Summary
Эффект краткосрочной тренировки сопротивления для пожилых людей был исследован путем одновременного использования нескольких методов. По сравнению с контрольной группой наблюдалось много улучшений, в том числе по мышечной аэробной способности, толерантности к глюкозе, силе, мощности и качеству мышц ( т. Е. Белка, участвующего в клеточной передаче сигналов и составе типа мышечного волокна).
Abstract
Этот протокол описывает одновременное использование широкого диапазона методов для изучения мышечной аэробной способности, толерантности к глюкозе, силы и силы у пожилых людей, выполняющих краткосрочную тренировку сопротивления (RET). Наблюдаемое обучение прогрессивному сопротивлению в течение 1 часа три раза в неделю в течение 8 недель проводилось участниками RET (71 ± 1 год, диапазон 65-80). По сравнению с контрольной группой без обучения, RET продемонстрировал улучшения в отношении мер, используемых для указания силы, мощности, толерантности к глюкозе и нескольких параметров мышечной аэробной способности. Силовой тренинг проводился в тренажерном зале с исключительно надежным фитнес-оборудованием. Изокинетический динамометр для прочности разгибателя колена позволил измерить концентрационную, эксцентричную и статическую прочность, которые увеличились для группы RET (8-12% после теста). Мощность (скорость развития силы, RFD) в начальные 0-30 мс также показывала увеличение для группы RET (52%). Тест на толерантность к глюкозе с частотойNt измерения уровня глюкозы в крови показали улучшение только для группы RET с точки зрения значений глюкозы в крови через 2 часа (14%) и площадь под кривой (21%). Липидный профиль крови также улучшился (8%). Из образцов биопсии мышц, полученных с использованием гистохимии, количество волокна типа IIa увеличивалось, а тенденция к уменьшению IIx в группе RET отражала изменение до более окислительного профиля с точки зрения состава волокон. Вестерн-блот (для определения содержания белка, связанного с сигнализацией синтеза мышечного белка) показал увеличение на 69% как у Akt, так и mTOR в группе RET; Это также показало увеличение митохондриальных белков для комплекса OXPHOS II и цитрат-синтазы (как ~ 30%), так и для комплекса IV (90%) только в группе RET. Мы демонстрируем, что этот тип прогрессивной тренировки сопротивления предлагает различные улучшения ( например, сила, сила, аэробная способность, толерантность к глюкозе и профиль липидов в плазме).
Introduction
Старение связано с потерей мышечной массы (саркопения), силой и силой. Сниженная сила и, возможно, еще более важно, сила, приводит к неподвижности, повышенному риску травмы и снижению качества жизни. Сопротивление - это хорошо известная стратегия противодействия саркопении и ухудшению мышечной функции. Грубая оценка мышечной силы может быть получена из нагрузки или количества достигнутых повторений. Однако в этом исследовании была получена более подробная и точная информация о функции мышц с использованием изокинетического динамометра для сбора информации о крутящем моменте при изометрическом, концентрическом и эксцентрическом сжатии, а также о кинетике развития силы.
Аэробная емкость, как на уровне всего тела (VO 2max ), так и в скелетных мышцах, снижается у пожилых людей. Снижение частоты сердечных сокращений с возрастом объясняет значительную часть снижения VO 2max 1 , но уменьшаетОкислительная способность, в основном связанная с уменьшенной физической активностью 2 , вносит свой вклад. Нарушенная митохондриальная функция может также участвовать в развитии саркопении и резистентности к инсулину 3 . Мышечная аэробная способность оценивалась в биопсиях мышц посредством биохимического анализа содержания митохондриальных ферментов и белковых комплексов, расположенных как в матрице ( например, цитратсинтазе), так и в внутренней мембране митохондрий. Кроме того, гистохимические методы были использованы для измерения влияния тренировки сопротивления на морфологию мышц ( т. Е. Состав типа волокна, площадь поперечного сечения волокна и плотность капилляров). Альтернативным методом оценки мышечной аэробной способности было бы использование магнитно-резонансной спектроскопии для измерения скорости ресинтеза креатинфосфата после истощения, вызванного упражнениями 4 . Этот метод обеспечивает оценку in vivo мышечной аэробной емкостиНо не могут различать дисфункцию митохондрий и нарушения кровообращения. Кроме того, высокие затраты на оборудование ограничивают использование этого метода в большинстве лабораторий. Аэробная емкость (VO 2max и плотность митохондрий) может быть улучшена благодаря выносливости у молодых и пожилых людей 5 , 6 . Однако эффект тренировки резистентности по этим параметрам был менее изучен, особенно у пожилых людей, и результаты противоречивы 7 , 8 , 9 , 10 .
Диабет типа 2 является распространенным заболеванием у пожилых людей. Физическая инертность и ожирение являются основными факторами, связанными с образом жизни, объясняющими увеличение заболеваемости диабетом типа 2. Аэробные упражнения с низкой интенсивностью часто рекомендуются пациентам с пониженной толерантностью к глюкозе. Однако это неКак силовые тренировки у пожилых людей влияют на толерантность к глюкозе / чувствительность к инсулину 11 , 12 . Самый точный способ измерения чувствительности к инсулину - использовать метод зажима глюкозы, где уровень глюкозы в крови поддерживается постоянным путем вливания глюкозы в условиях повышенного инсулина 13 . Недостатки этой методики заключаются в том, что она требует много времени и инвазивна (артериальная катетеризация) и требует специальных лабораторных установок. В этом исследовании использовался тест на толерантность к глюкозе, который является общим для медицинских единиц. Этот метод подходит, когда несколько предметов подлежат исследованию в течение ограниченного периода времени.
Тестирование и график экспериментальной процедуры можно резюмировать следующим образом. Используйте три отдельных дня для тестирования до и после восьминедельного периода с одинаковой компоновкой и приблизительными расписаниями (≥24 часа между днями, < Strong> Рисунок 1). В первый испытательный день измерьте: антропометрические данные, такие как высота, масса тела, масса без жира (FFM) и окружность верхней ноги ( т. Е. На 15 см выше верхушечной коленной чашечки в расслабленном положении на спине); Субмаксимальная цикличность; И силы коленного сустава, как описано в шагах 4 и 5. Возьмите биопсию мышц из бедра во второй день испытаний. Дальнейшие описания см. В пункте 6.1. Протестируйте огрузочную толерантность к глюкозе (OGTT) в последний день тестирования. Дальнейшие описания см. В п. 7.1. Попросите всех участников избегать энергичной физической активности в течение 24 часов и быстро переносить ночь перед каждым испытательным днем. Однако попросите их избегать интенсивной физической активности в течение 48 часов до дня тестирования OGTT. Попросите их следовать их обычной повседневной физической активности и привычкам к диете. Обратите внимание, что до и после вмешательства, обе группы, принимающие участие в группах, и виды продуктов питания не изменились.
Figimg "src =" / files / ftp_upload / 55518 / 55518fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Экспериментальный протокол. Принципиальная схема. Время между тремя предварительными и пост-тестами было одинаковым для каждого субъекта и составляло не менее 24 часов. Более подробная информация приведена в тексте. Эта цифра была изменена от Frank et al. Сканд. J. Med. Sci. Спорт . 2016: 26, 764-73. 28 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Это исследование предназначалось для исследования влияния краткосрочной тренировки резистентности у пожилых людей на мышечную окислительную способность и толерантность к глюкозе. Вторая цель состояла в том, чтобы изучить влияние на качественные улучшения силы, мощности и мышц ( т. Е. Белки, участвующие в клеточной передаче сигналов и составе типа мышечного волокна).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Региональный комитет по этике Стокгольма, Швеция, одобрил проект расследования.
1. Материал
- Привлечение относительно здоровых женщин и мужчин в возрасте 65-80 лет, имеющих ИМТ, составляет от 20 до 30 кг · м -2 . Рандомизируйте их на две группы. Убедитесь, что люди в обеих группах имеют относительно низкий уровень физической активности ( т. Е. Умеренная ежедневная физическая активность и регулярная тренировка).
- Исключайте пользователей бета-блокаторов и пациентов с болезнью коронарных артерий и тяжелыми неврологическими или совместными проблемами.
- Попросите испытуемых получить их письменное согласие, сообщив им о возможном дискомфорте и рисках на тестовых и учебных занятиях.
