Único Análise Molécula do laser localizadas psoralênica adutos

Resumo

Os lasers são frequentemente utilizados em estudos sobre a resposta celular a danos no ADN. No entanto, eles gerar lesões cujo espaçamento, de frequência, e colisões com garfos de replicação são raramente caracterizado. Aqui, descrevemos uma abordagem que permite a determinação destes parâmetros com a laser localizada ligações cruzadas intercadeias.

Resumo

A resposta de ADN de danos (DDR) foi extensivamente caracterizado em estudos de quebras na cadeia dupla (DSB) induzidas por irradiação com feixe de laser de micro em células vivas. A DDR de hélice distorcer modificações covalentes de ADN, incluindo ADN reticulações intercadeias (ICLs), não é bem definido. Estudamos o DDR estimulada por ICLs, localizada por fotoativação de laser de psoralenos immunotagged, nos núcleos de células vivas. A fim de abordar questões fundamentais sobre a distribuição aduto e encontros forquilha de replicação, combinamos localização laser com duas outras tecnologias. fibras de ADN são muitas vezes usadas para exibir o progresso de garfos de replicação por imunofluorescência de análogos de nucleósido incorporadas na pulsos curtos. pontos Immunoquantum têm sido amplamente empregados para uma única imagem molécula. Na nova abordagem, fibras de ADN a partir de células portadoras de laser localizada ICLs são espalhados sobre lâminas de microscópio. Os ICLs marcados são exibidos com pontos immunoquantum e the as distâncias inter-lesão determinada. colisões replicação garfo com ICLs podem ser visualizados e diferentes padrões de encontro identificados e quantificados.

Introdução

ADN está sob constante ataque de agentes exógenos, tais como a radiação, luz ultravioleta, toxinas ambientais, produtos de combustão, etc. Além disso, também é atacado por espécies de radicais endógenos produzidos pelo metabolismo oxidativo. Todos estes têm o potencial de perturbar química ou fisicamente a integridade do DNA ^1. Perturbações no genoma pode ativar a resposta DNA danos (DDR), um recrutamento e modificação cascata pós translacional com centenas, se não milhares, de proteínas e microRNAs envolvidos na reparação da lesão, regulação do ciclo celular, apoptose, senescência e vias inflamatórias ^2.

Protocolo

1. Preparação de Dig-TMP

1. Misturar 50 mg (0,18 mmoles) de 4'-clorometil-4,5' , 8-trimetilpsoraleno e 590 mg (2,7 mmoles) de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amina em uma seco 25 mL redondo -bottom frasco sob azoto. Adiciona-se 10 mL de tolueno e refluxo por 12 h. Remover o solvente em um evaporador rotativo sob pressão reduzida.
   1. Purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna intermitente através de gel de sílica. Elui-se a coluna com clorofórmio, metanol e solução de amoníaco a 28% (9: 1: 0,5). Evapora-se o solvente em um evaporador rotativo sob pressão reduzida, e recuperar o puro 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatride....

Resultados

ICLs laser localizadas Dig-TMP (Figura 1A) pode ser exibido através de imunofluorescência contra o Dig-tag ligada ao psoraleno. Embora o laser pode ser dirigido para atacar em qualquer uma área de contorno, listras não são formas "naturais" em células, e os sinais legítimos pode ser facilmente distinguido de artifícios devidos a ligação não específica por anticorpos primários ou secundários. Este recurso é útil quando se utiliza anticorpos inferiores a especifi.......

Discussão

A tecnologia de localização de laser requer o uso de células aderentes com núcleos que são visíveis em microscopia de campo claro. Tentámos para fixar as células não aderentes, tais como linfócitos primários, ou células cultivadas fracamente aderentes, tais como AD293, para a superfície de vidro com as preparações adesivas de células, tais como polilisina ou colagénio, ou misturas mais complexas. Embora esses tratamentos podem ligar-se as células à superfície, nós achamos que eles geralmente ficam arredondadas que torna.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Digoxigenina NHS éster	Sigma-Aldrich	11333054001
Cloro-psoraleno	Berry and Associates	PS 5000
diaminoglicol	Sigma-Aldrich	369519	4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanodiamina
Clorofórmio	Acros Organics	423550040
Metanol	Fisher Scientific	A4524
Solução de amônio	Placas Sigma-Aldrich	5002
TLC	Analtech, Inc.	P02511
Coluna de vidro Flass 24/40, 100 mL	Chemglass Life Sciences	CG-1196-02
Microscópio confocal de disco giratório Nikon T2000_E2, equipado com estágio automatizado e câmara de controle ambiental e suporte de placa	Perkin Elmer		com software Volocity
Micropoint Galvo	Andor Technologies		com laser pulsado de nitrogênio
célula de corante	Andor Technologies	MP-2250-2-365
365 corante	Andor Technologies	MP-27-365-DYE
IdU	Sigma-Aldrich	17125
35 mm 1.5 lamínula, diâmetro de vidro de 10 mm, lâminas	Matek	P35G-1.5-10-C
	Novo Fornecedor	# 5070	Novas Lâminas Silane
Anticorpo anti BrdU de rato (IdU)	BD Biosciences	347580	1 em 40
Anticorpo anti BrdU de rato (CldU)	Abcam	ab6326	1 em 200& nbsp;
Anticorpo anti-escavação de coelho	ThermoFisher Scientific	710019	1 em 200
Q-dot 655 cabra anti IgG de coelho	ThermoFisher Scientific	Q-11421MP	1 em 5.000
AF647- cabra anti rato IgG	Jackson Immunoresearch	112-605-167	1 em 100
AF488-cabra anti camundongo IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-166	1 em 100
Zeiss epifluorescente microscópio A200	Zeiss		com software Axiovision
Q-dot 655 filtro	Chroma	39107

Placas de vidro botomm de microscópio não revestidas Parte