Summary
Dit protocol beschrijft de in vitro vergelijking van twee belangrijke functionele kenmerken van rituximab: target binding en complement-dependent cytotoxicity (CDC) inductie. De methoden werden gebruikt voor een vergelijking tussen referentie rituximab en een rituximab biosimilar. Deze analyses kunnen worden gebruikt bij biosimilar ontwikkeling of als kwaliteitscontrole in hun productie.
Abstract
Therapeutische monoklonale antilichamen (mAbs) zijn op de behandeling van verschillende ziekten, waaronder kanker betrokken. De ontwikkeling van de biosimilar mAbs door farmaceutische bedrijven is een markt kans, maar het is ook een strategie om de drug de toegankelijkheid te verhogen en-therapie bijbehorende kosten te verlagen. De protocollen hier beschreven beschrijven de evaluatie van target binding en CDC inductie door rituximab in Daudi cellen. Deze twee functies vereisen verschillende structurele gebieden van het antilichaam en het klinische effect geïnduceerd door rituximab relevant zijn. De protocollen maken de zij-aan-zij vergelijking van een referentie rituximab en rituximab biosimilair gebracht. De geëvalueerde producten toonden verschillen, zowel in target binden en CDC inductie, wat suggereert dat er onderliggende fysisch-chemische verschillen en het benadrukken van de noodzaak om de gevolgen van die verschillen in de klinische setting te analyseren. De hier beschreven methoden vormen eenvoudig en goedkoop in vitro </ Em> modellen voor de evaluatie van de activiteit van rituximab biosimilars. Zo kunnen ze nuttig zijn bij biosimilar ontwikkeling, evenals voor kwaliteitscontrole bij biosimilar productie. Bovendien kunnen de gepresenteerde methoden worden geëxtrapoleerd aan andere therapeutische mAbs.
Introduction
Therapeutische antilichamen zijn recombinante monoklonale antilichamen (mAbs) ontwikkeld voor de behandeling van verschillende pathologieën, waaronder kanker, auto-immuun en chronische ziekten, neurologische stoornissen en anderen 1 . Momenteel heeft de FDA goedkeuring verleend aan meer dan 40 therapeutische mAbs, en er wordt verwacht dat de markt de komende jaren zal bereiken.
Rituximab is een chimerisch monoklonaal IgG1-antilichaam met hoge affiniteit, goedgekeurd voor de behandeling van CD20 + B-cel niet-Hodgkin's lymfoom (NHL), CD20 + folliculaire NHL, chronische lymfocytische leukemie en reumatoïde artritis 2 , 3 . De herkenning van CD20, die overexpressieert in B-cellen, door rituximab induceert apoptose; Complement activatie; En antilichaamafhankelijke cel gemedieerde cytotoxiciteit (ADCC) 3 . De octrooien van dit geneesmiddel verlopen in Europa en in de VS in 2013 en 2016, Respectievelijk. Zo ontwikkelen farmaceutische bedrijven wereldwijd rituximabbiosimilars. Zoals bij een ander geneesmiddel voor menselijke consumptie, biosimilars vereisen goedkeuring van regelgevende agentschappen. Internationale richtlijnen wijzen erop dat biosimilariteit voor mAb's moet worden aangetoond door de fysicochemische eigenschappen, farmacokinetiek, werkzaamheid en veiligheid van de nieuwe en referentieproducten 4 te vergelijken.
Bijgevolg moeten de methoden die in dergelijke vergelijkingen worden gebruikt, de structurele en functionele eigenschappen van de mAb's beoordelen, met name die met klinische relevantie. Daartoe tonen in vitro analyses verschillende voordelen ten opzichte van in vivo experimenten (beoordeeld in Chapman et al. ) 5 : i) in vitro studies zijn gevoeliger voor verschillen tussen de voorgestelde biosimilar en het referentieproduct; Ii) in vivo studies moeten worden uitgevoerd in relevante soorten, die voor veel mAbs zijnniet-menselijke primaten; en iii) omdat het werkingsmechanisme, preklinische toxicologie en klinische effecten van het referentieproduct zijn welbekend in vivo studies met biosimilaire kunnen aanvullende nuttige informatie wordt gegeven. Dienovereenkomstig, Begeleiding van de Europese Unie voor biosimilars laat kandidaten om klinische proeven op basis van robuuste in vitro data alleen 6 in te voeren.
