Um método simples para identificar quinases que regulam a pluripotência de células estaminais embrionárias por meio de triagem de inibidores de alto rendimento

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo quantitativo e escalável para realizar telas de moléculas pequenas direcionadas para os reguladores de cinase da transição pluripotente iniciada na primitiva.

Resumo

As células estaminais embrionárias (CES) podem auto-renovar ou diferenciar-se em todos os tipos de células, um fenômeno conhecido como pluripotência. Distintos estados pluripotentes foram descritos, denominados pluripotência "ingênua" e "preparada". Os mecanismos que controlam a transição na primitiva são mal compreendidos. Em particular, permanecemos mal informados sobre proteínas quinases que especificam naïve e primado pluripotentes estados, apesar de aumentar a disponibilidade de alta qualidade ferramenta de compostos para sonda kinase função. Aqui, descrevemos uma plataforma escalável para executar telas de moléculas pequenas direcionadas para reguladores de cinase da transição pluripotente iniciada na primitiva em ESCs de mouse. Esta abordagem utiliza condições simples de cultura de células e reagentes padrão, materiais e equipamentos para descobrir e validar inibidores de cinase com efeitos até agora não apreciados na pluripotência. Discutimos possíveis aplicações para esta tecnologia, incluindo a triagem de outras moléculas pequenasColecções tais como inibidores de cinase cada vez mais sofisticados e bibliotecas emergentes de compostos de ferramentas epigenéticos.

Introdução

As células estaminais embrionárias têm a capacidade de se auto-renovar ou se diferenciar em qualquer tipo celular no corpo adulto, fenômeno conhecido como pluripotência ¹ . Evidências recentes indicam que existem estados pluripotentes distintos do desenvolvimento, denominados pluripotência "naïve" e "iniciada" ² . Naïve CES representam um estado de desenvolvimento semelhante ao encontrado no embrião pré-implantação ³ . Em contraste, os CEP pluripotentes primários estão preparados para sair da pluripotência e se diferenciar em linhagens embrionárias especializadas ^{4 , 5} .

Os estados pluripotentes ingênuos e iniciados são marcados por redes reguladoras genéticas distintas. A pluripotência naive é caracterizada pela expressão de factores de transcrição de pluripotência chave tais como Nanog, factores de transcrição tipo Krueppel (Klfs), Rex1 ² e Esrrb 6. Em ESCs de ratinho (mESCs), a pluripotência iniciada é caracterizada pela expressão reduzida de marcadores ingênuos e uma assinatura de expressão genética específica que inclui a ADN metiltransferase de novo Dnmt3b ⁷ . In vivo , células pluripotentes primitivas pós-implantação de epiblasto (EpiSCs) ^{4 , 5} expressam adicionalmente o marcador de Epiblast Fgf5 e marcadores de iniciação de linhagem, tais como Brachyury ⁸ .

Os mESCs fornecem um modelo tratável para sondar os mecanismos que controlam as transições pluripotentes primitivas iniciadas in vitro . Quando cultivados em fator inibidor de leucemia (LIF) e soro fetal bovino (FBS), os mESCs passam por transição dinâmica entre estados pluripotentes ingênuos e iniciados ^9,10 . Funções de sinalização LIF-Jak-Stat3 para promover uma rede de regulação de genes naif ¹¹ , enquanto a sinalização autocrina através da via Erk1 / 2 do factor de crescimento de fibroblastos 4 (Fgf4) conduz a transição para o estado iniciado ¹² . Contudo, continua a ser um desafio avaliar sistematicamente o papel das proteínas quinases na especificação de estados pluripotentes distintos.

Aqui, descrevemos uma plataforma quantitativa e escalonável para a realização de telas de moléculas pequenas direcionadas para os reguladores de quinase da transição pluripotente iniciada na primitiva. Utilizamos condições de cultura mESC simples e reagentes padrão, materiais e equipamentos para descobrir e validar inibidores de quinase com capacidade até então não apreciada para estabilizar a pluripotência naïve. Além disso, discutem-se potenciais aplicações alargadas para esta tecnologia, incluindo o rastreio de outras colecções de moléculas pequenas, tais como bibliotecas de inibidores emergentes que visam reguladores epigenéticos.