- Баланс тренировки сопротивления (RET) и контроль без групп обучения (CON) с точки зрения возраста, пола и ИМТ. Попросите одну группу выполнить RET под тренером в течение 1 часа три раза в неделю в течение восьми недель; Другая группа будет выполнять функцииLs (CON).
2. Тестирование и обучение
Примечание: восемь упражнений - это стандартные упражнения по силовому упражнению: сидящий нож для ног, сидящий грудной молоток, пресс для сундуков грудной клетки, посадочное место на спине, сидячий плечевой пресс, сидячий гребля, посадочное расширение для ног (расширение колена) и склонность к ногам (сгибание колена) ; См. Рисунок 8 в разделе «Репрезентативные результаты».
- Во время первой тренировки оценивайте максимальную силу при одном максимальном повторении (1 RM) для каждого тренировочного упражнения.
ПРИМЕЧАНИЕ. Модель 1 RM обычно используется и определяется как нагрузка, при которой объект может поднимать или толкать сопротивление только один раз, но не дважды.- Перед началом попросите участника выполнить небольшую разминку (с несколькими начальными испытаниями при очень малой нагрузке) испытанного упражнения. Впоследствии увеличьте нагрузку до чуть ниже вероятного значения 1 RM (чаще всего максимум 3-4 увеличиваетсяОбъявления). Зарегистрируйте максимальную нагрузку, которую объект может выполнять только один раз (= 1 RM).
- Измерьте 1 RM в восьми стандартных тренировочных упражнениях (см. Рисунок 8 в разделе «Репрезентативные результаты»). Попросите испытуемых отдохнуть в течение не менее 2-3 минут между каждым испытанным упражнением.
ПРИМЕЧАНИЕ. Во всех учебных учениях использовались силовые тренажеры, в том числе тесты каждого тренировочного упражнения.
- Попросите всю группу RET выполнить 1 ч контролируемой тренировки по силе три раза в неделю в течение восьми недель. Попросите участников выполнить после разминки восемь вышеупомянутых стандартных учебных упражнений. Они должны повторять упражнение 12 раз в каждом наборе и выполнять три набора каждого упражнения. Разрешить отдых в течение 1 мин между каждым набором и 2-3 мин между каждым упражнением.
- Попросите испытуемых выполнить каждое упражнение как можно быстрее во время концентрической фазы ( т.е. фазы сокращения мышц) и медленно во времяЭксцентрическая фаза ( т.е. фаза удлинения мышц).
ПРИМЕЧАНИЕ. Субъекты могут выполнять упражнения в любом порядке. Однако попросите их начать и завершить упражнение на ноге, а также попытаться выполнить восемь упражнений в представленном порядке. Используйте силовые тренажеры для всех восьми упражнений. - Во время каждой тренировки попросите участников выполнить три набора в 75-80% от 1 RM для каждого упражнения. Увеличьте нагрузку примерно на 5% после сеанса, когда участник может выполнить 12 повторений во всех трех наборах упражнений.
- Попросите испытуемых выполнить каждое упражнение как можно быстрее во время концентрической фазы ( т.е. фазы сокращения мышц) и медленно во времяЭксцентрическая фаза ( т.е. фаза удлинения мышц).
3. Субмаксимальный велоспорт
Примечание. Выполняйте тест субмаксимального циклирования в тестовый день 1 (см. Введение и рисунок 1 ).
- Выполните тест велоэргометра, включая два субмаксимальных уровня, каждый в течение 4 минут 14 , 15 . Установите первую скорость работы (30 Вт), а вторую - на 60-120 Вт, без паузы между нагрузками на велоэргометр.
ПРИМЕЧАНИЕ. Первая нагрузка одинакова для всех субъектов, но второй и последний субмаксимальный уровень должен составлять приблизительно 65-85% от максимальной частоты сердечных сокращений для каждого испытуемого. Обе нагрузки должны быть одинаковыми до и после интервала вмешательства 8 недель обучения.- Основой второго уровня нагрузки на экзаменах по ознакомлению, проведенных перед испытаниями, путем выяснения того, насколько физически активен человек, и того, что субъект первоначально начал цикл на короткое время; Контрольный лидер сформирует мнение, основанное на частоте сердечных сокращений субъекта, относительно того, какая конечная субмаксимальная нагрузка является подходящей.
- Запишите среднюю постоянную частоту сердечных сокращений (HR) с помощью монитора сердечного ритма через пояс грудной клетки в течение последней минуты при низких и высоких рабочих скоростях, взяв среднее значение наблюдаемого HR в 3:15, 3:30, 3:45 , И 4:00 мин при каждой рабочей скорости.
- Используйте эрго-спирометрическое устройство для определения состава газа (O 2 и CO 2 т. Е. CO 2 / O 2 ), и определите средние значения RER в течение последней минуты (из четырех мер каждые 15 с) при обеих нагрузках рабочей нагрузки.
4. Сила растяжения колена: статический, эксцентричный и концентрический пиковый крутящий момент и скорость развития силы
Примечание: выполните измерения прочности колена в день испытания 1 (см. Введение и рисунок 1 ).
- Перед записью попросите испытуемого выполнить разминочную обработку на велосипеде в течение 8-10 минут на велоэргометре на уровне субмаксимального уровня (т.е. примерно 65-85% от максимальной частоты сердечных сокращений).
- Попросите субъекта сесть на скамью изокинетического динамометра. Закрепите сундук объекта ремнями на плечах и бедрах. Надежно закрепите хвостовик объекта на валу динамометра двумя ремнями: один под коленом, а один - только abovE лодыжки. Совместите ось коленного сустава с центром вращения вала динамометра.
- Когда объект защищен, оцените максимальную добровольную силу колена как максимальный крутящий момент, при этом субъект сидит в изокинетическом динамометре. Первоначально разрешить испытуемому выполнить несколько испытаний для ознакомления с оборудованием прочности колена (изокинетический динамометр).
- Попросите человека выполнить четыре максимальных добровольных эксцентричных и концентрических расширения колена (поочередно), с правой ногой с постоянной угловой скоростью 30 град / с. Установите диапазон движения между 90 ° и 15 ° (прямой ногой = 0 °).
- В эксцентричной задаче попросите испытуемого сопротивляться валу динамометра с максимальным усилием всего движения от угла колена до 15 °. В концентрической задаче попросите испытуемого надавить на нижнюю ногу в вал динамометра на удлинение колена, насколько это возможно, во всем диапазоне движения.
- Разрешите 4-минутный отдых после динамических записей. Затем оценивайте статический максимальный произвольный момент сжатия (MVC) четыре раза при 65 ° коленном угле. В каждом статическом испытании попросите испытуемых, сидящих на одном и том же динамометре, как можно быстрее и сильнее ударить по валу динамометра, который теперь фиксируется (при 65 °) и не может быть перемещен.
- Для сигналов крутящего момента (силы) преобразуйте аналоговые сигналы крутящего момента в цифровой, используя аналого-цифровой преобразователь, подключенный к изокинетическому динамометру.
ПРИМЕЧАНИЕ. Преобразователь автоматически изменяет аналоговые сигналы от динамометра на цифровые сигналы, которые затем автоматически экспортируются на компьютер, на котором собираются данные.- Установите частоту дискретизации на частоте 5 кГц в программе анализа программного обеспечения компьютера. Сохраните цифровые сигналы на компьютере для последующего анализа значения силы с помощью программы анализа программного обеспечения.
- В последующем анализе используйтеНаивысшее значение, полученное из четырех испытаний для каждого испытуемого в эксцентрических, концентрических и статических измерениях. В программном обеспечении щелкните самое высокое значение четырех испытаний и запишите значение силы, показанное на экране компьютера.
- Зарегистрируйте самый высокий пиковый крутящий момент в эксцентрике и в концентрических записях для каждого предмета и наивысшем значении силы среди четырех статических испытаний.
ПРИМЕЧАНИЕ. Изокинетическое динамометрическое испытание прочности разгибателя колена в сидячем положении имеет надлежащую надежность и достоверность 16 , 17 .
- Зарегистрируйте самый высокий пиковый крутящий момент в эксцентрике и в концентрических записях для каждого предмета и наивысшем значении силы среди четырех статических испытаний.
- Измерьте скорость создания силы (крутящего момента) (RFD) в течение 0-30 мс и 0-200 мс в наивысшем значении, найденном среди статических испытаний. Установите значение нуля на уровне 7.5-Нм для начала сжатия для силы разгибателя колена (время: 0 мс) 18 , 19 . Переместите курсор (в программе для мышцАнализ прочности) до значения «7.5 Нм» на y-шкале, чтобы получить положение для 0 мс.
