do que os linfócitos T 14 , 15 . Os linfócitos marcados com CFDA-SE podem ser rastreados in vivo por mais de 8 semanas e até 8 divisões de células 9 , 16 . C18 DiI (1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3-tetrametilindocarbocanina perclorato), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyanina perclorato), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 e PKH26 são membrana- Inserindo corantes de carbocyanina lipofílicos fluorescentes usados ​​para rotular leucócitos e eritrócitos. C18 Dil e DiO exibem sinais mais elevados quando incorporados na membrana celular e são relativamente não tóxicos 12 , 17 . As células marcadas com PKH2, PKH3 e PKH26 exibem uma boa retenção dos sinais fluorescentes com menos toxicidade 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . No entanto, o PKH2 regula a expressão CD62L e reduz-se Viabilidade de mphocyte 23 .

A maioria dos estudos acima mencionados foram realizados para rastrear a migração e proliferação de linfócitos no linfatismo e estudar os eritrócitos marcados na circulação não ocular. Existem poucos estudos aplicando as técnicas de rotulagem para estudar as células sanguíneas na circulação ocular. A aplicação de oftalmose de laser de varredura (SLO) tem uma grande vantagem ao estudar as células marcadas na circulação retiniana e coróide in vivo pela angiografia do fundo 26. Existem vários corantes fluorescentes, como ICG, laranja de acridina, FITC, fluoresceína de sódio e CFDA que são utilizados para estudar os leucócitos na circulação da retina por SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . A fototoxicidade e a carcinogenicidade da laranja de acridina 26 , 27 , a interferência da FITC com a atividade celular e a exigência de um agente de contraste intravascular para a resolução dos vasos sanguíneos retinianos e coroidais limitam sua aplicação em experiências com animais in vivo 29 . A fluoresceína de sódio e o ICG são não tóxicos, aprovados pela Food and Drug Administration e seguros para testes em seres humanos 32 , 35 . A maioria dos estudos dinâmicos de fluxo estão relacionados à rotulagem dos leucócitos ou eritrócitos e sua visualização nos vasos sanguíneos da retina e coróide 36 , 37 , 38 , 39 . Aqui, descrevemos um protocolo padronizado de rotulagem ICG dos eritrócitos, marcação com fluoresceína de sódio dos leucócitos e rastreamento das células marcadas visualizadas na circulação da retina do mouse usando SLO.

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Protocolo

Os protocolos de animais utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal de SingHealth, em Cingapura e estão de acordo com as diretrizes da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração para o Uso de Animais em Oftálmica e Visão Pesquisa.

