Otimização e Análise Comparativa de Métodos de Enriquecimento de DNA de Plantas Organizadas Adequado para Seqüenciamento de Próxima Geração

Marisa E. Miller; Katie L. Liberatore; Shahryar F. Kianian

doi:10.3791/55528

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Artigo de método

Otimização e Análise Comparativa de Métodos de Enriquecimento de DNA de Plantas Organizadas Adequado para Seqüenciamento de Próxima Geração

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DOI:

10.3791/55528

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28 de julho de 2017

Marisa E. Miller^*¹^,² , Katie L. Liberatore^*¹^,³ , Shahryar F. Kianian¹^,³

¹Cereal Disease Laboratory, United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service, ²Department of Horticultural Science, University of Minnesota, ³Department of Plant Pathology, University of Minnesota

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A comparação e otimização de dois métodos de enriquecimento de DNA orgânico de plantas são apresentadas: centrifugação diferencial tradicional e fracionamento do gDNA total com base no estado de metilação. Nós avaliamos a quantidade e a qualidade de DNA resultantes, demonstram desempenho em seqüenciamento de próxima geração de leitura curta e discutimos o potencial para uso em sequenciação de moléculas únicas de leitura longa.

Resumo

Os genomas orgânicos de plantas contêm elementos grandes e repetitivos que podem sofrer combinação ou recombinação para formar estruturas complexas e / ou fragmentos sub-genômicos. Os genomas de Organellar também existem em misturas dentro de uma determinada célula ou tipo de tecido (heteroplasmia), e uma abundância de subtipos pode mudar ao longo do desenvolvimento ou quando sob estresse (deslocamento sub-estequiométrico). As tecnologias de sequenciação de próxima geração (NGS) são necessárias para obter uma compreensão mais profunda da estrutura e da função do genoma organelar. Estudos de seqüenciamento tradicionais usam vários métodos para obter DNA organelar: (1) Se uma grande quantidade de tecido inicial é usada, é homogeneizada e submetida a centrifugação diferencial e / ou a depuração gradiente. (2) Se uma quantidade menor de tecido é usada ( ou seja, se sementes, material ou espaço é limitado), o mesmo processo é realizado como em (1), seguido de amplificação de todo o genoma para obter DNA suficiente. (3) A análise de bioinformática pode ser usada para seqUence o DNA genômico total e analisar as leituras orgânicas. Todos esses métodos têm desafios e compromissos inerentes. Em (1), pode ser difícil obter uma quantidade tão grande de tecido inicial; Em (2), a amplificação do genoma inteiro poderia introduzir um viés de seqüenciamento; E em (3), a homologia entre genomas nucleares e organelares poderia interferir na montagem e análise. Em plantas com grandes genomas nucleares, é vantajoso enriquecer o DNA organelar para reduzir os custos de sequenciação e a complexidade da sequência para análises de bioinformática. Aqui, comparamos um método de centrifugação diferencial tradicional com um quarto método, uma abordagem adaptada de CpG-methyl pulldown, para separar o DNA genômico total em frações nucleares e orgânicas. Ambos os métodos produzem DNA suficiente para NGS, DNA que é altamente enriquecido para seqüências organelares, embora em diferentes proporções nas mitocôndrias e nos cloroplastos. Apresentamos a otimização desses métodos para o tecido das folhas de trigo e discutimos grandes vantagens e dSão vantagens de cada abordagem no contexto de entrada de amostra, facilidade de protocolo e aplicação a jusante.

Introdução

O seqüenciamento do genoma é uma ferramenta poderosa para dissecar a base genética subjacente de traços importantes da planta. A maioria dos estudos de sequenciação do genoma se concentra no conteúdo do genoma nuclear, já que a maioria dos genes está localizada no núcleo. No entanto, os genomas organelares, incluindo as mitocôndrias (através de eucariotas) e os plastidios (nas plantas, a forma especializada, o cloroplasto, funciona na fotossíntese) contribuem com informações genéticas significativas essenciais ao desenvolvimento organizacional, à resposta ao estresse e à aptidão geral ¹ . Os genomas organelares são tipicamente incluídos ....