Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

שיטות ויטרו להשוואת יעד מחייב CDC אינדוקציה בין נוגדנים טיפוליים: יישומים ניתוח Biosimilarity

Published: May 4, 2017 doi: 10.3791/55542
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 4,5, 6
1Unit for Development and Research in Bioprocesses Unit (UDIBI), National School of Biological Sciences, National Polytechnic Institute (IPN), University of Mexico (UNAM), 2School of Chemistry, National Autonomous University of Mexico (UNAM), 3Graduate Program in Chemical Sciences, National Autonomous University of Mexico (UNAM), 4Unit for Development Research and Medical Innovation in Biotechnology (UDIMEB), National School of Biological Sciences, National Polytechnic Institute (IPN), 5Department of Immunology, National Scool of Biological Sciences, National Polytechnic Institute (IPN), 6Department of Pharmacology and Unit of Translational Biomedicine (CMN 20 de noviembre), School of Medicine, National Autonomous University of Mexico (UNAM)

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההשוואה חוץ גופייה של שני מאפיינים פונקציונליים מפתח של rituximab: היעד מחייב ולהשלים תלוי רעיל לתאים (CDC) אינדוקציה. השיטות הועסקו לקבלת השוואה מפורטת ל-צדדי בין rituximab הפניה ו biosimilar rituximab. מבחנים אלה יכולים להיות מועסקים במהלך פיתוח biosimilar או כמו בקרת איכות בייצור שלהם.

Abstract

נוגדנים חד שבטיים טיפוליים (מבז) רלוונטיים לטיפול בפתולוגיות שונה, לרבות סרטן. ההתפתחות מבז biosimilar ידי חברות תרופות היא הזדמנות בשוק, אבל זה גם אסטרטגיה להגדלת נגישות תרופה ולהפחית עלויות הקשורות בטיפול. הפרוטוקולים המפורטים כאן לתאר את ההערכה של יעד מחייב ואינדוקצית CDC ידי rituximab בתאים דאודי. שני תפקידים אלה דורשים אזורים מבניים שונים של הנוגדנים והן רלוונטיים האפקט הקליני מושרה על ידי rituximab. הפרוטוקולים מאפשרים מצד אל צד השוואה של rituximab הפניה ו biosimilar rituximab משווקים. המוצרים העריכו הראו הבדלים הוא יעד מחייב ואינדוקצית CDC, דבר המצביעים על כך שיש הבדלי physicochemical בסיסיים הדגשת הצורך לנתח את ההשפעה של הבדלים אלה במסגרת הקלינית. השיטות דיווחו כאן מהווים פשוט וזול במבחנה </ Em> מודלים להערכת הפעילות של biosimilars rituximab. לכן, הם יכולים להיות שימושיים במהלך פיתוח biosimilar, כמו גם עבור בקרת איכות בייצור biosimilar. יתר על כן, השיטות שהוצגו ניתן להסיק על מבז טיפולי אחר.

Introduction

נוגדנים טיפוליים הם נוגדנים מונוקלונליים רקומבינלים (mAB) שפותחו לטיפול בפאתולוגיות שונות, כולל סרטן, מחלות אוטואימוניות וכרוניות, הפרעות נוירולוגיות ועוד. נכון לעכשיו, ה- FDA נתן אישור ליותר מ 40 mBbs טיפולית, ועוד צפויים להגיע לשוק בשנים הבאות.

Rituximab הוא נוגדנים חד-כיווניים חד-כיווניים מסוג IgG1, שאושרו לטיפול ב- CD20 + B ללא לימפומה שאינה הודג'קין (NHL), CD20 + NHL פוליקולרי, לוקמיה לימפוציטית כרונית ודלקת מפרקים שגרונית 2 , 3 . ההכרה של CD20, אשר overexpressed ב B תאים, על ידי rituximab גורם אפופטוזיס; הפעלה משלימה; ואת תאי נוגדנים התאים בתיווך cytotoxicity (ADCC) 3 . פטנטים של תרופה זו פג באירופה ובארצות הברית בשנים 2013 ו 2016, בהתאמה. לפיכך, חברות תרופות ברחבי העולם מפתחים rituximab biosimilars. כמו בכל תרופה אחרת עבור הצריכה האנושית, biosimilars דורשים אישור מסוכנויות רגולטוריות. הנחיות בינלאומיות מראות כי עבור mBbs, biosimilarity צריך להיות מוכח על ידי השוואת המאפיינים הפיזיוכימיים, פרמקוקינטיקה, יעילות, ובטיחות של מוצרים חדשים התייחסות 5 .