- Для предварительной проверки установите курсор на значение 30 мс (после времени 0 мс). Запишите значение, показывающее повышение в Нм при 30 мс ( т. Е. Увеличение Nm от 7,5 Нм = 0 мс). Сделайте ту же процедуру для значения после теста.
- Рассчитайте увеличение процента для значения пост-теста Nm (числитель) по сравнению с предтестовым значением Nm (знаменателем) за период 0-30 мс. Таким образом, предъявите RFD в процентах от предварительного теста до посттеста. Проделайте те же анализы для временного интервала 0-200 мс.
5. Мышечная биопсия
Примечание. Выполняйте биопсию мышц в день испытания 2 (см. Введение и рисунок 1 ).
- Возьмите биопсию мышц из средней части бедра мышц бедра, используя conchotome 20 .
- Перед биопсией подкожно вводите 1-2 мл местной анестезии и в фасцию. Через пару минут сделайте надрез с маленьким скальпелем через кожу и фасцию, примерно на 1/3 расстояния от коленной чашечки до переднего верхнего подвздошного отдела позвоночника. Извлеките около 100-150 мг мышечной ткани, используя conchotome.
- Образцы замораживания для гистохимии в изопентане охлаждают до точки замерзания в жидком азоте и сохраняют при -80 ° C. Храните образец 30-50 мг мышечной ткани.
- Быстро заморозить образцы для анализа белка в жидком азоте и хранить их при -80 ° C. Храните образец 30-50 мг мышечной ткани.
6. OGTT
Примечание. Выполняйте OGTT (тест на толерантность к глюкозе в крови) в день испытания 3 (см. Введение и рисунок 1 ). Время между упражнением и OGTT должно превышать 48 часов и должно быть аналогичным между до и после-тестов. 2-часовой устный OGTT используется для исследования того, показывают ли частые образцы крови в это время нормальные или повышенные уровни, указывающие на диабет или преддиабельные состояния.
- Выполните тест OGTT утром по предметам, которые постились всю ночь и не делали никаких напряженных упражнений в день тестирования или накануне.
- Возьмите образцы крови (4 мл) от участников на спине через венозную канюлю в антекубитальной вене 15 минут до и непосредственно перед введением глюкозы, а затем 15, 30, 60, 90 и 120 минут после приема глюкозы ( 75 г глюкозы в 250 г / л раствора).
- Центрифугировать образцы крови при 1500 xg и 4 ° C в течение 10 минут и хранить плазму при -20 ° C для будущего анализа. Используйте образцы для выполнения стандартных тестов уровня глюкозы (шаг 7).
- Для глюкозы, инсулина и c-пептида вычислите площадь под кривой (AUC), определив интеграл времени глюкозы над базальным уровнем глюкозы. Использовать результаты OGTTДля расчета чувствительности к инсулину для всего тела с использованием метода Мацуды 21 , согласно уравнению: 10 000 * √ [(базальты глюкозы * базальты инсулина) * ( среднее значение глюкозы * среднее значение инсулина).
7. Анализ образцов крови
- Определите концентрацию глюкозы в венозной плазме с помощью автоматизированного анализатора. Установите уровень нарушения глюкозы в крови на уровне глюкозы в крови> 7,8 ммоль / л после 2-часовой OGTT 22 .
- Используйте комплекты ELISA 22 для проведения плазменного анализа инсулина и c-пептида. Используйте планшет. Поместите пластины ELISA для инсулина и c-пептида в планшет-ридер (каждый в отдельном случае).
ПРИМЕЧАНИЕ. Читатель пластины измеряет количество инсулина и количество c-пептида путем измерения образцов на пластине при определенных поглощениях. Липиды крови TG, HDL, аполипопротеин A1 и аполипопротеин B анализировали стандартными методами приКаролинская университетская больница, Стокгольм, Швеция.
8. Анализ образцов мышц
- иммуноблоттинг
- Во-первых, замораживать сухой образец мышцы в лиофилизаторе при давлении ниже 10 -1 мбар в течение 12 часов. Рассекайте его так, чтобы он был свободен от крови и соединительной ткани, используя иглу и щипцы под световым микроскопом. Хранить при температуре -80 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ. Подходящее количество мышц составляет от 1 до 5 мг сухого веса, но протокол можно довести до менее 1 мг, вплоть до отдельных волокон. Из-за небольшого количества мышечной ткани, присутствующей в одной биопсии, значения от этого участника RET не использовались для иммуноблоттинга. - Гомогенизировать образцы мышц (80 мкл / мг), состоящий из 2 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES), 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 5 мМ этиленгликоль-бис (Β-аминоэтиловый эфир) -N, N, N ', N'-тетраацет(EGTA), 10 мМ MgCl 2 , 50 мМ ß-глицерофосфат, 1% TritonX-100, 1 мМ Na 3 VO 4 , 2 мМ дитиотреитола, 20 мкг / мл леупептина, 50 мкг / мл апротинина, 1% ингибитора фосфатазы Коктейль и 40 мкг / мкл PMSF (фенилметилсульфонилфторид).
- Поместите совок из 0,5 мм гранул оксида циркония в каждую пробирку с мышцей. Добавить буфер и гомогенизировать в течение 2 х 1 мин на шаге 7-8 (здесь максимум равен 10) и 4 ° С.
- Центрифугируют гомогенат в течение 10 мин при 10000 х g. Перенесите оставшийся супернатант в новые трубки и отбросьте осадок, содержащий структурные белки.
- Спектрофотометрически определяют концентрацию белка в супернатанте с помощью коммерчески доступного набора с использованием планшетного ридера при 660 нм 23 .
- Затем разбавляют образцы с помощью 2-х буфера для образцов Laemmli и гомогенизирующего буфера (1: 1) до конечной концентрации белка 1,5 мкг /# 181; л. Нагреть их до 95 ° С в течение 5 мин для денатурации белков. Храните разбавленные образцы при -20 ° C перед анализом.
- Для электрофореза на основе полиакриламидного геля (PAGE) загружайте 30 мкг белка из каждого образца в 18-луночные гранулы-градиенты (4-20% акриламида) и проводите электрофорез при 300 В в течение 30 мин на льду.
- Уравновешивают гель в переносном буфере (25 мМ Трис-основание, 192 мМ глицин и 10% метанол) в течение 30 мин при 4 ° С. Перенесите белки в мембраны поливинилиденфторида с размерами пор 0,2 мкм при постоянном токе 300 мА в течение 3 ч при 4 ° С.
- Чтобы подтвердить равную загрузку и перенос, окрашивайте мембраны общим пятном белка 24 . Для каждого целевого белка загружать все образцы от каждого субъекта на один и тот же гель и одновременно запускать все гели.
- Блокируют мембрану в течение 1 часа при комнатной температуре в трис-буферном солевом растворе (20 мМ Трис-основание, 192 мМ NaCl, TBS, pH 7,6), содержащем5% обезжиренного молока.
- Инкубируйте мембраны в течение ночи с первичными антителами (см. Список материалов), разведенными в TBS, содержащем 2,5% обезжиренного молока и дополненным 0,1% Tween-20 (TBS-TM).
- После первичной инкубации антител промыть мембраны (2 х 1 мин плюс 3 х 5 мин) с помощью TBS-TM и инкубировать со вторичными антителами (см. Список материалов), конъюгированных с пероксидазой хрена, в течение 1 часа при комнатной температуре. Снова промойте TBS-TM (2 х 1 мин и 3 х 10 мин) и снова подвергайте их четырем дополнительным 5-минутным промывкам с TBS.
- Нанесите 6-12 мл хемилюминесцентного субстрата на мембрану в течение 5 мин. Поместите мембрану между двумя прозрачными пластиковыми листами. Поместите мембраны перед камерой CCD, блокирующей внешний свет. Возьмите серийные экспозиции с использованием хемилюминесцентного фильтра камеры.
- Используйте программное обеспечение для получения 10 экспозиций в течение 2 минут или до тех пор, пока сигналы не будут насыщены. Используйте стандартную настройку, как для настроек оптического фильтра tO получить хемилюминесценцию, а также настройки объектива.
- Используйте самую высокую экспозицию, которая не приводит к насыщению и не помещает контуры полосы. Определите диапазоны как интенсивность x мм 2, используя одно и то же программное обеспечение. Вычтите фоновый шум из интенсивности полосы. Представьте результаты относительно общего содержания белка и выражайте его как процентное изменение по сравнению с исходным уровнем.