Protocolo

1. Colocação de Bibliotecas de Inibidores de Quinase de Pequenas Moléculas

1. Agrupar as bibliotecas de inibidores de colecções de inibidores de quinase publicamente acessíveis, por exemplo , a Biblioteca de Assinaturas Celulares Baseadas em Redes Integradas (LINCS) da Harvard Medical School, uma colecção selectiva de 228 inibidores de cinase potentes e selectivos (http://lincs.hms.harvard.edu) , E o Protein Kinase Inhibitor Set (PKIS), uma colecção de compostos 376 reunida por investigadores industriais (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) ¹³ . Alternativamente, montar uma colecção de inibidor de cinase sob medida a partir de compostos comercialmente disponíveis.
   NOTA: Em nosso laboratório, reunimos uma coleção de 72 potentes e seletivos inibidores de quinase de ferramenta cobrindo 51 cinases-alvo primárias, todas as quais estão disponíveis a partir de fontes comerciais.
2. Reunir inibidores de cinase em placas de 96 poços para processamento ótimo de alto rendimento em concentrações múltiplas (use 1, 0,1 aNd 0,01 mM). Incluir em cada placa os poços de controlo contendo apenas DMSO e os inibidores de controlo de referência PD173074 (FGFRi) e Ruxolitinib (JAKi), que são conhecidos por promoverem estados pluripotentes inocentes e iniciados respectivamente. Anotar em uma planilha ou software similar.

2. Condições e Procedimentos de Cultura do MESC para a Preparação da Tela

1. Preparar placas de 10 cm revestidas com gelatina a 0,1% por adição de 5 mL de gelatina a 0,1% (p / v) a placas de 10 cm e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Aspirar a gelatina e deixar a placa secar durante 2 min.
2. Cultivar qualquer linha mESC padrão a 37 ° C 5% CO ₂ em placas de 10 cm revestidas com gelatina a 0,1% em meio mESC padrão (ver Tabela de Materiais) contendo 100 ng / mL de GST-LIF, 10% de Soro Fetal de Bezerro e 5% de Soro Knockout Substituição. Substituir mídia todos os dias e passagem mESCs em cerca de 80% de confluência a cada segundo dia em uma diluição de 1: 5-1: 10.
3. Para a passagem de mESCs, aspirar o meio e lavar com 5 mL deF de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por placa.
4. Adicionar 1 mL de tripsina-EDTA (tripsina a 0,05%, EDTA a 0,02%) por placa de mESCs e incubar a 37 ° C durante 10 min.
5. Ressuspender as células tripsinizadas em 4 mL de meio mESC e centrifugar a 1200 rpm durante 5 min.
6. Ressuspender completamente o sedimento celular em 5 ml de meio mESC, pipetando para cima e para baixo para gerar uma única suspensão celular.
7. Contar células por combinação de 10 μL de suspensão celular e 10 μL de azul de tripano (0,4%). Colocar em uma câmara de contagem de células ou usar um hemocitômetro e microscópio de luz.
8. Semear 3 x 10 ³ mESCs em placas de 96 po�s revestidas com gelatina a 0,1%, volume final 100 � de meio, utilizando uma pipeta multicanal.
9. Aplique os inibidores de cinase a uma diluição de 1: 100 (1 μl de inibidor adicionado a 100 μL de meio) utilizando uma pipeta multicanal. Pipetar suavemente a mídia para misturar inibidor e suspensão celular, em seguida, permitir que as células para resolver em uma capa de cultura de tecidos por 1 h para garantir a distribuição igual acroSs a superfície do chapeamento. Células de cultura durante 48 h sem alterar a mídia.
   NOTA: Placas de reserva de 1 / 0,1 / 0,01 mM darão uma concentração final de inibidor de 10/1 / 0,1 μM, respectivamente. Recomenda-se iniciar o ecr� numa concentra�o final de 1 � para assegurar a inibi�o efectiva das cinases alvo prim�ias enquanto se minimizam os efeitos fora do alvo.