לפיכך, המתודולוגיות המשמשות להשוואה זו חייבות להעריך את המאפיינים המבניים והתפקודיים של ה- MBBS, במיוחד אלו עם רלוונטיות קלינית. לשם כך, מבחני מבחנה מראים מספר יתרונות בניסויי vivo (שנבדקו ב- Chapman et al. ) 5 : i) במחקרים חוץ גופית רגישים יותר להבדלים בין הביוסימלר המוצע לבין מוצר הייחוס; Ii) במחקרים vivo חייב להתבצע מינים רלוונטיים, אשר עבור mAB רביםפרימטים לא אנושיים; ו iii) מאז מנגנון הפעולה, דוח הרעלים פרה-קליניים, ואת ההשפעות הקליניות של המוצר הפניה ידועים, במחקרים vivo עם biosimilars לא יכול לספק מידע שימושי נוסף. בהתאם לכך, ההנחיה של האיחוד האירופי עבור biosimilars מאפשרת מועמדים להיכנס לניסויים קליניים מבוססים על חזקה בנתונים במבחנה לבד 6.

כאן, אנו מציגים שני מהר, כלכליים, ואת מבחנים פשוטים להעריך את הפעילות הביולוגית של rituximab באמצעות CD20 + תאים בתרבית. מבחנים אלה יכולים להיכלל במסגרת תרגיל ההשוואה למועמדי biosimilar rituximab.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הערכת יעד מחייב על ידי cytometry זרימה

  1. הכנת חומרים ביולוגיים וריאגנטים
    1. הפוך 500 מ"ל של המדיום תרבות RPMI בתוספת 10% חום- inactivated עוברית בסרום עוברי (H-IFBS).
    2. התרבות של דודי Burkitt של לימפומה (דאודי) תאים דאודי GFP + תאים באמצעות RPMI ו 75 ס"מ 2 צלוחיות תרבות. לשמור על תרבויות על 37 מעלות צלזיוס באווירה 5% CO 2 humidified עד שהם מגיעים 6 - 9 x 10 5 תאים / מ"ל.
    3. הפוך 50 מ"ל של חיץ מכתים על ידי דילול 1/100 H-IFBS ב PBS; זה חיץ יציב ב 2 - 8 מעלות צלזיוס למשך חודש לפחות.
    4. הכן את פתרונות הבדיקה עבור התייחסות ו biosimilar mBbs. הפוך עשר 1: 2 דילולים סדרתי (500 μL כל) במאגר מכתים, החל מ 5 מיקרוגרם / מ"ל.
    5. השתמש חיץ מכתים לדלל אדם IgG (בקרת isotype) עד 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו- PE-Cy5 העכבר אנטי אנושי IgG (נוגדנים משני) כדי conסנט הציע על ידי היצרן.
    6. הכן paraformaldehyde 4% ב PBS (חיץ קיבעון).
  2. כריכה מכוונת
    1. איסוף דאודי דאודי GFP + תא המתלים מן 75 ס"מ 2 צלוחיות תרבות ולהעביר אותם צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. צנטריפוגה ב XG 400 במשך 5 דקות.
    2. שטפו את התאים על ידי הוספת 5 מ"ל של PBS ו centrifuging ההשעיה התא ב XG 400 במשך 5 דקות.
    3. Resuspend התאים PBS ולבצע ספירת תאים ניתוח הכדאיות עם כחול trypan. שימוש בתרבויות עם רמות הכדאיות התא ≥ 95% לניתוח.
    4. לדלל את ההשעיה התא עד 4 x 10 6 תאים / מ"ל ​​עם חיץ מכתים קרים.
    5. ב 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge, להוסיף 50 μL ההשעיה התא 100 μL של ריכוזי הבדיקה שונים של התייחסות או mBbs biosimilar. כלול משכפל עבור כל תנאי הניסוי.
    6. הכן צינורות נוספים עבוראלוטיפ (IgG1 האנושי במקום rituximab) ובקרה שלילית (נוגדנים משני ללא נוגדן ראשוני).
    7. לדגור על C 4 ° עבור 20 - דקות 30.
    8. שוטפים את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS ו צנטריפוגה ההשעיה תא 400 XG במשך 5 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. בטל supernatant.
    9. להשעות את התאים 100 μL של נוגדנים משני דגירה במשך 20 - 30 דקות ב 4 ° C, מוגן מפני אור.
    10. פעמיים לשטוף את התאים עם PBS ו להשעות אותם 200 μL של חיץ קיבעון.
    11. נתח את התאים על cytometer זרימה.
      הערה: האות נשאר יציב במשך כמה ימים אם הדגימות נשמרות ב 4 מעלות צלזיוס ומוגנת מפני אור.
  3. רכישת נתונים
    1. dot-חלקות פתוחות שתי בגיליון של הזרימה cytometer תוכנת הפעלה. הגדר את-A FSC לעומת FSC-H ב הראשון ואת-A FSC מול-A SSA בשנייה. פתח היסטוגרמה עבור ערוץ PE-Cy5.
    2. בשנתי ה FSC-A לעומת עלילת FSC-H, לבצע שער (R1) אירועי גופיית בחירה (איור 1A).
    3. הגדר את אוכלוסיית R1 ב-A FSC לעומת SSA-בתלקה נקודה ולאחר מכן לבצע שער חדש (R2) בחירת תאי יעד (איור 1B). הגדר את אוכלוסיית R2 בהיסטוגרמה עוצמת PE-Cy5 כדי להציג את התפלגות התדירות של התאים.
    4. כוון את עוצמת הקרינה נמוכה (FI) מגבלה עבור ערוץ PE-Cy5 באמצעות השלט שלילי אלוטיפ (איור 1C).
    5. רכישת 10,000 אירועים בתוך R2 מן המדגם עם הריכוז הגבוה של מוצר הפנייה. FI של מדגם זה צריך להיות צפוי הגבוה ביותר (איור 1C).
    6. רוכש את שאר הדגימות.
    7. עבור כל דגימה, לקבל את עוצמת הקרינה החציונית (MFI) בערוץ PE-Cy5.
    8. לקבלת דוגמיות עם הפניה או מב biosimilar, לחשב את ההבדל בין מדגם MFI ושל אלוטיפ (ΔMFI).