- Во-первых, замораживать сухой образец мышцы в лиофилизаторе при давлении ниже 10 -1 мбар в течение 12 часов. Рассекайте его так, чтобы он был свободен от крови и соединительной ткани, используя иглу и щипцы под световым микроскопом. Хранить при температуре -80 ° C.
- гистохимия
ПРИМЕЧАНИЕ. Ниже приведен метод гистохимии, основанный на методах, описанных в более ранней публикации 25 .- Для гистохимии разрезают серийные сечения (10 мкм) при -20 ° С с использованием криостата. Установите поперечные сечения на стеклянных горках, хранящихся в стеклянной кювете, и высушите на воздухе срезы для биопсии при комнатной температуре.
- Подготовьте буферные растворы для каждого уровня рН для предварительной инкубации при рН 4,3, 4,6 и 10,3 для окрашивания АТФазой 26 . Для визуализации капилляров, staВ поперечном сечении с использованием метода амилазы-ПАС 27 .
- Откалибруйте pH-метр путем заливки калибровочных растворов в маркированные калибровочные стаканы. Нажмите соответствующую кнопку, чтобы выбрать значение pH из главного меню.
- Промойте зонд деионизированной водой и поместите зонд в первый калибровочный стакан. Убедитесь, что в мембране нет пузырьков воздуха. Измерить первое решение для калибровки, а затем представить следующее калибровочное решение (на дисплее будет предложено следующее решение).
- Промойте зонд деионизированной водой, а затем поместите его во второй калибровочный стакан. Убедитесь, что в мембране нет пузырьков воздуха. Измерить второй калибровочный раствор и перейти к следующему калибровочному раствору.
- Промойте зонд деионизированной водой и поместите его в третий калибровочный стакан. Убедитесь, что в мембране нет пузырьков воздуха. Измерить третий калибровочный раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ. Когда калибровкаХорошо, дисплей на короткое время отобразит «3- й буфер« OK »и затем вернется в главное меню.
- Используйте буферы следующим образом для окрашивания ATPase.
- Для получения раствора при рН 10,3 используют два разных раствора: (A) 4,506 г глицина, 4,8 г CaCl 2 , 3,51 г NaCl и 600 мл dH 2 O и (B) 2,176 г NaOH и 540 мл DH 2 O. Храните растворы в холодильной или холодильной камере. Используйте их в течение одного месяца.
- Для приготовления растворов при рН 4,3 и 4,6 выполняют «предварительную инкубацию кислоты». Подготовьте кислоту для предварительной инкубации, используя: 6,47 г Na-ацетата, 3,7 г KCl и 500 мл dH 2 O. После этого готовьте 1% -ный раствор CaCl 2 , растворяя 2,5 г его в 250 мл dH 2 O. Подготовьте 2 % CoCl 2 путем растворения 5 г его в 250 мл dH 2 O.
- Храните и используйте эти решения, как указано выше. Наконец, подготовьте 0,2% сульфида аммонияСмешивая 800 мкл 20% (NH 4 ) 2 S в 40 мл dH 2 O. Подготовьте последний свеже.
- Подготовьте растворы при определенных значениях рН следующим образом. После калибровки рН-метра удалите из холодильника кюветы, хлориды кальция и кобальта и дайте им нагреться до комнатной температуры до окрашивания.
- Для pH 10.3 добавьте около 25 мл раствора А в маленький (приблизительно 70 мл) стеклянный стакан. Измерьте pH. Продолжайте добавлять раствор B до достижения требуемого рН 10,37. Если окраска слишком темная, увеличьте pH. Если он слишком яркий, уменьшите pH.
- Для рН 4,6 добавляют около 25 мл «кислотной предварительной инкубации» в маленький стеклянный стакан. Измерьте pH. Уменьшите pH, используя 5 М уксусную кислоту . Если изображение пятна слишком темное, попробуйте осветлить его с увеличением pH. Если он слишком яркий, темнеет при пониженном рН. Если окрашивание не помогает, попробуйте другой pH: 4.8 instEad 4.6.
- Для рН 4,3 делают то же, что и для 4,6, но добавляют больше уксусной кислоты. Уменьшите значение pH, если пятно слишком яркое, и увеличьте значение pH, если слишком темно для определения волокон.
- Подготовьте раствор АТФ следующим образом. Взвешивают 0,017 г АТФ на кювету (10 мл), поэтому 0,051 г на 3 кювета или 0,068 г для 4 кювет. Возьмите 30 мл (для 3 кювет, 10 мл / кювету) раствора при рН 10,3 (используйте стекло цилиндра) и положите его в стеклянный стакан со взвешенным АТФ.
- Тщательно перемешайте и измерьте pH. Уменьшите pH с помощью концентрированной HCl до тех пор, пока pH не достигнет ровно 9,40.
- Для инкубации при различных значениях рН сделайте следующее. Поместите 10,3 раствора в одну кювету и инкубируйте ее на водяной бане при 37 ° С в течение 9 мин. Поместите раствор 4.3 в другую кювету и инкубируйте ее при комнатной температуре в течение 5 мин. Поместите 4.6 раствор в последнюю кювету и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 мин.
- После предпочтительного рНИнкубации, применяйте содержимое каждой кюветы следующим образом. Промывают 15 раз с помощью dH 2 O. Добавьте к образцу биопсии раствор АТФ (0,170 г АТФ / 100 мл H 2 O). Инкубировать на водяной бане при 37 ° С в течение 30 мин. Промыть 15 раз с помощью dH 2 O.
- Добавьте раствор CaCl 2 (1 г CaCl 2/100 мл H 2 O) к образцу биопсии в кюветах. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 3 мин. Промыть 15 раз dH 2 O. Добавить раствор CoCl 2 (2 г CoCl 2/100 мл H 2 O) в образец для биопсии в кюветах. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 3 мин. Промыть 15 раз с помощью dH 2 O.
- Поместите его в раствор (NH 4 ) 2 S в течение 30 с и быстро промойте 15 раз под вытяжным шкафом. Приклейте кусочки биопсии на стекло. Чтобы избежать пузырей, сжать биопсии, но не слишком сложно.
- Выберите одну область поперечного сечения без артефактов или продольных разрезов волокна. Анализ под литомGht с помощью программного обеспечения.
- Оцените площадь поперечного сечения (CSA), капилляры и классификацию типа волокна ( например, тип I, IIA или IIX) с помощью компьютерного анализа изображений из среднего по меньшей мере 150-200 волокон на биопсию. Из изображения микроскопа мышечных волокон в поперечном сечении гарантируется, что три типа мышечных волокон ( например, тип I, IIA и IIX) имеют различные оттенки от белого до серого до черного, в зависимости от pH-окрашивания ( т. Е. 4,34, 4,65 и 10,37).
- Начните с маркировки некоторых волокон типа I. После этого программа автоматически зарегистрирует другие волокна типа I. Убедитесь, что все волокна типа I отмечены правильно. Чтобы отметить определенное волокно, нажмите кнопку «Вектор». Используйте курсор для измерения площади для каждого индивидуально выбранного мышечного волокна.
- После анализа волокон типа I продолжите ту же процедуру для типов IIA и типа IIX. Среднее ± SEM для каждого типа мышечного волокна ( т. Е. Тип I, IIA и IIX) следует рассчитать относительно количества волокна и CSA для групп RET и CON.
Примечание: площадь поперечного сечения (CSA), капилляры и классификация типа волокна ( например, тип I, IIA и IIx) оценивались по среднему значению 163 ± 9 волокон на биопсию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
материал
В исследовании участвовали 21 относительно здоровые женщины и мужчины в возрасте 65-80 лет и с показателями ИМТ от 20 до 30 кг · м -2 и были рандомизированы на две группы. Лица в обеих группах имели относительно низкий уровень физической активности ( т. Е. Умеренный уровень повседневной физической активности и отсутствие регулярных тренировок). Одна группа (n = 12, 6 женщин и 6 мужчин) выполняла RET под тренером в течение 1 часа три раза в неделю в течение восьми недель, а другая группа выполняла функции контроля (n = 10, 5 женщин и 5 мужчин). Группы RET и CON были сбалансированы по возрасту, полу и ИМТ ( таблица 1 ). В группу RET было набрано больше предметов, чтобы компенсировать выпадение; Больше ожидалось в группе RET над группой CON.