Hier presenteren we twee snelle, economische en simpele testen die de biologische activiteit van rituximab te evalueren met behulp van CD20 + gekweekte cellen. Deze tests kunnen worden opgenomen als onderdeel van de vergelijkbaarheid oefening voor rituximab biosimilar kandidaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Evaluatie van Target Binding met flowcytometrie
- Bereiding van biologische materialen en reagentia
- Zorg 500 ml RPMI kweekmedium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (H-IFBS).
- Lymphoma (Daudi) cellen cultuur Daudi Burkitt's en Daudi GFP + cellen met behulp van RPMI en 75-cm2 kweekflessen. Handhaaf de kweken bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer totdat ze bereiken 6 - 9 x 10 5 cellen / ml.
- Voeg 50 ml vlekken buffer door verdunning van 1/100 H-IFBS in PBS; Deze buffer is stabiel bij 2-8 ° C gedurende ten minste één maand.
- Bereid de testoplossingen voor referentie en biosimilar mAbs. Voeg ten 1: 2 seriële verdunningen (500 pl elk) in buffer kleuring, uitgaande van 5 ug / ml.
- Met kleuringsbuffer menselijk IgG (isotype controle) verdund tot 5 ug / ml en PE-Cy5 muis-anti-humaan IgG (secundair antilichaam) aan de conCentratie voorgesteld door de fabrikant.
- Bereid 4% paraformaldehyde in PBS (fixatiebuffer).
- Doelbinding
- Verzamel de Daudi en Daudi GFP + cel suspensies van de 75 cm 2 kweek flessen en overbrengen ze naar een 15 ml centrifuge buis. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten.
- Was de cellen door 5 ml PBS toe te voegen en de cel suspensie bij 400 xg gedurende 5 minuten centrifugeren.
- Resuspendeer de cellen in PBS en voer een celtelling en levensvatbaarheidsanalyse met trypan blauw uit. Gebruik culturen met cellevendigheidsniveaus ≥ 95% voor de analyse.
- Verdun de cel suspensie naar 4 x 106 cellen / ml met koude kleuring buffer.
- Voeg in 1,5 ml microcentrifugebuizen 50 μL van de celsuspensie toe aan 100 μL van de verschillende testconcentraties van de referentie of biosimilar mAbs. Inclusief replicaten voor elke experimentele conditie.
- Bereid extra buizen voor deisotype controle (humaan IgG1 plaats van rituximab) en negatieve controle (secundair antilichaam zonder primair antilichaam).
- Incubeer bij 4 ° C gedurende 20-30 min.
- Was de cellen door toevoeging van 1 ml PBS en centrifugeren van de celsuspensie bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 10 ° C. Verwijder het supernatant.
- Suspendeer de cellen in 100 ul van het secundaire antilichaam en incubeer gedurende 20-30 min bij 4 ° C, beschermd tegen licht.
- Was de cellen tweemaal met PBS en suspendeer deze in 200 ul fixatiebuffer.
- Analyseer de cellen op een flowcytometer.
Opmerking: Het signaal blijft stabiel gedurende verscheidene dagen indien de monsters bij 4 ° C worden bewaard en beschermd tegen licht.
- data acquisitie
- Open twee dot-plots in een werkblad van de flowcytometer besturingssoftware. Stel de FSC-A versus FSC-H in de eerste en FSC-A versus SSA-A in het tweede. Open een histogram voor de PE-Cy5 kanaal.
- In de FSC-A versus FSC-H plot, maak een poort (R1) singlet events ( Figuur 1A ).
- Stel de R1-populatie in de FSC-A versus SSA-A-stip en maak vervolgens een nieuwe poort (R2) die doelcellen selecteert ( Figuur 1B ). Stel de R2-bevolking in het PE-Cy5-intensiteitshistogram in om de frequentieverdeling van de cellen te bekijken.
- Pas de onderste fluorescentie-intensiteit (FI) -grens voor het PE-Cy5-kanaal aan met behulp van de negatieve en isotype-besturing ( Figuur 1C ).
- Verkrijg 10.000 gebeurtenissen binnen R2 van het monster met de hogere concentratie van het referentieproduct. FI van deze steekproef moet de hoogst verwachte zijn ( Figuur 1C ).
- Verkrijg de rest van de monsters.
- Voor elk monster, ontvang de mediaan fluorescentie-intensiteit (MFI) in het PE-Cy5-kanaal.
