Artigo de método

In Vitro Imaging and Quantificação da segmentação Eficiência Drogas de análogos de GnRH fluorescente etiquetado

DOI:

10.3791/55529

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21 de março de 2017

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1MTA-SE Pathobiochemistry Research Group, Semmelweis University, 2Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, 3MTA-ELTE Research Group of Peptide Chemistry, Eötvös Loránd University

Neste artigo

Resumo

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Selectivamente marcado fluorescente GnRH-I, -II e -III derivados são ferramentas confiáveis para acompanhar e quantificar a sua captação celular. Este manuscrito apresenta experiências para visualizar, quantificar e comparar a eficiência de absorção destes conjugados da GnRH em várias linhas celulares.

Resumo

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análogos de GnRH são porções de direccionamento eficaz e capaz de entregar agentes anticancerígenos seletivamente em células tumorais malignas quais os receptores GnRH altamente expresso. No entanto, a análise quantitativa de captação celular análogos de GnRH 'e os tipos de células investigadas em sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH são actualmente limitada. Previamente introduzido, fluorescente marcado selectivamente GnRH I, -II e -III derivados fornecem grande detectabilidade, e eles têm propriedades químicas adequadas para experiências reprodutíveis e robustas. Descobrimos também que os métodos apropriados up-to-date com estes análogos de GnRH rotulados poderia oferecer novas informações sobre os sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH. Este manuscrito apresenta algumas experiências simples e rápido sobre a absorção celular de [D-Lys6 (FITC)] - a GnRH-I, [D-Lys6 (FITC)] - a GnRH-II e [Lys 8 (FITC)] - GnRH -III na EBC-1 (pulmão), o BxPC-3 (pâncreas) e na Detroit-562- (faringe) T malignaUmor células. Em paralelo com estes conjugados da GnRH-FITC, o nível da superfície celular de receptores de GnRH-I também foi examinada com estas linhas de células antes e após o tratamento com GnRH por microscopia confocal de varrimento laser. A absorção celular de conjugados da GnRH-FITC foi quantificada por separação de células activadas por fluorescência. Nestas experiências foi observada pequenas diferenças entre os análogos do GnRH e as principais diferenças entre os tipos de células. As diferenças significativas entre as linhas de células são correlacionados com o seu nível distinto de receptores de superfície celular GnRH-I. Os experimentos introduzidas contêm métodos práticos para visualizar, quantificar e comparar a eficiência de absorção de conjugados de GnRH-FITC em um tempo e forma dependente da concentração em várias culturas de células aderentes. Esses resultados poderiam predizer a eficácia da segmentação de drogas de conjugados de GnRH na cultura celular dado, e oferecem uma boa base para novas experiências no exame dos sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH.

Introdução

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Sistemas de entrega de drogas específicas base de péptidos tornaram-se um desenvolvimento rápido e a área promissor na terapia do cancro ao longo dos últimos anos um, 2. Gonadotropina humana tipo I libertando receptor da hormona (GnRH-IV) situa-se principalmente na glândula pituitária, mas também está presente em vários outros tecidos que são responsáveis por auto-reprodução 3. GnRH-IV é também expressa num número de tecidos de cancro, relacionada ou não com o sistema reprodutivo 4, 5. A expressão elevada de GnRH-IR em várias células de tumores malignos em comparação com tecidos saudáveis fornece uma oportunidade para terapia alvo 5, 6.

Muitos hormona libertadora de gonadotropina (GnRH) análogos têm sido desenvolvidos nas últimas décadas, que poderiam ser utilizados como porções de direccionamentof "> 7, 8, 9. Estes péptidos são capazes de entregar agentes anticancerígenos com elevada selectividade para as células tumorais malignas que sobre-expressa a GnRH-IV 6. Vários fármacos anti-tumorais conjugados da GnRH com maior selectividade e maior eficiência do que o não conjugado correspondendo livre de drogas foram relatados 7, 8, 9.