</ TD> | RET (n = 12) | CON (n = 9) | |||
до | После | до | После | ||
Возраст (лет) | 71,4 ± 1,1 | 72,0 ± 1,4 | |||
BMI | 24,6 ± 0,8 | 24,9 ± 0,8 | 23,2 ± 0,8 | 23,2 ± 0,8 | |
Вес (кг) | 70,4 ± 2,9 | 71,1 ± 2,8 | 67,4 ± 3,9 | 67,6 ± 3,9 | |
FFM (кг) | 51,0 ± 2,3 | 52,4 ± 2,1 ** | 47,6 ± 4,1 | 48,6 ± 4,3 | |
Поперечное сечение бедраA (см²) | 188,9 ± 9 | 200 ± 8 *** † | 155 ± 12 | 154 ± 11 | |
Площадь поперечного сечения волокна (см²) | Тип I | 5452 ± 393 | 5567 ± 362 | 4889 ± 323 | 4807 ± 354 |
Тип IIa | 4230 ± 610 # | 4484 ± 434 # | 4114 ± 535 # | 3971 ± 494 # | |
Тип Iix | 3678 ± 634 # | 3554 ± 552 # | 3392 ± 889 # | 2913 ± 427 # |
Таблица 1: Характеристики участников. RET, тренировка сопротивления; CON, управление; ИМТ, масса телаех; FFM, без жира. Значения представлены из 12 (RET) и 9 (CON) объектов, за исключением площади поперечного сечения волокна (RET, n = 10; CON, n = 7) и представлены как среднее ± SEM. **, p <0.01 по сравнению с pre; ***, p <0,001 против pre; †, p <0,05 по сравнению с сообщением CON; †††, p <0,001 по сравнению с сообщением CON; #, P <0,05 по сравнению с типом I. Эта таблица была изменена из Frank et al. Сканд. J. Med. Sci. Спорт . 2016: 26, 764-73. 28
Были исключены бета-блокаторы и люди с заболеваниями коронарной артерии и тяжелыми неврологическими или совместными проблемами. На исходном уровне у некоторых пациентов было высокое кровяное давление (по 2 в каждой группе); Депрессия (по 1 в каждой группе); И лекарства для дислипидемии (2 в RET и 1 в CON), гипотиреоз (1 в RET), ранняя стадия болезни Паркинсона (RET). Лекарства принимались спорадически для астмы (1 в RET) и ревматических проблем (1 в CON). У одного человека был ритмR (CON).
Один объект RET прервал тренировку через 6 недель из-за боли в спине, но все еще был включен в исследование. Один первоначальный объект CON был исключен из-за проблем с коленом во время предварительного испытания прочности. Те, у кого была астма и кардиостимулятор, были исключены из цикла испытаний.
Субъекты дали свое письменное согласие после того, как были проинформированы о возможном дискомфорте и рисках на тестовых и учебных занятиях.
Данные представлены как средство ± SEM. Различия между RET и CON были проверены на статистическую значимость с помощью двухсторонних повторных измерений ANOVA с использованием статистической программы. Когда были показаны значительные основные эффекты или взаимодействия, различия были обнаружены с помощью пост-hoc-анализов (Fisher LSD). Статистическая значимость принималась при p <0,05.
рис. 2А ). Динамометр также показал скорость развития силы (RFD) с увеличением на 52% (на начальном 0-30 мс) для группы RET ( рис. 2B ). Для группы CON концентрация концентричности снижалась во время периода вмешательства. Обучающая нагрузка для RET улучшилась на 19-72% для выполненных тренировочных упражнений.
Рисунок 2: Результаты измерения прочности. Эффект сопротивления exТренировка (RET) или контрольный период (CON) на ( A ) статический (STAT), эксцентричный (ECC) и концентрический (CONC) крутящий момент и ( B ) скорость разработки силы (RFD) в течение 0-30 мс и 0- 200 мс статического удлинения колена. Значения относятся к 12 (RET) и 9 (CON) предметам и представлены как процентное изменение по отношению к базальным значениям (среднее ± SEM). *, P <0,05 по сравнению с pre; **, p <0.01 по сравнению с pre; ***, р <0,001 против пред. Эта цифра была изменена от Frank et al. Сканд. J. Med. Sci. Спорт . 2016: 26, 764-73. 28 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Из образцов биопсии мышц гистохимия указала, что количество волокна типа IIa увеличилось, и наблюдалась тенденция к уменьшению IIx для группы RET. Таким образом, группа RET показала изменение наБолее окислительный профиль с точки зрения состава волокна ( рисунок 3 ). Обратите внимание, что надежные поперечные сечения не могут быть получены из биопсий четырех субъектов (по два от каждой группы), и результаты этих субъектов были исключены.
Рисунок 3: Результаты композиции типа мышц. Эффект тренировки сопротивления ( A , RET) или контрольный период ( B , CON). Значения относятся к 10 (RET) и 7 (CON) предметам и представлены как среднее ± SEM. (*), P = 0,068 по сравнению с pre; **, p <0.01 по сравнению с pre; †, p <0,05 по сравнению с сообщением CON. Эта цифра была изменена от Frank et al. Сканд. J. Med. Sci. Спорт . 2016: 26, 764-73. 28 Пожалуйста, cliCk здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Кроме того, анализ Вестерн-блоттинга для определения содержания белка, связанного с сигнализацией синтеза мышечного белка, показал рост 69% как для Akt, так и для mTOR (мишень млекопитающих рапамицина) среди группы RET ( Рисунок 4A и Рисунок 5 ). Анализ Вестерн-блоттинга также показал, что среди митохондриальных белков увеличение примерно на 30% как для комплекса OXPHOS II, так и для цитрат-синтазы и 90% для комплекса IV в группе RET ( рис. 4B и 5 ). Основными используемыми антителами были mTOR, Akt и OXPHOS. В качестве вторичного антитела использовали антикробитный или антимышиный HRP. Полосы белка для комплекса OXPHOS I были явно не видны, и эти данные были отброшены.
Рисунок 4: Результаты мышечного белка. Эффект тренировки резистентности (RET) или контрольный период (CON) на изменениях содержания мышц белков Akt и mTOR ( A ) и митохондриальных белков ( B ). Akt, протеинкиназа B; MTOR, мишень млекопитающих рапамицина; CS, цитрат-синтазу. Значения представляют собой средства ± SEM из 11 (RET) и 9 (CON) предметов. *, Р <0,05; **, p <0,01; ***, р <0,001 по сравнению с базальным. †, p <0,05; ††, p <0,01; †††, p <0.001 по сравнению с сообщением CON. Эта цифра была изменена от Frank et al. Сканд. J. Med. Sci. Спорт . 2016: 26, 764-73. 28 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
= "/ Files / ftp_upload / 55518 / 55518fig5.jpg" />
Рисунок 5: Вестерн-блот-изображения. Измеренный мышечный белок до и после восьми недель вмешательства. Репрезентативные изображения от одного объекта в группах RET и CON соответственно. Эта цифра была изменена от Frank et al. Сканд. J. Med. Sci. Спорт . 2016: 26, 764-73. 28 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Только группа RET продемонстрировала повышенную аэробную емкость в тесте цикла (после теста). При наивысшей субмаксимальной интенсивности сердечный ритм (HR) показал сильную тенденцию к снижению RET и повышению в группе CON ( рис. 6A ). Кроме того, RER (коэффициент дыхательного обмена = CO 2 / O 2 ) был значительно снижен только для группы RET (Lass = "xfig"> Рисунок 6B).
Рисунок 6: Данные о сердечно-сосудистых заболеваниях. Подготовка до и после тренировки (RET) или контрольный период (CON). ( A ) HR, частота сердечных сокращений и ( B ) RER, коэффициент обмена дыхания при низких (30 Вт) и высоких (60-120 Вт) интенсивности в стационарном режиме. Значения из 11 (RET) и 8 (CON) предметов (два предмета были исключены из-за астмы и использования кардиостимулятора) и представлены как среднее ± SEM. (*) P = 0,056 (RET) и p = 0,068 (CON) против pre; * P <0,05 против пред. Эта цифра была изменена от Frank et al. Сканд. J. Med. Sci. Спорт . 2016: 26, 764-73. 28 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
S = «jove_content» fo: keep-together.within-page = «1»> Результаты группы RET из теста на толерантность к глюкозе показали улучшенный уровень глюкозы в крови, как по значениям крови через 2 ч (14%), так и по площади под Кривая (21%, рисунок 7A ).