- Voor monsters met de referentie of biosimilar mAb, bereken het verschil tussen monster MFI en die van de isotype control (ΔMFI).
2. Beoordeling van CDC
- Bereiding van biologische materialen en reagentia
- Bereid celkweekmedium en cultuur Daudi en Daudi GFP + cellen, zoals hierboven beschreven (stappen 1.1.1 - 1.1.2).
OPMERKING: Daarnaast is de CDC test vereist serum-vrij RPMI. - Verdund normaal menselijk serum complement (NHSC) 1: 2 met serumvrij RPMI. Bereid 2,5 ml.
- Bereid 1 ml met warmte geïnactiveerde (30 min / 56 ° C) NHSC 1: 2 verdund met RPMI.
- Bereid testreeksen oplossingen voor de referentie en biosimilar mAbs in serumvrij RPMI. Voeg ten verdunningen (200 pl elk) 1-0,025 gg / ml.
- Bereid celkweekmedium en cultuur Daudi en Daudi GFP + cellen, zoals hierboven beschreven (stappen 1.1.1 - 1.1.2).
- CDC-assay
- Verzamel de Daudi en Daudi GFP + cellen uit de kweken en kwantificeren van de cellevensvatbaarheid (zie stap 1.2.1 - 1.2.3).
- Bereid een celsuspensie met 4 x 10 5 cellen / ml in serumvrij RPMI.
- Toevoegen50 μl cel suspensie aan 50 μl van elke referentie of biosimilar mAb test concentratie in 96-putjes conische (V) -bottom microplaten. Inclusief replicaten voor elke experimentele conditie.
- Bijkomende putjes voorbereiden voor de negatieve controle ( dwz zonder mAb), basale sterftebeheersing ( bijv. Warmte-geïnactiveerde NHSC in aanwezigheid van mAb), en positieve controle kleuren ( dat wil zeggen cellen blootgesteld aan 50 μL 70% EtOH).
- Incubeer de cellen gedurende 20 - 30 min bij 37 ° C in een 5% CO 2 bevochtigde atmosfeer.
- Voeg 50 μL NHSC (verdund 1: 2) toe aan elke put en incuberen de opsoniseerde cellen gedurende 2,5 uur bij 37 ° C in een 5% CO 2 bevochtigde atmosfeer. Gebruik warmte-geïnactiveerde NHSC in de basale sterfte controle bronnen.
- Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 10 ° C. Gooi de supernatant weg.
- Was de cellen door 150 μl PBS toe te voegen en de cel suspensie gedurende 5 minuten bij 400 xg en 10 ° C centrifugeren. discard het supernatant.
- Vlekken op de monsters met 7-amino-actinomycine (7-AAD), zoals eerder beschreven 7, 8.
- Analyseer de cellen op een flowcytometer op dezelfde dag.
- data acquisitie
- Open twee dot-plots in een werkblad van de flowcytometer besturingssoftware. Stel de plots als in stap 1.3.1 - 1.3.3 (figuur 2A-B). Maak een derde grafiek die een dot-plot voor GFP versus 7-AAD de R2 populatie.
- Definieer de passende FI grenzen met de Daudi-cellen, Daudi GFP + cellen en dood positieve controle (Figuur 2C).
- Voor elk monster meet het percentage van 7-AAD + doelcellen. Verwerven ten minste 5000 gebeurtenissen uit R2.
- Bereken de specifieke mAb geïnduceerde cytotoxiciteit door het aftrekken van het percentage 7-AAD + in de basale dood besturing van het percentage gevonden in monsters met verschillenConcentraties van mAbs ( Figuur 2D ).
3. Biosimilarity Analysis
- Voer de concentratie- en reactiewaarden in in een grafische software.
- Grafieken genereren en niet-lineaire regressies berekenen met de volgende overwegingen: i) gebruik de log-transformatie van de mAb-concentratie als "X"; Ii) gebruik het variabele helling wiskundige model (Y = minimale respons + (maximale respons - minimale respons) / 1 + 10 ^ ((LogEC 50 -X) * Hill helling)); En iii) de bodemwaarden tot nul beperken, omdat de basale reactie is afgetrokken.
OPMERKING: Curves met een symmetrische sigmoïdale vorm worden verwacht. - Vergelijk beide niet-lineaire pasjes met een globale fit met behulp van een F-test (veel grafische software bevat deze functie).