Publicações anteriores cerca de péptidos da GnRH e seus receptores relatado que a GnRH-IR pode assumir várias conformações diferentes que têm selectividade para GnRH análogos 10. A GnRH-IR altamente variável tem complexos e várias vias de sinalização são dotados de actividade diferente contra os seus ligandos naturais e artificiais 11. Estes fatos fazem investigação de sistemas baseados em GnRH desafiador. Por outro lado, o y possuem potencial terapêutico promissor. Várias experiências com péptidos GnRH radiomarcados foram anteriormente relatados 12, 13, 14, 15, mas experimentos nos quais foram usados análogos de GnRH fluorescente etiquetado ainda são limitados. Enquanto marcação radioactiva oferece alta sensibilidade, marcação fluorescente tem várias outras vantagens, por exemplo, o manuseio mais fácil, ea capacidade de contracoloração com diferentes fluoróforos. Três análogos de GnRH comuns que têm sido utilizados com sucesso para a entrega de drogas são a [D-Lys6] -GnRH-I, [D-Lys6] -GnRH-II e III-GnRH, mas a eficácia destes péptidos como porções de direccionamento é raramente comparado 16, 17. Por outro lado, os resultados obtidos em experiências separadas em que foram utilizadas células de cancro diferentes e os análogos da GnRH é diversa.

ntent "> Com base nestas considerações, nós nos concentramos em que o tumor alvo e potencial de entrega da droga destes péptidos GnRH e, assim, sintetizada e caracterizada a [D-Lys 6 (ITCF)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - a GnRH-II e [Lys 8 (FITC)] - conjugados peptídicos de GnRH-III 18 Estes análogos são marcados selectivamente com FITC na cadeia lateral do seu (razão de péptido-FITC Lys ou D-Lys 1: 1 em cada um. conjugado). a ideia era que a marcação fluorescente seletivo pode oferecer novas informações sobre esses peptídeos, e permite que sua boa localização e quantificação confiável. estes conjugados têm um manuseamento seguro e detecção confiável, o que tornará mais fácil para comparar sua eficiência segmentação tumor, ea triagem de numerosos tipos de células tumorais malignas. esperamos que up-to experimentos data com estes conjugados peptídeo poderia contribuir para o desenvolvimento de câncer de romance alvo conjugados GnRH-drogas, e ajudar a identificar novos tar terapêuticafica bem.

O presente artigo propõe demonstrar algumas experiências bem reprodutíveis e rápidos com conjugados de GnRH-FITC. A expressão na superfície celular da GnRH-R é uma condição determinante sobre a absorção de GnRH, por isso investigado simultaneamente o nível da superfície celular da GnRH-IR sobre as linhas de células testadas. Nós visualizados os conjugados da GnRH-IR e GnRH-FITC por microscopia confocal de varrimento laser (CLSM) e quantificado a absorção celular de conjugados da GnRH-FITC utilizando células activadas por fluorescência (FACS).

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Protocolo

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1. Preparação de Culturas de Células e Reagentes