Рисунок 7: Плазменная глюкоза во время OGTT. Тест проводился до- (●) и пост- (○) тренировка сопротивления (RET, A ) или контрольный период (CON, B ). AUC глюкозы , площадь под кривой для глюкозы в плазме. Значения относятся к 12 (RET) и 9 (CON) предметам и представлены как среднее значение (глюкоза в плазме) и среднее ± SEM (AUC глюкоза) . * P <0,05 против пред. Эта цифра была изменена от Frank et al. Сканд. J. Med. Sci. Спорт . 2016: 26, 764-73. 28Rce.jove.com/files/ftp_upload/55518/55518fig7large.jpg «target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Липидный профиль крови улучшился для группы RET с уменьшением аполипопротеина B (8%). Для CON было обнаружено увеличение (10%). Кроме того, жировая масса (FFM) увеличилась на 3%, а площадь поперечного сечения бедра (CSA) - на 7% для группы RET ( таблица 1 ). Оцененные улучшения, наблюдаемые после непродолжительного периода прогрессивной силовой тренировки в митохондриальной функции, аэробной способности, толерантности к глюкозе, мышечной силы и мощности, крайне желательны для здоровья у пожилого населения.
Восемь силовых тренировочных упражнений показаны на рисунке 8 . Каждая учебная задача выполнялась 12 раз в каждом из трех наборов на каждой тренировке 3 раза в неделю в течение восьми недель.
Рисунок 8: Восемь учебных упражнений. Упражнения выполнялись при 75-80% от 1 РМ, 12 раз / набор, с тремя наборами упражнений и тренировок. Упражнениями были: «пресс для ног» и «абдоминальные судороги» ( A ), «грудной пресс» и «обратные расширения» ( B ), «плечевой пресс» и «сидячие гребля» ( C ), и «удлинения ног», Ногами »( D ). Здесь показан диапазон движений в силовых тренировках. В сидячем брюшном хрусте сундук должен быть перемещен из вертикального положения на 60 ° вперед сгибание ствола. В сидячем заднем удлинителе багажник из почти вертикально расположенного положения перемещается назад в горизонтальное положение багажного отделения. Как сидячие упражнения, ножные пресса, так и ногаNs, выполнялись с ног в 90 ° сгибания колена и заканчивались непосредственно перед выпрямлением ног (около 0 ° в коленях). Ноги закручиваются (в положении лежа), где делаются от почти выпрямленных ног примерно до 100 ° сгибания колена. И сидячие упражнения, и пресс для грудной клетки, и плечевой пресс, выполнялись от сгибания локтя 90 ° до того, как руки были выпрямлены (около 0 °). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании был использован ряд методов для исследования эффектов краткосрочной прогрессивной тренировки по мышечной функции / морфологии пожилых людей, аэробной способности и толерантности к глюкозе. Основной вывод заключался в том, что по сравнению с контрольной группой было много улучшений в мышечной аэробной способности, толерантности к глюкозе, силе, мощности и качестве мышц ( т. Е. Белке, участвующем в клеточной передаче сигналов и составе мышечных волокон). Увеличение, например, наблюдалось для: статической, эксцентричной и концентрической максимальной силы растяжения колена (8-12%); Тренировочные нагрузки (19-72%), максимальная скорость создания силы (RFD) в начальных 0-30 мс (52%); Несколько митохондриальных белков (30-90%); Белки Akt и mTor, участвующие в синтезе мышечных белков (оба - 69%).
Пожилые люди могут испытывать трудности с устойчивым здоровьем во время такого проекта. Необходимо знать риск различных травм из-за testiИ обучение среди нетренированных пожилых людей. Один человек из группы RET в конце учебного периода имел рецидив прежних проблем со спиной. Тем не менее, никакая травма или дискомфорт, возникающие во время учебного проекта, не оставались в течение длительного времени после окончания расследования среди старых участников. Иногда могут быть внесены изменения в отношении того, когда, сколько и как интенсивно проходить обучение. Что касается режима силовой тренировки, предпочтительно, чтобы тренер регистрировал нагрузку, полученную для каждого тренировочного упражнения, и предмет на каждой тренировочной сессии, чтобы в течение всего периода можно было следить за надлежащей прогрессией. Во время измерения прочности с изокинетическим динамометром важно избегать любых ошибок в процедуре измерения, чтобы пожилые люди не пропустили своих максимальных характеристик во время испытаний. По этой причине важно иметь разминки. Используйте 8-10 минут езды по эргометру на подмаксимальных уровнях перед измерением прочностиС последующими начальными испытаниями в качестве процедуры ознакомления в динамометре для записей прочности колена. Кроме того, рекомендуется записывать четыре записи во время записи каждого типа сокращения мышечной силы; Может быть выбрано максимальное значение. Также очень важно изучить модификацию оценки прочности относительно скорости при достижении мощности испытательного параметра. В частности, увеличение мощности является важным фактором улучшения здоровья пожилых людей. Что касается биопсии, испытуемым предлагается избегать аспирина или других антикоагулянтов до и после биопсии. Что касается определения площади мышечного волокна в двухкратных биопсиях из одной и той же ноги для типа I, типа 2A и типа 2B, то сообщаемые ошибки составляют около 10, 15 и 15%, соответственно 29 . Это необходимо учитывать при оценке такого анализа с помощью биопсии мышц.
Ограничения включают проблемы, связанные с западным bмного; Метод не дает информации о локализации белка и сильно зависит от специфичности и качества антитела (основная проблема). Многоэтапный анализ увеличивает риск ошибок и усугубляет устранение неполадок. Однако есть несколько преимуществ вестерн-блоттинга: он относительно дешев и быстр; Он дает высокий выход данных по отношению к количеству требуемой ткани; Один получает информацию об экспрессии белка и размере белка; И, наконец, коэффициент вариации обычно составляет менее 5%. Период силовой тренировки составлял всего восемь недель, и более поздние последующие меры не проводились с этими пожилыми людьми. Тесты на толерантность к глюкозе, основанные на питьевых растворах глюкозы (OGTT), не считаются подходящими, как если глюкоза вводится непосредственно в кровь. Однако метод, используемый с OGTT, дешевле, проще в управлении и широко используется в клинике. Что касается мер прочности с изокинетическим динамометром, Изучались только мышцы, способствующие усилению разгибания колена, а не другие основные группы мышц тела.
В дополнение к повышению прочности, тренировка сопротивления также улучшала толерантность к глюкозе и мышечную окислительную способность. Было отмечено значительное увеличение учебной нагрузки для каждого выполненного упражнения (19-72%), что свидетельствует о том, что тренировка сопротивления позволила существенно улучшить общую силу. Измерения с изокинетическим динамометром предоставили более подробную информацию о функции разгибателя колена. Крутящий момент при статическом, эксцентричном и концентрическом сжатии увеличился на 8-12%. Кроме того, тренировка сопротивления привела к значительному увеличению (52%) скорости развития силы (RFD) во время начальной фазы сжатия (0-30 мс), тогда как она не изменилась между 0-200 мс. Протокол обучения хорошо переносился и, вопреки нашим ожиданиям, в группе RET не было выбывших из группы.
Результат тренировки сопротивленияD при гипертрофии, измеряемой как увеличение FFM, окружность бедра и площадь поперечного сечения бедра. CSA различных типов мышечных волокон не изменился значительно после RET, но произошел сдвиг в составе типа волокна от типа IIx до типа IIa. Поскольку волокна типа IIa больше, чем волокна типа IIx, это способствовало увеличению мышечной массы. В группе RET это указывает на усиление синтеза белка. Основной молекулярный сигнальный путь синтеза белка включает активацию Akt и mTOR. У пожилых людей меньше белка mTOR в мышце 30 , что может ограничивать синтез белка. Интересным нововведением является увеличение уровней белка mTOR и Akt в группе RET. Наблюдаемое увеличение mTOR здесь может противодействовать любой возможной анаболической устойчивости и способствовать увеличению синтеза белка.
VO 2max или, вернее, VO 2peak , часто оценивается как максимальный VO 2, измеренный во время теста, где скорость работы увеличивается поэтапно до истощения. Однако в пожилых, хрупких субъектах проблематично использовать исчерпывающие физические упражнения. Одна из проблем заключается в том, что не редкость у пожилых людей есть скрытое сердечно-сосудистое заболевание, которое во время исчерпывающего теста на упражнение приводит к повышенному риску сердечного приступа. Другая, более техническая проблема заключается в том, что снижение силы мышц, а не кардиореспираторное ограничение, может ограничивать скорость работы во время дополнительных упражнений. Интерпретация данных в этих условиях будет более сложной. Альтернативный метод, используемый в этом исследовании, заключается в измерении HR и RER при фиксированной скорости работы до и после вмешательства. Результаты показали, что HR, как правило, уменьшался в RET, но увеличивался в группе CON. Это говорит о том, что силовая подготовка улучшает способность VO 2max и выносливости. Эти результаты совпадают с результатами в 9 ,«Xref»> 31, но не все 32 , предыдущие исследования. Кроме того, несколько результатов в этом исследовании показывают, что мышечная аэробная способность улучшается ( т. Е. С изменением состава более оксидативного типа и увеличивается в ряде митохондриальных белков). Хотя хорошо известно, что упражнения на выносливость улучшают мышечную аэробную способность у пожилых людей, исследования силовых тренировок дают более противоречивое представление 8 , 9 , 10 , 33 . Различия в первоначальном статусе обучения и программах обучения могут объяснить разные результаты в разных исследованиях. Настоящие результаты, показывающие устойчивое увеличение количества митохондриальных белков только после восьми недель обучения (предыдущие периоды вмешательства были> 12 недель), показали, что тренировка по сопротивлению может быть эффективной стратегией для улучшения мышечной окислительной способности.
Несмотря на короткое вмешательство, повышенная толерантность к глюкозе наблюдалась в группе RET, о чем свидетельствует снижение уровня глюкозы AUC и GLU 120 мин . Хотя ожирение и физическая инертность являются факторами, связанными с повышенным риском резистентности к инсулину и диабетом типа 2, молекулярные механизмы остаются неясными. Измененная композиция тела с повышенной мышечной массой, вероятно, будет способствовать улучшению толерантности к глюкозе в группе RET. Кроме того, было высказано предположение, что резистентность к инсулину связана с малоподвижным образом жизни, с избыточной подачей липидов, приводящей к липотоксичности, дисфункции митохондрий и окислительному стрессу 3 . Настоящее исследование показывает, что тренировка резистентности приводит к устойчивому увеличению митохондриальных окислительных белков. Мы предполагаем, что повышенная мышечная окислительная способность является одним из факторов, объясняющих повышенную толерантность к глюкозе.
Расследования с более длительными наблюдениямиСпособный показать, сохраняются ли и в течение долгого времени последствия для здоровья с точки зрения повышения аэробной способности мышц, силы, силы, уровня глюкозы и липидов. Кроме того, имеет смысл определить достаточную дозу регулярной силовой тренировки среди пожилых людей. Будущие приложения также являются измерениями прочности в основных группах мышц, кроме экстензоров колена. Можно также сделать несколько других подробных анализов в мышечных клетках относительно различных белков и функций внутри митохондрий и без них.
Важно иметь один день между каждым испытательным днем без активной или продолжительной физической активности, в тот же день или за день до испытаний, поскольку это может повлиять на результаты оценок. Примеры критических этапов гистохимии и окрашивания АТФазой для композиции типа волокна включают в себя обеспечение того, чтобы часть биопсии обрабатывалась изопентаном вскоре после того, как была сделана биопсия, и что изопентан находится в первомT, так что биопсия не будет разрушена. Кроме того, часть биопсии должна быть «растянута или установлена», чтобы волокна указывали в одном направлении перед обработкой изопентаном. Во время окрашивания pH и температура лаборатории должны быть оптимальными (и это трудно предсказать). Однако это единственный способ обеспечить тип волокна и площадь волокна. Кроме того, метод быстрый, показывающий результаты в течение двух дней, и этот метод относительно недорог, без дорогостоящих химических веществ или устройств.
Четкое улучшение мышечной аэробной способности после тренировки силы бросает вызов мнению, что упражнение на выносливость является предпочтительным способом упражнений. Однако у пожилых людей с низким уровнем VO 2max и мышечной силы упражнения на выносливость должны выполняться при низкой интенсивности. Одним из основных стимулов митохондриального биогенеза является напряженность мышц 34 . Силовая подготовкаCes - главный локальный энергетический стресс, тогда как это проявляется менее выраженно при выполнении упражнений с низкой интенсивностью. Мы выдвигаем гипотезу, что у пожилых людей силовые тренировки более эффективны, чем упражнения на выносливость для увеличения мышечной аэробной способности. Кроме того, учитывая улучшение ряда связанных со здоровьем параметров и высокий уровень соблюдения, силовые тренировки могут быть рекомендованы для пожилых людей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Андре Нинкерку, Деннису Пейрону и Себастиану Скельду за контроль за учебными занятиями и несколькими тестами; Участвующим субъектам; Тиму Кроссфилду для пересмотра языка; И экономической поддержке Шведской школы спорта и наук о здоровье.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Western blot | |||
Pierce 660 nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Rockford, IL, USA | 22662 | |
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 34096 | |
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 78429 | |
Restore PLUS Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
Pierce Reversible Protein Stain Kit for PVDF Membranes | Thermo Scientific | 24585 | |
10 st - 4–20% Criterion TGX Gel, 18 well, 30 µL | Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA | 567-1094 | |
Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
10x Tris/Glycine | Bio-Rad | 161-0771 | |
2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
Tween 20 | Bio-Rad | P1379-250ML | |
Band analysis with Quantity One version 4.6.3.software | Bio-Rad | ||
1% phosphatase inhibitor coctail | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | ||
Antibodies | |||
mTOR (1:1,000) | Cell Signaling, Danvers, Massachusetts, USA | 2983 | |
Akt (1:1,000) | Cell Signaling, Danvers | 9272 | |
Secondary anti-rabbit and anti-mouse HRP-linked (1:10,000) | Cell Signaling, Danvers | ||
Citrate synthase (CS) (1:1,000) | Gene tex, San Antonio, California, USA | ||
OXPHOS (1:1,000) | Abcam, Cambridge, UK | ||
Equipment - Analysis of muscle samples | |||
Bullet Blender 1.5 for homogenizing | Next Advance, New York, USA | ||
Plate reader | Tecan infinite F200 pro, Männedorf, Switzerland | ||
Histochemistry | |||
Mayer hematoxylin | HistoLab, Västra Frölunda, Sweden | 1820 | |
Oil Red o | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | 00625-25y | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 793566-2.5 kg | |
Cobalt Chloride | Sigma-Aldrich | 60818-50G | |
Amylase | Sigma-Aldrich | A6255-25MG | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383-5G | |
Glycine | VWR-chemicals / VWR-international, Spånga, Sweden | 101196X | |
Calcium Chloride | VWR-chemicals / VWR-international | 22328.262 | |
Iso-pentane | VWR-chemicals / VWR-international | 24872.298 | |
Etanol 96% | VWR-chemicals / VWR-international | 20905.296 | |
NaOH | MERCK, Stockholm, Sweden | 1.06498.1000 | |
Na acetate | MERCK | 1.06268.1000 | |
KCl | MERCK | 1.04936.1000 | |
Ammonium Sulphide | MERCK | U1507042828 | |
Acetic acid 100% | MERCK | 1.00063.2511 | |
Schiffs´ Reagent | MERCK | 1.09033.0500 | |
Periodic acid | MERCK | 1.00524.0025 | |
Chloroform | MERCK | 1.02445.1000 | |
pH-meter LANGE | HACH LANGE GMBH, Dusseldorf, Germany | ||
Light microscope | Olympus BH-2, Olympus, Tokyo, Japan | ||
Cryostat Leica CM1950 | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Leica software Leica Qwin V3 | Leica Microsystems | ||
Gel Doc 2000 - Bio-Rad, camera setup | Bio-Rad Laboratories AB, Solna, Sweden | ||
Software program Quantift One - 4.6 (version 4.6.3; Bio Rad) | Bio-Rad Laboratories AB, Solna, Sweden | ||
Oral glucos tolerance test, OGTT | |||
Glukos APL 75 g | APL, Stockholm, Sweden | 323,188 | |
Automated analyser Biosen 5140 | EKF Diagnostics, Barleben, Germany | ||
Insulin and C-peptide in plasma kit ELISA | Mercodia AB, Uppsala Sweden | 10-1132-01, 10-1134-01 | |
Plate reader | Tecan infinite F200 pro, Männedorf, Switzerland | ||
Further equipment | |||
Measures of fat-free mass | FFM-Tanita T5896, Tanita, Tokyo, Japan | ||
Strength training equipment for all training exercises | Cybex International Inc., Medway, Massachusetts, USA | ||
Cycle ergometer | Monark Ergometer 893E, Monark Exercises, Varberg, Sweden | ||
Heart rate monitor RS800, Polar | Polar Electro OY, Kampele, Finland | ||
Oxycin-Pro - automatic ergo-spirometric device | Erich Jaeger GmbH, Hoechberg, Germany | ||
Isokinetic dynamometer, Isomed 2000, knee muscle strength | D&R Ferstl GmbH, Henau, Germany | ||
CED 1401 data acquisition system and Signal software | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | ||
Software for muscle strength analysis, Spike 2, version 7 | Signal Hound, LA Center, WA, USA | ||
Statistica software for statistical analyses | Statistica, Stat soft. inc, Tulsa, Oklahoma, USA | ||
Muscle biopsy equipment | |||
Weil Blakesley conchotome | Wisex, Mölndal, Sweden | ||
Local anesthesia | Carbocain, 20 mL, 20 mg/mL; Astra Zeneca, Södertälje, Sweden | 169,367 | |
Surgical Blade | Feather Safety Razor CO, LTD, Osaka, Japan | 11048030 |
References
- Carrick-Ranson, G., et al. The effect of age-related differences in body size and composition on cardiovascular determinants of VO2max. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (5), 608-616 (2013).
- Peterson, C. M., Johannsen, D. L., Ravussin, E. Skeletal muscle mitochondria and aging: a review. J. Aging. 2012, 194821 (2012).
- Russell, A. P., Foletta, V. C., Snow, R. J., Wadley, G. D. Skeletal muscle mitochondria: a major player in exercise, health and disease. Biochim. Biophys. Acta. 1840 (4), 1276-1284 (2014).
- Conley, K. E., Jubrias, S. A., Esselman, P. C. Oxidative capacity and ageing in human muscle. J. Physiol. 526 (Pt 1), 203-210 (2000).
- Holloszy, J. O. Adaptation of skeletal muscle to endurance exercise. Med. Sci. Sports. 7 (3), 155-164 (1975).
- Menshikova, E. V., Ritov, V. B., Fairfull, L., Ferrell, R. E., Kelley, D. E., Goodpaster, B. H. Effects of exercise on mitochondrial content and function in aging human skeletal muscle. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 61 (6), 534-540 (2006).
- Balakrishnan, V. S., et al. Resistance training increases muscle mitochondrial biogenesis in patients with chronic kidney disease. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 5 (6), 996-1002 (2010).
- Ferrara, C. M., Goldberg, A. P., Ortmeyer, H. K., Ryan, A. S. Effects of aerobic and resistive exercise training on glucose disposal and skeletal muscle metabolism in older men. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 61 (5), 480-487 (2006).
- Frontera, W. R., Meredith, C. N., O'Reilly, K. P., Evans, W. J. Strength training and determinants of VO2max in older men. J. Appl. Physiol. (1985). 68 (1), 329-333 (1990).
- Toth, M. J., Miller, M. S., Ward, K. A., Ades, P. A. Skeletal muscle mitochondrial density, gene expression, and enzyme activities in human heart failure: minimal effects of the disease and resistance training. J. Appl. Physiol. (1985). 112 (11), 1864-1874 (2012).
- Zachwieja, J. J., Toffolo, G., Cobelli, C., Bier, D. M., Yarasheski, K. E. Resistance exercise and growth hormone administration in older men: effects on insulin sensitivity and secretion during a stable-label intravenous glucose tolerance test. Metabolism. 45 (2), 254-260 (1996).
- Davidson, L. E., et al. Effects of exercise modality on insulin resistance and functional limitation in older adults: a randomized controlled trial. Arch. Intern. Med. 169 (2), 122-131 (2009).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am. J. Physiol. 237 (3), E214-E223 (1979).
- Åstrand, P. O., Ryhming, I. A nomogram for calculation of aerobic capacity (physical fitness) from pulse rate during sub-maximal work. J. Appl. Physiol. 7 (2), 218-221 (1954).
- Björkman, F., Ekblom-Bak, E., Ekblom, Ö, Ekblom, B. Validity of the revised Ekblom Bak cycle ergometer test in adults. Eur. J. Appl. Physiol. 116 (9), 1627-1638 (2016).
- Seger, J. H., Westing, S. H., Hanson, M., Karlson, E., Ekblom, B. A new dynamometer measuring eccentric and eccentric muscle strength in accelerated, decelerated and isokinetic movements: validity and reproducibility. Eur. J. Appl. Physiol. 57 (5), 526-530 (1988).
- Westing, S. H., Seger, J. Y., Karlson, E., Ekblom, B. Eccentric and concentric torque-velocity characteristics of the quadriceps femoris in man. Eur. J. Appl. Physiol. 58 (1-2), 100-104 (1988).
- Aagaard, P., Simonsen, E. B., Andersen, J. L., Magnusson, P., Dyhre-Poulsen, P. Increased rate of force development and neural drive of human skeletal muscle following resistance training. J. Appl. Physiol. 93 (4), 1318-1326 (2002).
- Andersen, L. L., Aagaard, P. Influence of maximal muscle strength and intrinsic muscle contractile properties on contractile rate of force development. Eur. J. Appl. Physiol. 96 (1), 46-52 (2006).
- Henriksson, K. G. "Semi-open" muscle biopsy technique. A simple outpatient procedure. Acta Neurol. Scand. 59 (6), 317-323 (1979).
- Matsuda, M., DeFronzo, R. A. Insulin sensitivity indices obtained from oral glucose tolerance testing: comparison with the euglycemic insulin clamp. Diabetes Care. 22 (9), 1462-1470 (1999).
- American Diabetes, Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care. 28, Suppl 1. S37-S42 (2005).
- Moberg, M., Apró, W., Ekblom, B., van Hall, G., Holmberg, H. C., Blomstrand, E. Activation of mTORC1 by leucine is potentiated by branched-chain amino acids and even more so by essential amino acids following resistance exercise. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 310 (11), C874-C884 (2016).
- Antharavally, B. S., Carter, B., Bell, P. A., Krishna Mallia,, A, A high-affinity reversible protein stain for Western blots. Anal. Biochem. 329 (2), 276-280 (2004).
- Brooke, M. H., Kaiser KK, Muscle fiber types: how many and what kind? Arch. Neurol. 23 (4), 369-379 (1970).
- Brooke, M. H., Kaiser, K. K. Three "myosin adenosine triphosphatase" systems: the nature of their pH lability and sulfhydryl dependence. J. Histochem. Cytochem. 18 (9), 670-672 (1970).
- Andersen, P. Capillary density in skeletal muscle of man. Acta Physiol. Scand. 95 (2), 203-205 (1975).
- Frank, P., Andersson, E., Pontén, M., Ekblom, B., Ekblom, M., Sahlin, K. Strength training improves muscle aerobic capacity and glucose tolerance in elderly. Scand. J. Med. Sci. Sports. 26 (7), 764-773 (2016).
- Blomstrand, E., Celsing, F., Fridén, J., Ekblom, B. How to calculate human muscle fibre areas in biopsy samples--methodological considerations. Acta Physiol. Scand. 122 (4), 545-551 (1984).
- Cuthbertson, D., et al. Anabolic signaling deficits underlie amino acid resistance of wasting, aging muscle. FASEB J. 19 (3), 422-424 (2005).
- Vincent, K. R., Braith, R. W., Feldman, R. A., Kallas, H. E., Lowenthal, D. T. Improved cardiorespiratory endurance following 6 months of resistance exercise in elderly men and women. Arch. Intern. Med. 162 (6), 673-678 (2002).
- Cadore, E. L., et al. Effects of strength, endurance, and concurrent training on aerobic power and dynamic neuromuscular economy in elderly men. J. Strength Cond. Res. 25 (3), 758-766 (2011).
- Jubrias, S. A., Esselman, P. C., Price, L. B., Cress, M. E., Conley, K. E. Large energetic adaptations of elderly muscle to resistance and endurance training. J. Appl. Physiol. (1985). 90 (5), 1663-1670 (1985).
- Benton, C. R., Wright, D. C., Bonen, A. PGC-1alpha-mediated regulation of gene expression and metabolism: implications for nutrition and exercise prescriptions. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 33 (5), 843-862 (2008).