OPMERKING: Dergelijke tests stellen als de nulhypothese vast dat de maximale respons, logEC 50 en de Hill-helling hetzelfde zijn voor de twee datasets, die overeenkomt met deBiologische vraag die bestemd is om te worden aangepakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de hierboven beschreven protocollen werden de doelbinding en de CDC-inductie van referentie-rituximab in parallel vergeleken met die van een biosimilar rituximab, geproduceerd en in de handel verkrijgbaar in Azië.
In Daudi cellen gebonden beide mAbs CD20 op een concentratieafhankelijke wijze ( Figuur 1D ). Niet-lineaire regressies van bindende gegevens vertoonden een r2 van 0.978 en 0.848 voor referentie en biosimilar rituximab, respectievelijk ( Figuur 1E ). Statistische analyse van de concentratie-responscurves toonde aan dat zij, en daarom de daaruit berekende farmacodynamische parameters, significant verschillen tussen mAb's (P <0,0001). De maximale respons voor de biosimilar was 2,16 keer lager dan die van het referentieproduct. Deze resultaten suggereren dat de twee geëvalueerde mAbs verschillende capaciteiten hebben om CD20 op mij te bindenMbrane van leukemische cellen.
CDC-inductie werd ook vergeleken met de twee mAbs. Referentie- en biosimilar producten stimuleren CDC in Daudi cellen op een concentratieafhankelijke manier ( Figuur 2E ). Belangrijk is dat de concentraties waarbij de mAb's geïnduceerde CDC verschillen van die welke nodig zijn voor doelbinding. Niet-lineaire regressies van de CDC-gegevens vertoonden r 2 > 0,980 voor beide producten. De statistische vergelijking van de concentratie-respons curves gaf aan dat ze significant verschillend zijn (P <0,01), waardoor de biosimilar minder krachtig zijn. Deze gegevens geven aan dat de capaciteit om CDC te induceren verschillend is voor de geanalyseerde mAbs.
Figuur 1. In Vitro Target-binding van anti-CD20 therapeutische mAbs. Daudi GFP + cellen werden blootgesteld om te verschillenent concentraties van de mAbs (4,8 ng / ml tot 5 ug / ml) en vervolgens gekleurd met PE-Cy5-geconjugeerd anti-humaan secundair antilichaam. Fluorescentie-intensiteit (FI) werd gemeten door flow cytometrie op individuele gebeurtenissen (A), die qua grootte en granulariteit overeenkomen met die van de Daudi cellen (B). Ongekleurde cellen (lichtgrijs), isotype controles (donkergrijs) en 5 ug / ml van het referentie rituximab (blauw) werden gebruikt om de FO grenzen (C) ingesteld. Beide mAbs geëvalueerd gebonden Daudi cellen op een concentratieafhankelijke manier (D). Reacties (ΔMFI; zie tekst) werden gebruikt voor concentratie-reactiekrommen te genereren voor referentie (blauw) of biosimilar (zwarte) rituximab (E). Statistische vergelijking van de niet-lineaire regressie werden verschillen tussen de mAbs (P <0,0001; Fisher exact test). Klik hier om een grotere versi bekijkenOp van deze figuur.
Figuur 2. CDC-inductie door anti-CD20 therapeutische mAbs. Daudi GFP + cellen opsonized met verschillende concentraties mAbs werden blootgesteld aan de menselijke complement. Celsterfte werd geëvalueerd door 7-AAD-kleuring en de flowcytometrische analyse van fluorescentie-intensiteit (FI) op enkele gebeurtenissen (A) , met grootte en korreliteit die overeenkomt met de Daudi-cellen (B) . Niet-gestippelde GFP- (zwarte) en GFP + (groene) cellen en met ethanol gedood cellen (rood) werden als controles (C) opgenomen. Kwantificering van de 7-AAD + -cellen in de basal-death control (grijs) en rituximab-monsters (blauw) toegestaan voor de berekening van de mAb-geïnduceerde cytotoxiciteit (D) . Concentratie-responscurves verkregen voor referentie (blauw) of biosimilar (zwart) rituximab (E). Statistische vergelijking van de niet-lineaire regressie werden verschillen tussen de responsen geïnduceerd door beide mAbs (P <0,01, Fisher exacte test). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Tabel 1. Monoklonale antilichamen goedgekeurd voor therapeutisch gebruik, met doelcellen voor CDC Assay. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het octrooivertreden van een therapeutisch mAb bevordert de ontwikkeling van biosimilaren. Zo is er behoefte aan eenvoudige methoden die verschillen kunnen identificeren in klinisch relevante activiteiten van deze producten. CD20 + gekweekte cellen werden gebruikt voor de evaluatie van twee belangrijke functionele kenmerken van rituximab: target binding en CDC inductie. De vroegere activiteit vereist de herkenning van CD20 door het Fab-gebied van het mAb, terwijl de laatste vooral afhankelijk is van de interactie van het Fc-gebied met zijn complement 9 . Daarom bieden deze analyses een manier om de structurele en functionele kenmerken van mAb's te koppelen.