3. Análise de Rastreio de Inibidores de Quinase

1. Lavar 96 placas de mESC bem em 200 μL de PBS usando um aspirador multicanal e pipetas.
2. Preparar extractos celulares em 150 μL de tampão de lise (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NP-40 1% (v / v), desoxicolato de sódio a 0,5% (p / v), p-glicerofosfato 10 mM , Pirofosfato de sódio 10 mM, NaF 1 mM, Na3VO4 2 mM, Comprimidos Completos de Cocktail de Inibidor de Protease).
3. Clarificar os extractos por centrifugação a 1.500 xg durante 30 min em placas de 96 poços de fundo em V.
4. Imobilizar 100 μL de sobrenadantes num nitrocelMembrana de celulose utilizando um colector de manchas ponto de vácuo de 96 poços.
5. Secar a membrana e colorir com 40 mL de Ponceau S para assegurar uma transferência consistente.
6. Lavar a membrana com TBST e bloquear em TBST / 3% (p / v) de leite.
7. Incubar em anticorpos Nanog e Dnmt3b a uma diluição de 1: 1.000 (v / v) em TBST / 3% (p / v) de leite em pó durante a noite.
8. Lavar as membranas em 3 x 10 min em TBST e incubar em 30 mL de anticorpos secundários a uma diluição de 1: 10.000 (v / v) em TBST / 3% (p / v) de leite.
9. Desenvolver usando um sistema de imagem digital imunoblotting.
   NOTA: Se possível, use fluorescência quantitativa immunoblotting para detectar Nanog e Dnmt3b. No entanto, o sinal de fundo para Dnmt3b por imunoblotting de fluorescência é demasiado elevado. Por conseguinte, são utilizados anticorpos secundários de fluorescência anti-coelho (Nanog) e anti-HRP de ratinho (Dnmt3b) de 800 nm.

4. Análise de Dados de Tela e Validação de Inibidores como Reguladores de Pluripotência Bona Fide

NOTA: Esta é uma etapa crítica para garantir que somente os moduladores de pluripotência de boa-fé sejam identificados. É essencial para os inibidores de triagem com base tanto na relação Nanog: Dnmt3b como no sinal global, para garantir que os inibidores de cinase que afectam adversamente a sobrevivência do mESC não são seleccionados para análise posterior.

1. Quantificar o sinal de Nanog e Dnmt3b usando o software de análise de imunotransferência e importar valores para uma planilha ou software similar. Calcular a relação Nanog: Dnmt3b para todas as amostras em comparação com o controlo do DMSO. Determinar também o sinal de Nanog e Dnmt3b total para assegurar que os inibidores de quinase não afectam a relação Nanog: Dnmt3b alterando a viabilidade do mESC.
2. Utilizar relações classificadas de Nanog: Dnmt3b para identificar inibidores que promovam a pluripotência naïve (razão Nanog: Dnmt3b superior ao controlo) e pluripotência iniciada (razão Nanog: Dnmt3b inferior ao controlo). Defina o corte em 2x desvio dos valores de controle e filtre os inibidores de quinase que produzem um sinal Nanog + Dnmt3b total menor que50% do valor de controlo de DMSO para gerar uma lista de confiança elevada de inibidores de cinase que estabilizam os estados pluripotentes naïve (razão Nanog: Dnmt3b elevada) e iniciada (razão Nanog: Dnmt3b baixa).
3. Validar inibidores de quinase semeando mESCs a 2 x 10 ⁵ células por 6 poços em 2 mL de meio, e adicionar inibidores de cinase a 1 μM durante 48 h, sem alterar a mídia.
4. Lyse mESCs em lise buffer e analisar Nanog e Dnmt3b expressão convencional SDS-PAGE immunoblotting.
5. Validam ainda mais os resultados por imunotransferência de SDS-PAGE para marcadores de pluripotência níve Klf2 e Klf4 e Oct4 para assegurar que a pluripotência é mantida após 48 h de tratamento com inibidor.

Resultados

Utilizando o procedimento aqui apresentado ( Figura 1 ), seleccionamos a biblioteca LINCS de 228 inibidores de cinase potentes e selectivos para identificar aqueles que modulam a pluripotência mESC. A biblioteca é preparada a uma concentração de 0,1 mM para uma diluição 1: 100 e concentração final de rastreio de 1 μM em mESCs. 48 h mais tarde, mESCs foram lisadas e extratos preparados para análise quantitativa dot blot de Nanog e Dnmt3b expressão ( Figura 2 , topo). Os resultados de outras concentrações de rastreio não são aqui representados por brevidade. A proporção de Nanog: Dnmt3b é determinada para cada inibidor de cinase e compostos classificados e um corte 2x aplicado ( Figura 2 , parte inferior). O sinal de Nanog e Dnmt3b total em relação ao controlo é sobreposto à classificação de inibidor e sujeito a um corte de 0,5x, para permitir a triagem de inibidores que mostram toxicidade mESC significativa. Os inibidores de cinase seleccionados que estabilizam aTe são validadas utilizando a imunotransferência convencional Nanog / Dnmt3b ( Figura 3 ). As metas de cinase primária destes inibidores são apresentadas na Tabela 1 . Também demonstramos a aplicabilidade desta tela para identificar inibidores que estabilizam o estado iniciado ¹⁴ .