1. Rotulagem de eritrócitos e leucócitos com corantes fluorescentes

  1. Preparação de reagentes
    1. Prepare ICG (1,5 mg / mL) dissolvendo 3 mg de ICG em 1800 μL de água destilada esterilizada. Adicione 200 μL de solução salina tamponada com fosfato 10x (PBS).
    2. Preparar 40% 1x PBS adicionando 4 mL de 1x PBS a 6 mL de água destilada esterilizada. Prepare 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS por adição de 100 mg de BSA a 10 mL de 1x PBS. Misture bem até que a BSA seja dissolvida.
  2. Isolamento de eritrócitos e leucócitos usando centrifugação por gradiente de densidade
    1. Anestesiar os camundongos (tipo selvagemPe C57BL / 6) usando uma combinação de cloridrato de cetamina (50 mg / kg) e cloridrato de xilazina (0,5 mg / kg) (de acordo com o cronograma 1, de acordo com as diretrizes ARVO). Confirme a anestesia por reflexo de retirada do pedal ( isto é , pitada do dedo do pé).
    2. Insira lentamente a agulha de calibre 29 (anexada a uma seringa de 1 mL) em um ângulo costal direcionado ao coração. Para confirmar que a agulha está dentro do coração, retire o êmbolo ligeiramente e verifique se o sangue é retirado para dentro da seringa. Exsanguinate 0,8 - 1 mL de sangue diretamente do coração.
    3. Transfira imediatamente o sangue para um tubo de coleta de sangue contendo ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA) (1,8 mg / ml de sangue) e misture suavemente para evitar a coagulação do sangue.
    4. Eutanizar os camundongos administrando pentobarbital (80 mg / kg) por injeção intraperitoneal.
    5. Coloque o sangue inteiro em cima de uma solução de polissonídeos e diatrizoato de sódio (razão 1: 1, densidade 1,077 g / mL) num tubo de microcentrífuga de 2 mL e centri(450 xg, 30 min) para permitir a separação dos leucócitos e eritrócitos do plasma.
    6. Remova e descarte o sobrenadante (plasma) usando uma pipeta. Transmita cuidadosamente o revestimento buffy (leucócitos) e eritrócitos (camada de glóbulos vermelhos) em tubos novos e separados usando pipetas.
  3. ICG (1,5%) rotulagem de eritrócitos
    1. Lave os eritrócitos com 1x PBS para remover quaisquer contaminantes. Ressuspenda os eritrócitos em 1x PBS (1: 1) para produzir 50% de hematócrito. Alíquota 0,5 mL de 50% de hematócrito (~ 250 μL de eritrócitos embalados) em tubos de microcentrífuga. Centrifugar os eritrócitos (750 xg, 5 min) e descartar o sobrenadante.
    2. Adicione 200 μL de 40% 1x PBS aos eritrócitos granulados, misture bem e incube à temperatura ambiente durante 5 min. Adicione 100 μL de ICG (1,5 mg / mL) à suspensão de eritrócitos, misture suavemente invadindo o tubo e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Adicionar 300 μL de 1x PBS e incubar a37 ° C numa incubadora de agitação durante 60 min.
    3. Centrifugar os eritrócitos transportadores (750 xg, 3 min) e ressuspender em 1 mL 1x PBS.
    4. Lave as células ~ 3 a 5 vezes com 1x PBS até o sobrenadante ficar limpo (passo 1.3.3). Após a última lavagem, decanta o sobrenadante e adiciona 1% de BSA PBS (1: 1) aos eritrócitos pre-inchados etiquetados para atingir um hematócrito a 50% (1,25 x 10 8 células / mL) de eritrócitos marcados com ICG.
  4. Rotina de fluorescência de sódio (1%) de leucócitos
    1. Depois de separar o revestimento buffy do sangue usando centrifugação em gradiente de densidade (do passo 1.2.6), lavar as células uma vez com 10 mL de 1x PBS por centrifugação a 450 xg durante 10 minutos para remover quaisquer contaminantes. Ressuspender o sedimento em 900 μL de 1x PBS.
    2. Adicionar 100 μL de fluoresceína de sódio a 10% a 900 μL da suspensão de leucócitos e incubar à temperatura ambiente durante 2 min. Lavar as células rotuladas três vezes com 10 mL de PBS 1X por centrifugaçãoNg (450 xg, 10 min). Ressuspender as células em 100 μL de 1x PBS.

2. Imagem ao vivo de células com etiquetas fluorescentes

  1. Imagens de células vivas de eritrócitos marcados com ICG
    1. Para preparar células para injeção via veia da cauda ou rota retro-orbital, diluir o hematócrito de 50% de eritrócitos marcados com ICG em 10 vezes e 50 vezes com 1x PBS para produzir células de hematócrito a 5% e 1%, respectivamente.
    2. Coloque o mouse sob a luz infravermelha (intensidade de 250W) por 5 minutos para permitir que a veia da cauda se dilate. Anestesiar o rato com cloridrato de cetamina (50 mg / kg) e cloridrato de xilazina (0,5 mg / kg) através de injeção intraperitoneal (aqui, de acordo com o cronograma 1, de acordo com as diretrizes ARVO).
    3. Dilate cada pupila dos olhos com uma gota de 0,5% de tropicamida e 2,5% de cloridrato de fenilefrina.
    4. Coloque as lentes de contato sobre um olho para imagens. Use o gel oftálmico como meio para a imagem e para evitar secasS da córnea. Corrija a câmara de oftalmocoscopia de varredura a laser confocal (SLO) com +25 dioptrias para compensar a refração do olho do mouse.
    5. Coloque o mouse na plataforma de imagem SLO. Certifique-se de que a córnea do mouse está virada diretamente para a cabeça óptica da máquina SLO.
    6. Ligue o módulo de imagem. Usando o software do módulo de imagem associado, clique no botão "Novo Paciente" e adicione detalhes de identificação de animais, como número de etiqueta da orelha do mouse, data de nascimento, porcentagem de corante fluorescente e tipo de célula rotulada.
      1. Posicione o nervo óptico do animal no centro da tela de imagem ao manobrar o módulo de imagem. Usando o software do módulo de imagem associado, clique no botão "Adquirir" para tirar as imagens do fundo do infravermelho (IR) com a configuração de ângulo de 30 ° ou 15 °. Certifique-se de que o centro da retina, a pupila e o caminho óptico do laser estão alinhados para alcançar uma imagem de melhor qualidade.
        NOTA: O caminho óptico é alinhado ao manobrar o joystick para obter a imagem mais nítida e a melhor exposição de iluminação.
    7. Pegue o vídeo ICG fundus.
      1. Ligue o filtro ICG (790 nm), ajuste a câmera para o modo de alta velocidade com a visão angular de 30 ° ou 15 ° e defina a intensidade ICG em 85 para todas as leituras para padronização. No painel de controle, clique no botão "Adquirir" para tirar o vídeo (controle de linha de base) em 8,8 / 15 quadros / s por 1 min.
    8. Coloque 100 μL de eritrócitos marcados com ICG em uma seringa de insulina anexada a uma agulha de calibre 30.
      1. Para a injeção através da via da veia da cauda, ​​insira o chanfro da agulha na veia da cauda. Confirme o acesso intravenoso, verificando a refluxo do sangue na seringa e injetar as células rotuladas na circulação.
      2. Para a injeção através da via retro-orbital, insira a agulha adjacente ao olho no espaço retro-orbitalE. Confirme o acesso retro-orbital, verificando o refluxo do sangue na seringa e injetar as células marcadas na circulação.
    9. Após a injeção, reposicione o mouse e pegue as imagens do fundo do IR (veja o passo 2.1.6.1) e o vídeo usando o filtro ICG (veja o passo 2.1.7.1). As células rotuladas na circulação da retina podem ser visualizadas imediatamente após a injeção das células.
    10. Depois de adquirir os quadros de vídeo, extraie imagens .tiff das sequências de vídeo, escolhendo o formato .tiff ao exportar o vídeo usando o software do módulo de visualização SLO. Salve os arquivos em uma pasta desejada.
    11. Remova a lente de contato, coloque-a sobre o outro olho e complete a imagem conforme descrito nas etapas 2.1.4 - 2.1.7.
    12. Após a imagem, coloque o animal anestesiado sob a luz infravermelha (250W) para manter a temperatura corporal até que ele se recupere da anestesia. Quando o animal estiver totalmente recuperado, coloque o mouse de volta na gaiola de retenção.
  2. Imagem de células vivas de 1% de leucócitos marcados com fluoresceína de sódio
    1. Prepare o mouse e configure o instrumento conforme descrito na seção 2.1.
    2. Posicione o mouse e tire as imagens do fundo do IR conforme descrito nas etapas 2.1.4 - 2.1.6.
      1. Obtenha o angiograma de fluoresceína do mouse usando o filtro de fluoresceína (488 nm) com o modo de câmera de alta velocidade com ângulo de 30 ° ou 15 ° e intensidade de fluoresceína em 85 para todas as leituras para padronização. Grave o vídeo (controle de linha de base) em 8.8 / 15 quadros / s (veja o passo 2.1.7.1).
        NOTA: Aqui, várias faixas de vídeos (vídeos de 1 min) foram adquiridas em diferentes intervalos de tempo.
    3. Injete leucócitos marcados com 100 μL no mouse através da veia da cauda ou injeção retro-orbital como descrito na seção 2.1.8.
    4. Imediatamente após a injeção, posicione o mouse e tire as imagens do fundo do IR (veja as etapas 2.1.5 e 2.1.6) e o fluoAngiograma rescein do mouse (ver seção 2.2.2).
    5. Observe as células rotuladas na retina ou nos vasos sanguíneos coroidais ajustando o ponto focal do laser de varredura girando o botão de focagem no módulo de imagem.
    6. Adquira os quadros de vídeo e as imagens usando o software do módulo de visualização SLO (veja a etapa 2.1.10) e guarde-o na pasta desejada.
    7. Após o procedimento, siga o passo 2.1.12 para cuidar de animais.
  3. Análise de imagem por software MtrackJ
    1. Abra a sequência da imagem no ImageJ clicando em "Arquivo". Selecione "Importar" e escolha "Seqüência de imagens", selecione a pasta de imagem desejada e clique em "Abrir". Uma janela pop-up chamada "Opções de Seqüência" aparecerá na tela. Clique em "Ok"; A seqüência da imagem será aberta.
    2. Defina o intervalo de quadros do vídeo da imagem clicando em "Imagem" e selecione "Propriedades" para medições de velocidade. Aqui, é 8.8 framEs / s.
    3. Abra o plugin MTrackJ selecionando "Plugins". Selecione "Rastreamento" e selecione "MtrackJ". Um menu deve aparecer.
    4. Para ajustar as configurações de rastreamento, selecione "Rastreamento" (no menu) e marque a caixa "Mover para o próximo índice de tempo após o ponto de adição".
    5. Acompanhe a primeira célula.
      1. Localize uma célula e rastreie a mesma célula em quadros subseqüentes. No menu, clique em "Adicionar" para adicionar uma nova faixa.
      2. Passe o cursor sobre a imagem (+ sinal) e clique na célula apropriada.
        NOTA: O MTrackJ irá automaticamente para o próximo período de tempo e adicionará um pequeno círculo, marcando a posição do primeiro ponto na trajetória.
      3. Continue clicando na posição atual da célula enquanto se desloca através dos quadros da seqüência da imagem.
        NOTA: Ocasionalmente, os círculos que marcam os pontos anteriores na trajetória interferem na capacidade de visualizar a localização atual. Se isso ocorrer,Avance para a etapa 2.3.5.3.1.
        1. Altere a opção de exibição para a trajetória clicando em "Exibição" no menu e selecionando a opção "exibir apenas pontos de trilha na hora atual". Para ver todas as trajetórias, desmarque essa opção.
      4. Continue clicando até que a trajetória da primeira célula seja vista. Em seguida, guarde a faixa clicando em "Salvar".
    6. Acompanhe a segunda célula.
      1. No menu, clique em "Adicionar" para iniciar uma nova faixa. Repita as etapas 2.3.5.1 - 2.3.5.4 para rastrear a nova célula. Clique em "Salvar" para salvar a segunda faixa.
      2. Continue estas etapas para todas as células rastreáveis ​​observadas. Depois de rastrear as células, clique em "Medir" e "OK" na guia do menu para obter os resultados.
        NOTA: Uma janela de resultados se abre automaticamente, que pode ser salva e aberta em uma planilha para posterior análise.