2. הערכה של ה- CDC

  1. הכנת חומרי ריאגנטים ביולוגיים
    1. הכן תרבות בינוני תרבית תאים דאודי ו דאודי GFP + תאים כמתואר לעיל (צעדים 1.1.1 - 1.1.2).
      הערה: בנוסף, assay CDC דורש RPMI סרום ללא.
    2. לדלל השלמה בסרום אדם נורמלי (NHSC) 1: 2 עם RPMI סרום ללא. כן 2.5 מיליליטר.
    3. הכן 1 מ"ל של חום מומת (30 דקות / 56 מעלות צלזיוס) NHSC מדולל 1: 2 עם RPMI.
    4. כן סטים של פתרונות בדיקות עבור ההתייחסות מבז biosimilar ב RPMI סרום ללא. הפוך עשרה דילולים (200 μL כל) החל מ 1 כדי .025 מיקרוגרם / מ"ל.
  2. assay CDC
    1. אוסף את תאי דאודי ו דאודי GFP + מן התרבויות ולכמת את כדאיות התא (ראה צעדים 1.2.1 - 1.2.3).
    2. כן השעית תא עם 4 x 10 5 תאים / מיליליטר ב RPMI סרום ללא.
    3. לְהוֹסִיף50 μL של השעית תא 50 μL של כל הפניה או ריכוז מבחן מב biosimilar ב 96-היטב חרוטים (V) -bottom microplates. כלול משכפל עבור כל תנאי הניסוי.
    4. הכן בארות נוספות עבור הביקורת השלילית (כלומר, בלי מב), בקרת מות בסיס (כלומר, חום מומת NHSC בנוכחות מב), ובקרת מכתים חיובית (כלומר, תאים נחשפים 50 μL של 70% EtOH).
    5. דגירה התאים למשך 20 - 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified 5% CO 2.
    6. להוסיף 50 μL של NHSC (מדולל 1: 2) זה טוב דגירה התאים opsonized עבור 2.5 שעות ב 37 ° C באווירה humidified 5% CO 2. השתמש NHSC חום מומת בבארות מלאות מוות הבסיסיות.
    7. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. בטל supernatant.
    8. שוטפים את התאים על ידי הוספת 150 μL של PBS ו צנטריפוגה ההשעיה תא עבור 5 דקות ב 400 XG ו 10 מעלות צלזיוס. discard supernatant.
    9. כתם דגימות עם 7-aminoactinomycin (7-AAD), כפי שתוארו לעיל 7, 8.
    10. נתח את התאים על cytometer הזרים באותו היום.
  3. רכישת נתונים
    1. dot-חלקות פתוחות שתי בגיליון של הזרימה cytometer תוכנת הפעלה. גדר אלה חלקים כמו צעדים 1.3.1 - 1.3.3 (איור 2 א-ב). צור עלילה שלישית כי היא מזימה-נקודה עבור GFP לעומת 7-AAD על אוכלוסיית R2.
    2. הגדר את גבולות FI הנאותים באמצעות תאי דאודי, תאי דאודי GFP +, ומות ביקורת חיובית (איור 2C).
    3. עבור כל דגימה, למדוד את אחוז 7-AAD + תאי יעד. לרכוש לפחות 5000 אירועים מ R2.
    4. חשב את הרעילויות לתאים מב-induced המבוקשים על ידי הפחתת שיעור 7-AAD + בבקרת המוות הבסיסית מן האחוז שנמצא בדגימות עם הנבדליםריכוז ent של mAB ( איור 2 ד ).