Figura 1: Fluxo de trabalho para a triagem de inibidores de cinase que modulam a transição iniciada por ingestão. MESC foram tratados com uma biblioteca de inibidor de cinase de composto 228 a uma concentração final de 1 μM. Os lisados ​​foram preparados e transferidos para membranas de nitrocelulose para análise de imunotransferência, e determinaram-se os níveis de Nanog e Dnmt3b (Figura adaptada de Williams et al., ¹⁴ ). Clique aqui para ver al Versão arger desta figura.

Figura 2: Análise de tela de pluripotência iniciada por Naïve e identificação de inibidor. (Top) Imagens de imunotransferência de imagens Nanog e Dnmt3b representativas. (Inferior) Determinaram-se os valores de Nanog e Dnmt3b para cada inibidor de quinase em relação ao controlo de DMSO e determinaram-se as proporções de Nanog: Dnmt3b e o sinal relativo total de Nanog + Dnmt3b e os inibidores foram classificados em comparação com o controlo de DMSO. Identificaram-se inibidores que alteram a proporção de Nanog: Dnmt3b para além de um limite de 2 vezes acima ou abaixo do controlo de DMSO como condutores de pluripotência inocente ou iniciada. Um limiar de 2x abaixo do controlo de DMSO foi ajustado para inibidores de triagem que comprometem a sobrevivência de mESC. Os inibidores seleccionados para validação adicional são realçados. (Figura adaptada de Williams et al., ¹⁴ ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Validação de compostos seleccionados identificados. MESCs foram tratados quer com 1 μM de AZD4547 (um inibidor de FGFR selectivo) quer com os inibidores indicados identificados a partir do ecrã da Figura 2. Nanog: Níveis de Dnmt3b determinados por SDS-PAGE e análise de imunotransferência padrão. Os valores numéricos de Nanog relativo: Dnmt3b e Nanog + Dnmt3b são indicados na tabela abaixo, e os inibidores que estabilizam o estado pluripotente naïve realçado em verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Composto	Alvos Principais		Outros alvos
AV-951	VEGFR
HG-6-64-01	ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K
WH-4-023	Lck		Src
R406	Syk
GW-572016	HER2		EGFR
KIN001-244	PDK1
WZ-4-145	CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2
WZ-7043	CSF1R, DDR1, FGFR e TAO1
GW786034	VEGFR1		VEGFR2, VEGFR3 &# 160;
AZD-1480	JAK2

Tabela 1: Compostos acertados selecionados e seu (s) alvo (s) cinase primário (s).

Discussão

Aqui nós demonstramos uma metodologia amplamente acessível para sondar o papel das vias de sinalização de quinase na regulação da transição pluripotente iniciada na primitiva. Isso aborda uma questão chave no campo ESC. Embora as abordagens genômicas e transcriptômicas de alto rendimento sejam rotineiramente usadas para identificar reguladores transcripcionais chave de estados pluripotentes ingênuos e iniciados, a elucidação de redes de sinalização de pluripotência provou ser um desafio. Nós agora fornecemos uma estratégia flexível empregando inibidores químicos para identificar quinases que controlam a transição pluripotente iniciada na primitiva em mESCs. Isso depende de equipamentos simples, reagentes e materiais que estão disponíveis para a maioria dos laboratórios que estudam sinalização celular e ESC biologia. Crítico para o sucesso desta plataforma é o nosso desenvolvimento de um robusto ensaio para quantificar a transição entre naif e primado pluripotente estados. O estabelecimento deste ensaio exigiu modificações iterativas significativasDensidade, tempo de incubação do inibidor e condições de immunoblotting.

Abordagens de pequenas moléculas estão ganhando força para uso racional em aplicações terapêuticas ESC ^{15 , 16} . Uma grande vantagem da triagem de moléculas pequenas é que os compostos de ferramenta são concebidos e / ou modificados para uma absorção celular eficiente. A eficiência de transfecção não é limitante e não é necessário o uso de sistemas de distribuição perigosos, tais como o lentivírus. Além disso, inibidores freqüentemente inibem múltiplas isoformas dentro de uma família de quinase ( eg Fgfr1-4, Jak1-3), que supera a redundância funcional que dificulta técnicas de interferência genética / genômica como RNAi e CRISPR / Cas9. À medida que os compostos de ferramentas mais potentes e selectivos tornam-se disponíveis a partir de programas de descoberta de fármacos académicos e farmacêuticos, as quinases pouco estudadas e mal compreendidas serão empurradas para a vanguarda da investigação do ESC. Propomos, portanto, que esteA abordagem de rastreio de "roughput" abrangerá novas vias de investigação em redes reguladoras do CES.

