Selectivamente marcado fluorescente GnRH-I, -II e -III derivados são ferramentas confiáveis para acompanhar e quantificar a sua captação celular. Este manuscrito apresenta experiências para visualizar, quantificar e comparar a eficiência de absorção destes conjugados da GnRH em várias linhas celulares.
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Artigo de método
In Vitro Imaging and Quantificação da segmentação Eficiência Drogas de análogos de GnRH fluorescente etiquetado
Neste artigo
Resumo
Resumo
análogos de GnRH são porções de direccionamento eficaz e capaz de entregar agentes anticancerígenos seletivamente em células tumorais malignas quais os receptores GnRH altamente expresso. No entanto, a análise quantitativa de captação celular análogos de GnRH 'e os tipos de células investigadas em sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH são actualmente limitada. Previamente introduzido, fluorescente marcado selectivamente GnRH I, -II e -III derivados fornecem grande detectabilidade, e eles têm propriedades químicas adequadas para experiências reprodutíveis e robustas. Descobrimos também que os métodos apropriados up-to-date com estes análogos de GnRH rotulados poderia oferecer novas informações sobre os sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH. Este manuscrito apresenta algumas experiências simples e rápido sobre a absorção celular de [D-Lys6 (FITC)] - a GnRH-I, [D-Lys6 (FITC)] - a GnRH-II e [Lys 8 (FITC)] - GnRH -III na EBC-1 (pulmão), o BxPC-3 (pâncreas) e na Detroit-562- (faringe) T malignaUmor células. Em paralelo com estes conjugados da GnRH-FITC, o nível da superfície celular de receptores de GnRH-I também foi examinada com estas linhas de células antes e após o tratamento com GnRH por microscopia confocal de varrimento laser. A absorção celular de conjugados da GnRH-FITC foi quantificada por separação de células activadas por fluorescência. Nestas experiências foi observada pequenas diferenças entre os análogos do GnRH e as principais diferenças entre os tipos de células. As diferenças significativas entre as linhas de células são correlacionados com o seu nível distinto de receptores de superfície celular GnRH-I. Os experimentos introduzidas contêm métodos práticos para visualizar, quantificar e comparar a eficiência de absorção de conjugados de GnRH-FITC em um tempo e forma dependente da concentração em várias culturas de células aderentes. Esses resultados poderiam predizer a eficácia da segmentação de drogas de conjugados de GnRH na cultura celular dado, e oferecem uma boa base para novas experiências no exame dos sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH.
Introdução
Sistemas de entrega de drogas específicas base de péptidos tornaram-se um desenvolvimento rápido e a área promissor na terapia do cancro ao longo dos últimos anos um, 2. Gonadotropina humana tipo I libertando receptor da hormona (GnRH-IV) situa-se principalmente na glândula pituitária, mas também está presente em vários outros tecidos que são responsáveis por auto-reprodução 3. GnRH-IV é também expressa num número de tecidos de cancro, relacionada ou não com o sistema reprodutivo 4, 5. A expressão elevada de GnRH-IR em vá....
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Protocolo
1. Preparação de Culturas de Células e Reagentes
- Manter as culturas de células em meio recomendado pelo fabricante, suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino e antibióticos (meio completo chamado). Manter o frasco de cultura de células numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C. Seguir a proliferação de células de confluência e por microscópio invertido (usando 10X objectiva de contraste de fase).
- Quando as células atingem a confluência adequada, remover o meio, e lava-se a cultura com 2-3 ml, estéril tamponada de fosfato-salina (PBS). Remover o PBS e adicionar 0,5 mL, solução estéril de 0,25% de tripsina-EDTA p....
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Resultados
Imagens obtidas por microscopia confocal de varrimento laser (CLSM) oferecem informações espetacular sobre a absorção de conjugados de GnRH-FITC na cultura de células dada em um tempo e forma dependente da concentração. Em paralelo com estes conjugados da GnRH-FITC, a presença da GnRH-IV na superfície da célula, também é verificável pela experiência CLSM. Além disso, usando uma sonda fluorescente de ADN de coloração vermelho-extremo, é possível contracoloração os núcleos de células além .......
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Discussão
As experiências aqui descritas usar análogos de GnRH marcadas seletivamente para o rastreio aderente culturas de células in vitro. A microscopia confocal e métodos de citometria de fluxo são adequados para controlar e quantificar a absorção celular destes conjugados da GnRH-FITC em um momento e de modo dependente da concentração. Estas experiências têm os seguintes passos críticos: 1) manter uma cultura de células estéril e saudável; 2) péptidos GnRH deve ser de elevada qualidade; 3) concentrações ra.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O projeto foi apoiado pelo National Research Fund OTKA (K 104045).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Banco de células EBC-1 | JCRB | JCRB0820 | Carcinoma de células escamosas de pulmão humano |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Adenocarcinoma pancreático humano |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Carcinoma faríngeo humano |
| RPMI-1640 Meio com L-glutamina | Lonza | BE12-702F | Meio de cultura para células BxPC-3 |
| Eagle's Minimum Essential Meio | Lonza | BE12-611F | Meio de cultura para células EBC-1, e complementado com 0,1% de piruvato de sódio para células Detroit-562 |
| Soro Fetal Bovino | Euro Clone | ECS0180L | Complementa o meio de cultura |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complementa o meio de cultura (antibióticos) |
| Frascos de Cultura de Células de Linha Padrão | VWR | 10062-872 | Fornecem ambiente de crescimento consistente e estéril para células |
| Mistura de tripsina-EDTA | Lonza | BE17-161E | Remova as células anexadas |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvente |
| Dimetilsulfóxido | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solução Solvente |
| Trypan Blue, 0,4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Usado para contar células |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | feito por nós | - | Pureza ≥ 98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | feito por | nós-Pureza | ≥ 98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | feito por | nós-Pureza | ≥ 98% (HPLC) |
| lâmina microscópica de 8 poços com fundo de vidro | Ibidi | 80826 | Uso em experimento CLSM |
| Placa de cultura de células Corning Costar, 12 poços | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Uso em FACS experimento |
| Solução de fixação (10% de formalina tamponada neutra) | Bio-Optica | 01V60P | Fixar células aderentes |
| Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevenir a ligação inespecífica dos anticorpos |
| GnRHR Anticorpo Proteintech | 19950-1-AP | Reagente de imunocitoquímica, liga-se aos receptores GnRH tipo I humano | |
| Anticorpo secundário, conjugado Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Reagente de imunocitoquímica, liga-se ao anticorpo primário |
| Solução de sonda fluorescente (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Núcleos de contracoloração |
| Fluoromount Meio de Montagem Aquosa | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use em experimento CLSM, preservando a fluorescência |
| Microscópio invertido | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Verifique o fenótipo e a confluência das culturas celulares |
| Microscópio de varredura a laser confocal invertido | Zeiss | LSM-710 | Uso no experimento CLSM |
| Citômetro de fluxo | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Uso no experimento FACS |
Referências
- Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11(2016).
- Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
- Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K.
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Reimpressões e permissões