3. ניתוח biosimilarity

  1. הזן את ערכי הריכוז והתגובה לתוכנת גרפים.
  2. ליצור גרפים ולחשב רגרסיות לא ליניאריות עם השיקולים הבאים: i) להשתמש ביומן השינוי של ריכוז mAb כמו "X"; ) 2 השתמש במודל המשתנה המתמטי של השיפוע (תגובה מינימלית של Y = (תגובה מקסימלית - תגובה מינימלית) / 1 + 10 ^ ((לוגק 50 - X *) גבעה)); ו iii) להגביל את הערכים התחתונים לאפס, מאז התגובה הבסיסית כבר מופחת.
    הערה: עקומות עם צורה סיגמואידית סימטרי צפויים.
  3. השווה הן לא ליניארי מתאים עם התאמה גלובלית באמצעות F-test (תוכנות גרפים רבים כוללים תכונה זו).
    הערה: בדיקות אלה קובעות כי השערת האפס כי התגובה המקסימלית, logec 50 , ואת המדרון גבעה זהים עבור שני מערכי הנתונים, אשר תואם אתהשאלה הביולוגית שנועדה לטפל בה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות הפרוטוקולים שתוארו לעיל, למקד מחייב ואת אינדוקצית CDC של rituximab ההתייחסות הושוותה במקביל לאלו של rituximab biosimilar פיק למסחרי אסיה.

בתאים דאודי, הוא מבז כבול CD20 באופן ריכוז תלוי (האיור 1D). רגרסיות שאינו לינארי של נתונים מחייב הפגינה r 2 של 0.978 ו 0.848 לעיון ו rituximab biosimilar, בהתאמה (איור 1E). ניתוח סטטיסטי של עקומות ריכוז בתגובה הראה שהם, ולכן הפרמטרים pharmacodynamic מחושבים מהם, הם שונים באופן משמעותי בין מבז (P <0.0001). התגובה מירבית עבור biosimilar הייתה 2.16-לקפל נמוכים מזו של מוצר הפנייה. תוצאות אלו מעידות כי שני מהבז העריך יש יכולות שונות כדי לאגד CD20 הביע על ליMbrane של תאים לוקמיה.

אינדוקציה ה- CDC הושווה גם לשני mBbs. הפניה מוצרים biosimilar עורר CDC בתאים דאודי באופן תלוי ריכוז ( איור 2E ). חשוב לציין, הריכוז שבו mBbs המושרה CDC היו שונים מאלה הנדרשים עבור מחייב היעד. רגרסיות לא לינאריות של נתוני ה- CDC הראו r 2 > 0.980 עבור שני המוצרים. ההשוואה הסטטיסטית של עקומות ריכוז התגובה הראתה כי הם שונים משמעותית (P <0.01), מה שהופך את biosimilar פחות חזק. נתונים אלה מראים כי היכולת לגרום CDC שונה עבור mBbs נותחו.