  1. Manter as culturas de células em meio recomendado pelo fabricante, suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino e antibióticos (meio completo chamado). Manter o frasco de cultura de células numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C. Seguir a proliferação de células de confluência e por microscópio invertido (usando 10X objectiva de contraste de fase).
  2. Quando as células atingem a confluência adequada, remover o meio, e lava-se a cultura com 2-3 ml, estéril tamponada de fosfato-salina (PBS). Remover o PBS e adicionar 0,5 mL, solução estéril de 0,25% de tripsina-EDTA para a cultura de células e incubar a 37 ° C até que as células de separar (aproximadamente 10 min).
  3. Suspender as células em 3-4 mL de meio completo estéril para parar tripsina e transferi-los para um tubo de centrífuga estéril. Centrifugar as células a 150 xg durante 4 minutos à temperatura ambiente (TA). Descartar o sobrenadante com cuidado e suspender o pEllet em 2-3 mL de meio completo estéril.
  4. Retire 100 uL da suspensão de células e misturar-se com 100 uL de 0,4% (m / V) de tripano azul solução, para corar as células mortas. Carga de 10 ul desta mistura em um hemocitómetro e determinar o número de células viáveis ​​por microscópio invertido.
  5. Dilui-se a quantidade necessária de suspensão de células preparada no Passo 1.3 até 10 mL com meio completo estéril, contendo 4 x 10 4 células / mL.
  6. Adicionar 250 uL de suspensão de células (preparado no passo 1.5) por poço (10 4 células / cavidade) em sete poços do primeiro vidro de fundo de 8 poços lâmina de microscópio. Use este slide no método de captação de GnRH.
  7. Adicionar 250 uL de suspensão de células (preparado no passo 1.5) por poço (10 4 células / cavidade) em cinco poços da segunda corrediça de 8 poços microscópica. Esta corrediça vai ser utilizada no método de expressão do GnRH-IR.
  8. Adicionar 1 mL de suspensão de células (preparado no passo 1.5) por poço (4 x 10 4 células / cavidade) em sete WELsl de uma placa de 12 poços. Esta placa irá ser utilizado no método de quantificação de GnRH.
  9. Deixe as células aderir sobre as duas lâminas de microscopia e a placa. Incubar-los numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 numa estufa a 37 ° C durante 48 h.
  10. Após a incubação de verificar as células por microscópio invertido (usando 10X objectiva de contraste de fase). Se as células são saudáveis ​​e anexado, continue com os seguintes passos.
  11. Preparar solução mãe de 10 mM a GnRH-FITC em dimetil sulfóxido (DMSO) a partir de cada um dos três conjugados de 18. (Utilize estas concentrações de diluição: 16,43 mg / mL [D-Lys 6 (ITCF)] - GnRH-I, 16,97 mg / mL [D-Lys 6 (ITCF)] - GnRH-II e 16,47 mg / mL [Lys 8 ( FITC)] - GnRH-III) Manter estas soluções estoque em um local escuro à temperatura ambiente e usá-los dentro de algumas semanas.
  12. Diluir 1,7 mL de cada uma das três soluções de estoque 10 mM de GnRH-FITC em 1,7 ml de meio completo. Agitar estas soluções. (Tse são a 10 uM GnRH-FITC tratamento de meios.) Diluir 150 uL cada uma das três 10 uM de GnRH-FITC meio de tratamento de 1,35 ml de meio completo. Agitar estas soluções, bem como (estas são a 1 uM a GnRH-FITC meio de tratamento).
    NOTA: Todos GnRH-FITC contendo meio de tratamento deve ser protegido da luz e usou-se dentro de poucos h.
  13. Pré-aqueça o seis GnRH-FITC meio de tratamento (preparado no passo 1.12) e 4 ml de meio completo a 37 ° C.
  14. Dilui-se 3 mL de solução de sonda fluorescente a 5 mM (de contraste nuclear mencionado na Lista de Materiais) em 3 mL de PBS a 5 uM. Esta solução deve ser protegido da luz, mantê-lo à temperatura ambiente e usá-lo dentro de algumas horas.

2. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

  1. Método de captação de GnRH
    1. Tome a primeira lâmina de microscópio, preparada no passo 1.6 e pipeta o meio completo de cada um dos sete também. Adicionar 250 mL de medi completo pré-aquecidoUM para o primeiro poço. Usar isso como controlo negativo. Adicionar 250 mL de pré-aquecido a GnRH-FITC tratamento de meios (de 1,13) para cada um dos próximos seis poços (3 poços com 1 uM e 3 com 10 uM). Incubar a lâmina numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C durante 5 h.
    2. Pipetar a meio de cada poço e lava-se as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de solução de fixação (10% de formalina tamponada neutra) a cada poço e incubar a corrediça à TA, durante 10 min.
    3. Pipetar a solução de fixação a partir de cada cavidade e lavar as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de PBS contendo 5 uM solução de sonda fluorescente preparado no passo 1.14 a cada poço e incubar a corrediça à TA, durante 10 min.
    4. Pipetar a solução de sonda fluorescente de cada poço, e lavar as células duas vezes com 250 ul de PBS com cuidado. Adicionar 3-4 gotas de meio de montagem em cada poço, finalmente. Mantenha o slide no escuro à temperatura ambiente, até que a imagem.
  2. Método de expressão do GnRH-IR
    1. Aqui a segunda lâmina de microscópio, de 8 poços preparado no passo 1.7 e pipetar para a forma completa a partir de cada um dos cinco poços.
    2. Adicionar 250 mL de meio completo pré-aquecido no primeiro poço, use esta como controle negativo. Adicionar 250 mL de meio completo pré-aquecido no segundo poço também, e usar isso para examinar expressão GnRH-IR antes do tratamento GnRH.
    3. Adicionar 250 uL de cada uma das três pré-aquecido 10 uM meios tratam a GnRH-FITC para os próximos três poços. Use esses poços para pré-tratamento das células com conjugados de GnRH-FITC antes de examinar a expressão GnRH-IR. Incubar a lâmina numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C durante 1 h.
    4. Pipetar para fora do meio de tratamento a partir de cada um dos três poços, que vai ser utilizado para examinar a expressão de GnRH-IR após o tratamento com GnRH e lavar estes poços com 250 uL de meio completo pré-aquecido. Adicionar 250uL de meio completo pré-aquecido em cada um dos três poços. Incubar a lâmina numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C durante 1 h.
    5. Pipetar para a forma de cada um dos cinco poços e lava-se as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de solução de fixação a cada poço e incubar a corrediça à TA, durante 10 min.
    6. Pipetar a solução de fixação a partir de cada cavidade e lavar as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de PBS contendo albumina de soro bovino a 5% (BSA) em solução de bloqueio a cada poço e incubar a corrediça à TA, durante 1 h.
    7. Diluir 10 uL de anticorpo primário GnRH-IV em 1 mL de PBS (1: 100 ratio). Mantê-lo à temperatura ambiente e usá-lo dentro de algumas horas.
    8. Pipetar para fora a solução de bloqueio de BSA a partir de cada cavidade, excepto o controlo negativo (primeira cavidade). Lavam-se as células com 250 ul de PBS (excepto o controlo negativo). Adicionar 250 uL de PBS contendo anticorpo primário GnRH-IV preparado no passo 2.2.7 em EACh poço (excepto o controlo negativo). Incubar a lâmina à TA, durante 1 hora, num local escuro.
    9. Diluir 2,5 mL de anticorpo secundário marcado Alexa 546 em 1,25 ml de PBS (1: 500 ratio).
      NOTA: Esta solução deve ser protegido da luz, mantê-lo à temperatura ambiente e usá-lo dentro de algumas horas.
    10. Pipeta soluções de cada um dos cinco poços e lava-se as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de PBS contendo 546 AF anticorpo secundário marcado, preparado no passo 2.2.9 em cada poço. Incubar as lâminas à temperatura ambiente, durante 1 h na escuridão.
    11. Pipetar a solução de cada cavidade e lavar as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de PBS contendo 5 uM solução de sonda fluorescente preparado no passo 1.14 a cada poço e incuba-se a lâmina durante 10 min, à RT.
    12. Pipetar a solução de sonda fluorescente de cada cavidade e lavar as células duas vezes com 250 ul de PBS com cuidado. Adicionar 3-4 gotas de meios de montagem para cada poço, depois. Mantenha o slide no escuroà temperatura ambiente até a imagem microscópica.
  3. imagiologia
    1. Imagem as células por confocal invertido microscópio de varredura a laser (usando 63X objetiva de imersão em óleo)
      1. Use as seguintes comprimentos de onda de excitação / emissão. conjugados GnRH: 488/514 nm, anticorpo marcado Alexa 546: 488/546 nm (uso apenas para o método de expressão GnRH-IR), DRAQ5 sonda fluorescente: 633/680 nm.
      2. Configurar os parâmetros de imagem usando as células de controlo negativo. Use esses parâmetros para células de imagem tratada (Figura 3). Re-ajustar parâmetros de imagem em cada lâmina de microscópio, no início da análise. Aperfeiçoar e exportar as imagens com o software fornecido pelo fabricante, se necessário.

3. celular activada por fluorescência (FACS)

  1. Método de quantificação de GnRH
    1. Pegue a placa preparado no passo 1.8 e pipeta o meio completo da EACH dos sete poços. Adicione 1 mL de meio completo pré-aquecido no primeiro poço. Usar isso como controlo negativo. Adicionar 1 mL de cada uma das seis pré-aquecido tratamento de imagens (3 poços com 1 uM e 3 poços com 10 ^ M) para os próximos seis poços. Incubar a placa numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C durante 5 h.
    2. Pipetar a meio de cada poço. Lavar as células duas vezes com 2 mL de PBS com cuidado. Adicionar 500 ul de solução de tripsina-EDTA em cada poços. Incubar a placa a 37 ° C até que as células de separar (aproximadamente 10 min).
    3. Adicionar 1 ml de meio completo a cada poço para parar a tripsina. Agitar a placa. Suspender as células suavemente com uma pipeta, e transferir a suspensão de cada cavidade para tubos FACS. Centrifugar os tubos a 150 xg durante 4 min, a 4 ° C.
    4. Derrama o sobrenadante cuidadosamente, com um movimento. Adicionar 500 uL de PBS arrefecido em gelo a cada tubo de FACS e gentilmente re-suspender as células. Manter os tubos em gelo até ao fimda experiência.
  2. Análise e cálculo
    1. Analisar as células por citometria de fluxo. Por excitação, utilizar a 488 nm de comprimento de onda do laser de árgon e utilizar para a detecção de comprimento de onda de 530 nm. Configure o citômetro de fluxo parâmetros executando as células de controlo negativo. Usar estes parâmetros para analisar as células tratadas (Figura 4A). Avaliar os dados com o software do fabricante, determinar os valores de média intensidade de fluorescência (MFI), e calcular os valores relativos das IFM.