Uma limitação menor desta tecnologia é que mesmo os mais potentes e selectivos inibidores de moléculas pequenas envolvem e inibem múltiplas cinases não relacionadas in vivo . Contudo, os dados de perfilamento de inibidores de quinase, cada vez mais abrangentes, permitem que alvos funcionais de inibidores de quinase sejam facilmente identificados (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inibidores). Finalmente, em princípio, a nossa plataforma pode ser aplicada para interrogar qualquer recolha de moléculas pequenas e / ou ensaio celular para o qual estão disponíveis anticorpos de imunotransferência de alta qualidade. Isto permitirá o estudo de múltiplos sistemas reguladores na regulação da pluripotência e facilitará a identificação de pequenos inibidores de moléculas que modificam diversos processos celulares. Especificamente, prevê-se que a aplicação de pequenas colecções de moléculas emergentes, tais como o epigeneTic sondas desenvolvidas pelo Structural Genomics Consortium (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) tem o potencial de descobrir mais novos reguladores de transições pluripotentes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
mESC media
CCE mESCs	ATCC	ATCC  SCRC-1023
DMEM	Media Gibco	11965092
L-Glutamina	Gibco	25030081	Final: 2 mM
Penicilina/Estreptomicina	Gibco		15140122 Final: 50 U/ml
2-mercaptoetanol	Sigma	M6250	Final: 0,1 mM
Fator Inibidor de Leucemia (fusão GST)	Reagentes e serviços		Final: 100 ng/mL
Fator Inibidor de Leucemia	Thermo	PMC9484	Final: 100 ng/mL
de Aminoácidos Não Essenciais	Gibco	11140050	Final: 0,1 mM
de Piruvato de Sódio	Gibco	11360070	Final: 1 mM
KnockOut Reposição de Soro	Invitrogen	10828-028	Final: 5%
Soro Fetal Bovino Definido	Fisher	10703464	Final: 10%
Nome	Empresa	Número de Catálogo<	strong>Comentários
TC materiais
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Thermo	25300054
Gelatina de pele suína	Sigma	1890
Nunc MicroWell Microplacas de 96 poços	Thermo	156545
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Gibco	14190136
placas de 96 poços com fundo em V	Greiner Bio-one	651261
Nome	Empresa	< strong>Número de catálogo	Comentários
Tampão de lise
Tris tampão	VWR	103157P
Cloreto de sódio	VWR	97061
EDTA	Sigma	E4884
1% NP-40	Sigma	9016-45-9
Sódio Desoxicolato	Sigma	D6750-100g
β-glicerofosfato	Sigma	G9422
Pirofosfato de Sódio	Sigma	13472-36-1
Fluoreto de Sódio	Sigma	450022
Ortovanadato de Sódio	Sigma	450243
Roche Comprimidos de Coquetel Inibidores de Protease	Completos Sigma	CO-RO
strong>Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Chemicals
Tween	Sigma	P1379-1L
Leite em Pó	Marvel
Nome	Company	Número de Catálogo	Comentários
Western Blotting
Protran BA 85 Nitrocelulose 0,45 &micor; M  Tamanho dos poros (folhas de 20 cm x 20 cm) (25 folhas)	GE	10401191
Ponceau S	Sigma	P7170-1L
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
>Equipamento de laboratório
Minifold I Sistema	GE	10447850
ChemiDoc imager	BioRad	1708280
LiCor Odyssey Imager	LiCor
Nome	Empresa<	strong>Número de Catálogo<	strong>Comentários<
strong>Anticorpos
Anti-mouse Nanog	Reprocell	RCAB001P
Anti-Dnmt3b	Imgenex	IMG-184A
IRDye 800CW Burro anti-Coelho	Licor	926-32213
Tecnologia de Sinalização de Célula	Anti-mouse-HRP	7076S
Anti-Klf2	Millipore	09-820
Anti-Klf4	R & D Systems	AF3158
Anti-Oct4	Santa Cruz	sc-5279