איור 1
איור 1. ב Vitro יעד מחייב של Anti-CD20 טיפולית mAbs. דאודי GFP + תאים נחשפו שוניםריכוזי אף אוזן גרון של מבז (4.8 ננוגרם / מ"ל ​​ל 5 מיקרוגרם / מ"ל) ולאחר מכן מוכתם נוגדנים משני PE-Cy5 מצומדות אנטי-אנושי. עוצמת קרינה (FI) נמדדה על ידי זרימת cytometry על אירועים יחידים (א), עם גודל גרעיניות המתאים לאלו של תאי דאודי (B). תאים בלא כתם (אפור בהיר), שולטת אלוטיפ (אפור כהה), ו 5 מיקרוגרם / מ"ל של rituximab הפניה (כחול) הועסקו כדי להגדיר את גבולות FI (C). שניהם מבז העריך כבול תאים דאודי באופן ריכוז תלוי (D). תגובות (ΔMFI; ראה טקסט) שימשו להפקת עקומות ריכוז התגובה לעיון (כחול) או biosimilar (שחור) Rituximab (E). השוואה סטטיסטית של רגרסיות הלא-לינארית הראתה הבדלים בין מבז (P <0.0001; מבחן מדויק פישר). אנא לחץ כאן כדי לצפות versi גדולעל נתון זה.

איור 2
איור 2. CDC אינדוקציה על ידי Anti-CD20 טיפול mAbs. Daudi GFP + תאים opsonized עם ריכוזים שונים של MAB נחשפו המשלים האנושי. מוות Cell הוערך על ידי מכתים 7-AAD וניתוח cytometric זרימה של עוצמת הקרינה (FI) על אירועים בודדים (A) , עם גודל ופרטיות המתאימים תאים דאודי (B) . Unfained GFP- (שחור) ו- GFP + (ירוק) תאים ואתנול נהרג תאים (אדום) נכללו שולט (ג) . כימות של תאים 7-AAD + בשליטה הבסיסית למוות (אפור) ודגימות rituximab (כחול) מותר לחישוב cybotoxicity mbb המושרה (D) . עקומות ריכוז תגובה שהושגו עבור הפניה (כחול) או biosimilar (שחור) rituximab (E). השוואה סטטיסטית של רגרסיות לא לינאריות הראתה הבדלים בין התגובות המושרות על ידי שני mBbs (P <0.01, פישר הבדיקה המדויקת). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

שולחן 1
טבלה 1. נוגדנים מונוקלונליים מאושרים לשימוש תרופתי, עם תאי מטרה עבור Assay ה- CDC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפטנט הפטנט של mAb טיפולית מקדמת את הפיתוח של biosimilars. לכן, יש צורך בשיטות פשוטות אשר יכולים לזהות הבדלים בפעילות רלוונטית קלינית של מוצרים אלה. CD20 + תאים מתורבתים הועסקו להערכת שני מאפיינים תפקודיים מרכזיים של rituximab: מחייב יעד אינדוקציה CDC. הפעילות הראשונה דורשת הכרה של CD20 על ידי אזור פאב של mBb, ואילו האחרון תלוי בעיקר על האינטראקציה של אזור Fc עם משלימה שלה 9 . לכן, מבחני אלה מספקים דרך לקשר את המאפיינים המבניים והתפקודיים של mBbs.

מחייב היעד של mBbs טיפולית מוערך בדרך כלל על ידי איסטותרמי טיטרציה קלורימטרי (ITC), תהודה פלסמון פני השטח (SPR), או interolometry biolayer 10 , 11 , 12 . מבחני אלה מאפשרים afחישוב finity, אבל הם דורשים ציוד והכשרה. הפרוטוקול המתואר כאן מעריך יעד מחייב השוואת צד אל הצד כדי לזהות הבדלים בין מוצרים, גם ללא נתוני עניין. השיטה היא פשוטה והיא מעסיקה בהקשר הסלולר רלוונטי עבור הערכת פעילות. מצד שני, אינדוקציה CDC ידי rituximab ניתן להעריך על ידי מדידת ה- ATP 13, כימות של לקטט דהידרוגנאז שוחרר (LDH) 14 או alamarBlue 15, ו MTT מבחני 16. השיטה דיווחה כאן, באמצעות מכתים 7-AAD, יש רקע נמוך והוא יכול להיות משולב עם כתמים אחרים לניתוח הזרימה cytometric multiparametric.