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Resultados

Os eritrócitos marcados com ICG a 1,5% foram visualizados na circulação da retina de ratinhos C57BL / 6J (tipo selvagem). Tanto o hematócrito de 1% como o de 5% de eritrócitos marcados com ICG a 1,5% foram distinguíveis na circulação da retina. No entanto, as células rotuladas individuais foram mais claramente visualizadas com 1% de hematócrito de 1,5% de eritrócitos marcados com ICG ( Figura 1 ). Em 5% de hematócrito, devido ao grande número de células marc...

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Discussão

Estudar a hemodinâmica na circulação retiniana e coróide é vital para a compreensão da fisiopatologia de muitas doenças oculares. A dinâmica do fluxo sanguíneo na circulação da retina pode ser estudada por tomografia de coerência óptica de domínio de Fourier (FD-OCT), fluxografia de speckle laser (LSFG) e oximetria retiniana. Embora estes métodos utilizem diferentes abordagens para estudar o fluxo sanguíneo total na circulação da retina 40 , 41 ,

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar. Não há conflito financeiro ou financeiro.

Agradecimentos

O projeto de pesquisa foi financiado pela bolsa do New Investigator do National Medical Research Council (NMRC), em Cingapura. A equipe gostaria de reconhecer o treinamento de pesquisa fornecido ao Dr. Agrawal no Instituto de Oftalmologia (IOO), University College London (UCL) sob a Associação de Treinamento de Pesquisa no Exterior do National Research Research (NMRC) de novembro de 2012 a outubro de 2014 sob orientação do Prof. David Shima. O Dr. Agrawal adquiriu o conceito e habilidades para rotular as células e imagens em vivo no laboratório do Dr. Shima. Por conseguinte, a equipe gostaria de reconhecer supervisão e orientação durante a bolsa de treinamento do Prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh e Dr. Daiju Iwata.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Corante de polimetina Cardiogreen (verde de indocianina)Sigma Aldrich12633-50MG
Fluoresceína 100 mg / mLNovartisU1705A / H-1330292
10x solução salina tamponada com fosfato (PBS) Ultra Pure Grade1ª BASEBUF-2040-10X1L
Albumina de soro bovinoSigma AldrichA7906-100G
Tubos Microtainer com K2E (K2EDTA) - concentração de EDTA - 1,8 mg/mL de sangueBD, EUAREF
Solução Histopaque 1077Sigma Aldrich10771
Centrífuga 5810 REppendorf05-413-401
Tubos de microcentrífuga 2 mLAxygenMCT-200-C-S
Misturador de vórticeInsta BioAnalytik pte. ltdVÓRTICE
IncubadoraShaker Lab Tech
Ceva Injeção de cetamina (Cloridrato de cetamina 100 mg/mL)CevaKETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Cloridrato de xilazina 20 mg/Ml)Troy Laboratories PTY. LimitedLI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamida 1%)Alcon  Laboratories, Inc. EUANDC  0998-0355-15
2,5% Mydfrin 5 mL (Cloridrato de fenilefrina 2,5%)Alcon  Laboratories, Inc. EUANDC  0998-0342-05
Seringa Terumo com agulha 1 cc/mL TuberculinaTerumo (Filipinas) Corporation, FilipinasSS-01T2613
Gel Vidisic 10 GDr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlim, Alemanha
Cotonetes com álcoolAssegure descartáveis médicos7M-004-L-01
Sistema confocal de angiografia por varredura a laser (Heidelberg Retina Angiograph 2)Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Alemanha
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Alemanha
Microscópio fluorescenteZEISSModelo: axio imager z1
365974 FINO

Referências

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