De doelbinding van therapeutische mAb's wordt meestal geëvalueerd door isotherme titratie calorimetrie (ITC), oppervlakte plasmon resonantie (SPR) of biolayer interferometrie 10 , 11 , 12 . Deze analyses laten afFiniteitsberekening, maar ze hebben gespecialiseerde apparatuur en training nodig. Het hier beschreven protocol evalueert doelbinding in een side-to-side vergelijking om verschillen tussen producten te identificeren, zelfs zonder affiniteitsgegevens. De methode is eenvoudig en maakt gebruik van een relevante cellulaire context voor activiteitenbeoordeling. Aan de andere kant kan CDC-inductie door rituximab worden geëvalueerd door ATP-meting 13 , de kwantificering van vrijgegeven lactaatdehydrogenase (LDH) 14 of alamarBlue 15 en MTT assays 16 . De hier beschreven methode, met 7-AAD-kleuring, heeft een lage achtergrond en kan gecombineerd worden met andere vlekken voor multiparametrische flowcytometrische analyse.
In de representatieve experimenten die zijn gepresenteerd, passen de dosis-responscurves het vierparameter logistieke model in, waardoor de berekening van de EC 50 , Hill-helling en maximale respons mogelijk is. Met name de concentratieregelsons toegepast voor het genereren van dergelijke curves voor elke assay, waarin het belang analyseren en te definiëren adequate bereiken in voorlopige experimenten. Veranderingen in sleutelreagentia, zoals fluorochromen en complementen of het gebruik van een cellijn met een andere doelniveau, kan het effectieve bereik van concentraties te verplaatsen.
Statistische analyse geïdentificeerde verschillen tussen één partij een biosimilair rituximab handel verkrijgbaar in Azië en het referentieproduct, zowel in target binding en in CDC inductie. Het is belangrijk te bedenken dat, zelfs wanneer het vervaardigingsproces van de mAbs strak geregeld, elk kenmerk van het referentieproduct wordt een range. Dienovereenkomstig, het minimum aantal batches die moeten worden getest tijdens de evaluatie van een soortgelijke biotherapeutic afhankelijk van de mate van variabiliteit van het referentieproduct en het analysevariabiliteit 4 .Thus, moeten deze protocollen worden toegepast op verschillemNt batches tijdens de evaluatie van vergelijkbaarheid.
De gepresenteerde methoden kunnen geëxpoleerd worden naar andere paren therapeutische mAbs-doelen, zolang de cellen die het antigeen uitdrukken, toegankelijk zijn. Tabel 1 geeft therapeutische mAbs anders dan rituximab voor welke CDC-inductie relevant is voor de klinische werkzaamheid en stelt informatie op voor de eerder gemelde cellulaire modellen voor elk mAb.
Ten slotte zijn de twee analyses die hier beschreven zijn eenvoudig, snel en goedkoop, waardoor ze in de meeste laboratoria kunnen worden uitgevoerd. De methoden kunnen worden gebruikt tijdens vroege stappen van biosimilar ontwikkeling of na de wettelijke goedkeuring voor batch-to-batch vergelijking tijdens de productie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
N. Salinas-Jazmín, E. González-González en SM Pérez-Tapia zijn medewerkers van UDIBI, die biosimilariteitsstudies uitvoert voor verschillende farmaceutische bedrijven.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen erkenningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
References
- Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
- Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a Proposed Biosimilar RTXM83 and the Originator Rituximab. Bio Drugs. 30 (3), 225-231 (2016).
- Iwamoto, N., et al. Validated LC/MS Bioanalysis of Rituximab CDR Peptides Using Nano-surface and Molecular-Orientation Limited (nSMOL) Proteolysis. Biol Pharm Bull. 39 (7), 1187-1194 (2016).
- World Health Organization. Guidelines on evaluation of monoclonal antibodies as similar biotherapeutic products (SBPs). , Available from: http://www.who.int/biologicals/expert_committee/mAb_SBP_GL-ECBS_review_adoption-2016.10.26-11.7post_ECBS-Clean_Version.pdf (2016).
- Chapman, K., et al. Waiving in vivo studies for monoclonal antibody biosimilar development: National and global challenges. MAbs. 8 (3), 427-435 (2016).
- EMA, EMEA/CHMP/BMWP/42832/2005 Rev1. Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: non-clinical and clinical issues. , Available from: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/01/WC500180219.pdf (2014).
- Zembruski, N. C., et al. 7-Aminoactinomycin D for apoptosis staining in flow cytometry. Anal Biochem. 429 (1), 79-81 (2012).
- Salinas-Jazmin, N., Hisaki-Itaya, E., Velasco-Velazquez, M. A. A flow cytometry-based assay for the evaluation of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) in cancer cells. Methods Mol Biol. 1165, 241-252 (2014).
- Teeling, J. L., et al. The Biological Activity of Human CD20 Monoclonal Antibodies Is Linked to Unique Epitopes on CD20. J Immunol. 177 (1), 362-371 (2006).
- Miranda-Hernandez, M. P., et al. Assessment of physicochemical properties of rituximab related to its immunomodulatory activity. J Immunol Res. 2015, 910763 (2015).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Ylera, F., et al. Off-rate screening for selection of high-affinity anti-drug antibodies. Anal Biochem. 441 (2), 208-213 (2013).
- Broyer, L., Goetsch, L., Broussas, M. Evaluation of complement-dependent cytotoxicity using ATP measurement and C1q/C4b binding. Methods Mol Biol. 988, 319-329 (2013).
- Herbst, R., et al. B-cell depletion in vitro and in vivo with an afucosylated anti-CD19 antibody. J Pharm Exp Ther. 335 (1), 213-222 (2010).
- Lazar, G. A., et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (11), 4005-4010 (2006).
- Winiarska, M., et al. Statins impair antitumor effects of rituximab by inducing conformational changes of CD20. PLoS medicine. 5 (3), e64 (2008).
- Zhou, X., Hu, W., Qin, X. The role of complement in the mechanism of action of rituximab for B-cell lymphoma: implications for therapy. Oncologist. 13 (9), 954-966 (2008).
- Hayashi, K., et al. Gemcitabine enhances rituximab-mediated complement-dependent cytotoxicity to B cell lymphoma by CD20 upregulation. Cancer Sci. 107 (5), 682-689 (2016).
- Mossner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
- Lapalombella, R., et al. A novel Raji-Burkitt's lymphoma model for preclinical and mechanistic evaluation of CD52-targeted immunotherapeutic agents. Clin Cancer Res. 14 (2), 569-578 (2008).
- Mitoma, H., et al. Mechanisms for cytotoxic effects of anti-tumor necrosis factor agents on transmembrane tumor necrosis factor alpha-expressing cells: comparison among infliximab, etanercept, and adalimumab. Arthritis Rheum. 58 (5), 1248-1257 (2008).
- Kaymakcalan, Z., et al. Comparisons of affinities, avidities, and complement activation of adalimumab, infliximab, and etanercept in binding to soluble and membrane tumor necrosis factor. Clin Immunol. 131 (2), 308-316 (2009).
- Zent, C. S., et al. Direct and complement dependent cytotoxicity in CLL cells from patients with high-risk early-intermediate stage chronic lymphocytic leukemia (CLL) treated with alemtuzumab and rituximab. Leuk Res. 32 (12), 1849-1856 (2008).
- Goswami, M. T., et al. Regulation of complement-dependent cytotoxicity by TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 35 (15), 1888-1898 (2016).
- Wang, A., et al. Induction of anti-EGFR immune response with mimotopes identified from a phage display peptide library by panitumumab. Oncotarget. , (2016).
- Ueda, N., et al. The cytotoxic effects of certolizumab pegol and golimumab mediated by transmembrane tumor necrosis factor alpha. Inflamm Bowel Dis. 19 (6), 1224-1231 (2013).
- Nesbitt, A., et al. Mechanism of action of certolizumab pegol (CDP870): in vitro comparison with other anti-tumor necrosis factor alpha agents. Inflamm Bowel Dis. 13 (11), 1323-1332 (2007).
- Teeling, J. L., et al. Characterization of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin lymphomas. Blood. 104 (6), 1793-1800 (2004).