בניסויי הנציגים המוצגים, עקומות מנת תגובה מצוידות הדגם הלוגיסטי ארבעת הפרמטר, המאפשרות חישוב של 50 EC, מדרון גבעה, ותגובה מירבית. יש לציין, הטווחים של concentrations מועסק על מנת ליצור עקומות כאלה היו שונות עבור כל assay, המדגיש את החשיבות של ניתוח והגדרת טווח נאות בניסויים ראשוניים. שינויי ריאגנטים מפתח, כגון fluorochromes ומוצר משלים, או שימוש שורת תאים עם רמת יעד שונה, עלולים לתפוס את טווח הריכוזים היעיל.

ניתוח סטטיסטי זיהה הבדלים בין תצווה אחת של rituximab biosimilar הזמין מסחרי באסיה מוצר הפנייה, הוא יעד מחייב וב אינדוקצית CDC. חשוב לקחת בחשבון כי, גם כאשר תהליך הייצור של מבז נתונה לפיקוח הדוק, כל תכונה של מוצר הפנית מציג טווח. בהתאם לכך, המספר המזערי של אצוות כי צריך להיבדק במהלך ההערכה של biotherapeutic דומה תלוי במידה של השתנות של המוצר הייחוס על השתנות assay 4 .Thus, פרוטוקולים אלה יש להחיל DiffereNT יצוות במהלך הערכת יכולת ההשוואה.

השיטות שהוצגו ניתן להסיק על זוגות אחרים של מבז-טיפולי מעניין, כל עוד התאים המבטאים את האנטיגן נגישים. טבלת 1 רשימות טיפוליות מבזים מלבד rituximab עבורו אינדוקצית CDC רלוונטית יעילות הקלינית ומכינה מידע על דגמי הסלולר שדווחו בעבר לכל מב.

לסיכום, שני המבחנים המתוארים כאן הם פשוטים, מהירים, ולא יקרים, המאפשרים ביצוע שלהם ברוב המעבדות. השיטות ניתן להשתמש במהלך השלבים המוקדמים של פיתוח biosimilar או לאחר אישור רגולטורי עבור אצווה ל-אצווה השוואה במהלך הייצור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

N. Salinas-Jazmín, E. González-González ו- SM Pérez-Tapia הם עובדי UDIBI, אשר מבצעת מחקרים ביוסימילאריות עבור מספר חברות תרופות.