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Resultados

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Imagens obtidas por microscopia confocal de varrimento laser (CLSM) oferecem informações espetacular sobre a absorção de conjugados de GnRH-FITC na cultura de células dada em um tempo e forma dependente da concentração. Em paralelo com estes conjugados da GnRH-FITC, a presença da GnRH-IV na superfície da célula, também é verificável pela experiência CLSM. Além disso, usando uma sonda fluorescente de ADN de coloração vermelho-extremo, é possível contracoloração os núcleos de células além ...

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Discussão

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As experiências aqui descritas usar análogos de GnRH marcadas seletivamente para o rastreio aderente culturas de células in vitro. A microscopia confocal e métodos de citometria de fluxo são adequados para controlar e quantificar a absorção celular destes conjugados da GnRH-FITC em um momento e de modo dependente da concentração. Estas experiências têm os seguintes passos críticos: 1) manter uma cultura de células estéril e saudável; 2) péptidos GnRH deve ser de elevada qualidade; 3) concentrações ra...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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O projeto foi apoiado pelo National Research Fund OTKA (K 104045).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Banco de células EBC-1JCRBJCRB0820Carcinoma de células escamosas de pulmão humano
BxPC-3ATCCCRL-1687Adenocarcinoma pancreático humano
Detroit-562ATCCCCL-138Carcinoma faríngeo humano
RPMI-1640 Meio com L-glutaminaLonzaBE12-702FMeio de cultura para células BxPC-3
Eagle's Minimum Essential MeioLonzaBE12-611FMeio de cultura para células EBC-1, e complementado com 0,1% de piruvato de sódio para células Detroit-562
Soro Fetal BovinoEuro CloneECS0180LComplementa o meio de cultura
MycoZap Plus-CL LonzaVZA-2012Complementa o meio de cultura (antibióticos)
Frascos de Cultura de Células de Linha PadrãoVWR10062-872Fornecem ambiente de crescimento consistente e estéril para células
Mistura de tripsina-EDTA LonzaBE17-161ERemova as células anexadas
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)LonzaBE17-516FSolvente
DimetilsulfóxidoSigma-AldrichD8418-100MLSolução Solvente
Trypan Blue, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061Usado para contar células
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-Ifeito por nós- Pureza ≥ 98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-IIfeito pornós-Pureza≥ 98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-IIIfeito pornós-Pureza≥ 98% (HPLC)
lâmina microscópica de 8 poços com fundo de vidroIbidi80826Uso em experimento CLSM
Placa de cultura de células Corning Costar, 12 poçosSigma-AldrichCLS3513-50EAUso em FACS experimento
Solução de fixação (10% de formalina tamponada neutra)Bio-Optica01V60PFixar células aderentes
Albumina de soro bovinoSigma-AldrichA7906-10GPrevenir a ligação inespecífica dos anticorpos
GnRHR Anticorpo Proteintech19950-1-APReagente de imunocitoquímica, liga-se aos receptores GnRH tipo I humano
Anticorpo secundário, conjugado Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA11035Reagente de imunocitoquímica, liga-se ao anticorpo primário
Solução de sonda fluorescente (Draq5)Thermo Fisher Scientific62254Núcleos de contracoloração
Fluoromount Meio de Montagem AquosaSigma-AldrichF4680-25MLUse em experimento CLSM, preservando a fluorescência
Microscópio invertidoElektro-Optika Ltd. Alpha XDS-2TVerifique o fenótipo e a confluência das culturas celulares
Microscópio de varredura a laser confocal invertidoZeissLSM-710Uso no experimento CLSM
Citômetro de fluxoBD BiosciencesBD FACSCaliburUso no experimento FACS

Referências

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