Acknowledgments

למחברים אין תודות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 medium ATCC 30-2001 Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution Sigma T8154 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells ATCC CCL-213 You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 16000-044 You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement Quidel A113 It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D BDPharmigen 559925 You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG BDPharmigen 551497 Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer
Human IgG Isotype Control ThermoFisher Scientific 07-7102 Change depending to mAb
BDCytofix BDPharmigen 554655 Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) GIBCO 70011-044 Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom Corning 29442-068 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab) Roche — Reference product
Rituximab Indian — Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes Corning 430290 or 430052 —
Pipette Tips Eppendorf — Multiple volume configurations are necessary
Pipettes Eppendorf — Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model Eppendorf — Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer BD Dickinson — BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope Olympus — To quantify and evaluate cell growth
Incubator SANYO — Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet CHC BIOLUS — Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
  2. Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a Proposed Biosimilar RTXM83 and the Originator Rituximab. Bio Drugs. 30 (3), 225-231 (2016).
  3. Iwamoto, N., et al. Validated LC/MS Bioanalysis of Rituximab CDR Peptides Using Nano-surface and Molecular-Orientation Limited (nSMOL) Proteolysis. Biol Pharm Bull. 39 (7), 1187-1194 (2016).
  4. World Health Organization. Guidelines on evaluation of monoclonal antibodies as similar biotherapeutic products (SBPs). , Available from: http://www.who.int/biologicals/expert_committee/mAb_SBP_GL-ECBS_review_adoption-2016.10.26-11.7post_ECBS-Clean_Version.pdf (2016).
  5. Chapman, K., et al. Waiving in vivo studies for monoclonal antibody biosimilar development: National and global challenges. MAbs. 8 (3), 427-435 (2016).
  6. EMA, EMEA/CHMP/BMWP/42832/2005 Rev1. Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: non-clinical and clinical issues. , Available from: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/01/WC500180219.pdf (2014).
  7. Zembruski, N. C., et al. 7-Aminoactinomycin D for apoptosis staining in flow cytometry. Anal Biochem. 429 (1), 79-81 (2012).
  8. Salinas-Jazmin, N., Hisaki-Itaya, E., Velasco-Velazquez, M. A. A flow cytometry-based assay for the evaluation of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) in cancer cells. Methods Mol Biol. 1165, 241-252 (2014).
  9. Teeling, J. L., et al. The Biological Activity of Human CD20 Monoclonal Antibodies Is Linked to Unique Epitopes on CD20. J Immunol. 177 (1), 362-371 (2006).
  10. Miranda-Hernandez, M. P., et al. Assessment of physicochemical properties of rituximab related to its immunomodulatory activity. J Immunol Res. 2015, 910763 (2015).
  11. Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
  12. Ylera, F., et al. Off-rate screening for selection of high-affinity anti-drug antibodies. Anal Biochem. 441 (2), 208-213 (2013).
  13. Broyer, L., Goetsch, L., Broussas, M. Evaluation of complement-dependent cytotoxicity using ATP measurement and C1q/C4b binding. Methods Mol Biol. 988, 319-329 (2013).
  14. Herbst, R., et al. B-cell depletion in vitro and in vivo with an afucosylated anti-CD19 antibody. J Pharm Exp Ther. 335 (1), 213-222 (2010).
  15. Lazar, G. A., et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (11), 4005-4010 (2006).
  16. Winiarska, M., et al. Statins impair antitumor effects of rituximab by inducing conformational changes of CD20. PLoS medicine. 5 (3), e64 (2008).
  17. Zhou, X., Hu, W., Qin, X. The role of complement in the mechanism of action of rituximab for B-cell lymphoma: implications for therapy. Oncologist. 13 (9), 954-966 (2008).
  18. Hayashi, K., et al. Gemcitabine enhances rituximab-mediated complement-dependent cytotoxicity to B cell lymphoma by CD20 upregulation. Cancer Sci. 107 (5), 682-689 (2016).
  19. Mossner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
  20. Lapalombella, R., et al. A novel Raji-Burkitt's lymphoma model for preclinical and mechanistic evaluation of CD52-targeted immunotherapeutic agents. Clin Cancer Res. 14 (2), 569-578 (2008).
  21. Mitoma, H., et al. Mechanisms for cytotoxic effects of anti-tumor necrosis factor agents on transmembrane tumor necrosis factor alpha-expressing cells: comparison among infliximab, etanercept, and adalimumab. Arthritis Rheum. 58 (5), 1248-1257 (2008).
  22. Kaymakcalan, Z., et al. Comparisons of affinities, avidities, and complement activation of adalimumab, infliximab, and etanercept in binding to soluble and membrane tumor necrosis factor. Clin Immunol. 131 (2), 308-316 (2009).
  23. Zent, C. S., et al. Direct and complement dependent cytotoxicity in CLL cells from patients with high-risk early-intermediate stage chronic lymphocytic leukemia (CLL) treated with alemtuzumab and rituximab. Leuk Res. 32 (12), 1849-1856 (2008).
  24. Goswami, M. T., et al. Regulation of complement-dependent cytotoxicity by TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 35 (15), 1888-1898 (2016).
  25. Wang, A., et al. Induction of anti-EGFR immune response with mimotopes identified from a phage display peptide library by panitumumab. Oncotarget. , (2016).
  26. Ueda, N., et al. The cytotoxic effects of certolizumab pegol and golimumab mediated by transmembrane tumor necrosis factor alpha. Inflamm Bowel Dis. 19 (6), 1224-1231 (2013).
  27. Nesbitt, A., et al. Mechanism of action of certolizumab pegol (CDP870): in vitro comparison with other anti-tumor necrosis factor alpha agents. Inflamm Bowel Dis. 13 (11), 1323-1332 (2007).
  28. Teeling, J. L., et al. Characterization of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin lymphomas. Blood. 104 (6), 1793-1800 (2004).

Tags

אימונולוגיה גיליון 123 Rituximab biosimilar אנטי CD20 mAb טיפולית CDC cytometry זרימה תאים דאודי
שיטות <em>ויטרו</em> להשוואת יעד מחייב CDC אינדוקציה בין נוגדנים טיפוליים: יישומים ניתוח Biosimilarity
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salinas-Jazmín, N.,… More

Salinas-Jazmín, N., González-González, E., Vásquez-Bochm, L. X., Pérez-Tapia, S. M., Velasco-Velázquez, M. A. In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis. J. Vis. Exp. (123), e55542, doi:10.3791/55542 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter