Este protocolo descreve um modelo de camundongo cateterizado centralmente de doença crítica prolongada. Combinamos o método de ligadura e punção cecal para induzir sepse com o uso de uma linha venosa central para administração de fluidos, medicamentos e nutrientes para mimetizar o ambiente clínico humano.
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Artigo de método
O uso de um cateter venoso central para fluidos, drogas e Administração de nutrientes em um modelo do rato da doença crítica
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo descreve um modelo de rato cateterizado centralmente de doença crítica prolongada. Nós combinar a ligação cecal e método punção para induzir sépsia com a utilização de um cateter venoso central para fluidos, drogas e nutrientes administrados para mimetizar a situação clínica humana. Pacientes criticamente doentes necessitam de apoio médico intensivo, a fim de sobreviver. Embora a maioria dos pacientes irá recuperar dentro de poucos dias, cerca de um quarto dos pacientes necessitam de tratamento intensivo e está em alto risco de morrer de não resolver a falha de múltiplos órgãos. Além disso, a fase prolongada da doença crítica caracteriza-se por fraqueza muscular profundo, e endócrino e alterações metabólicas, de que a patogénese está actualmente completamente compreendida. O modelo animal mais utilizado na pesquisa de cuidados intensivos é a ligadura e punção cecal modelo para induzir sepse. Este é um modelo muito reprodutíveis, com alterações inflamatórias e hemodinâmicos agudos semelhantes a setembro humanosis, que é projetado para estudar a fase aguda da doença crítica. No entanto, este modelo caracteriza-se por uma elevada letalidade, que é diferente da situação clínica humana, e não é desenvolvido para estudar a fase prolongada da doença crítica. Por isso, nós adaptamos a técnica de colocação de um cateter venoso central na veia jugular que nos permite administrar cuidados de suporte clinicamente relevante, para melhor imitar a situação clínica humana de doença grave. Este modelo do rato requer um extenso procedimento cirúrgico e tratamento intensivo diário dos animais, mas resulta em um modelo relevante da fase aguda e prolongada de doença crítica.
Introdução
doença crítica é um estado de doença em que a função de um ou mais sistemas de órgãos é dificultada na medida em que o paciente vai morrer, a menos que o suporte médica intensiva é administrado. Considerando que a causa inicial para a admissão na unidade de cuidados intensivos (UCI) pode variar, variando de trauma, cirurgia complicada, queimaduras, exacerbações da doença a sepsia, todos os pacientes criticamente doentes sofrem de danos celulares, causada por hipoperfusão, hipoxia e inflamação excessiva entre outros , o que leva à falência de órgãos. A maioria dos pacientes sobrevivem ao insulto agudo, mas uma fração importante dos pacientes não se recuperam imediatamente e precisa de tratamento intensivo prolongado. Eles estão em alto risco de morte devido a não resolver falência múltipla de órgãos. Além disso, a fase prolongada da doença crítica caracteriza-se por fraqueza muscular profundo e endócrino e alteração metabólica, dos quais a patogénese está actualmente completamente compreendida.
vários rmodelos Odent estão sendo usados no ambiente de pesquisa de cuidados intensivos. Os dois modelos mais utilizados são a administração exógena de lipopolissacarídeo (LPS) e ligação cecal e punção (CLP). Ambos os modelos foram desenvolvidos para mimetizar a fase aguda da septicemia, definida como uma disfunção de órgãos com risco de vida causada por uma resposta do hospedeiro desregulada à infecção, e uma das principais razões para a admissão na UCI em todo o mundo 1, 2. O modelo LPS tem várias desvantagens, uma vez que apenas transitoriamente afeta a liberação de citocinas e do estado hemodinâmico do animal 3. Ao contrário dos seres humanos, roedores também são particularmente resistentes à endotoxina e o uso de doses elevadas '' de endotoxina é necessário para a produção de hipotensão e mortalidade, por este meio aumentando ainda mais preocupações da validade deste método 4, 5. O outro modelo, a ligadura cecal e modelo punção (CLP)apresenta uma ligação de uma porção do ceco seguido por um punção de agulha através de-e-through. Este procedimento faz com que uma infecção abdominal polimicrobiana com danos no tecido, seguido por uma translocação das bactérias dentro do compartimento de sangue. Isto irá desencadear uma resposta inflamatória sistémica e o desenvolvimento de sepsia. O modelo CLP tem sido amplamente reconhecida como um modelo animal de doença aguda crítica, que reproduz as características principais de sépsis: hiperinflamação, vasodilatação, hipotensão e aumento do débito cardíaco 6, 7. No entanto, este modelo não permitir o estudo de falha não resolvendo de múltiplos órgãos, perda de massa muscular, e endócrino e alterações metabólicas, que são típicas para a fase prolongada da doença crítica. Além disso, recentemente a validade dos modelos de rato para doença grave têm sido questionadas, uma vez que resultados de modelos de mouse nem sempre pode ser traduzido para definir o humano 8, 9, 10. Uma possível explicação pode ser de que o tratamento de suporte que é fornecido para criticamente doentes pacientes humanos difere substancialmente do cuidado que é fornecida a ratinhos gravemente doentes.
Portanto, para se assemelhar a configuração humano mais perto e para permitir a investigação da fase prolongada de doença grave, foi desenvolvido um modelo de ratinho que mimetiza a cuidados intensivos aguda como dado para os seres humanos, tais como grande administração de fluidos por via intravenosa e o tratamento com antibióticos, e que permite para administrar cuidados de suporte, a fim de sobreviver à fase prolongada da doença crítica, como suporte nutricional. Para este efeito, nós adaptamos o modelo de ratinho de sepsia induzida por CLP, sendo o padrão de ouro para sepsia, e colocado de um cateter venoso central, que permite a administração de fluidos, nutrição e drogas.
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Protocolo
O protocolo foi aprovado pela Universidade de Leuven Ética Conselho de Revisão de Pesquisa Animal.
1. Preparação da Linha Venosa
- Preparar a ponta do cateter venoso por rapidamente imergindo a parte central de 60 cm microrenathane tubagem (MRE) em óleo de sésamo quente (> 220 ° C). Subsequentemente esticar a parte do meio do tubo para produzir um diâmetro estreito (diâmetro externo (OD) <0.5 mm), movendo-se suavemente as extremidades do tubo para longe umas das outras.
- Utilizar uma lâmina de bisturi para cortar o tubo em duas partes de 30 cm cada (ver Figura 1, Quadro 1).
- Ligar o tubo de ERM de polietileno tubagem PE10 usando conector de polietileno PE50 e ligar esta tubagem PE10 para a parte inferior do suporte giratório. Conectar a parte superior da peça giratória a tubagem PE10, e ligar esta para uma agulha de ponta Luer com tubagem PE50 conector de acordo com a Figura 1.
- Aplicar forte fast-acting cola adesiva para todas as ligações e testar o cateter para detecção de fugas através de lavagem com ar. Gás esterilizar o cateter antes da sua utilização.
Figura 1: Construção de Venosa Line. Linhas venosas são preparados por alongamento do tubo de ERM para um diâmetro pequeno e ligando-o através de uma tubagem de polietileno de um dispositivo giratório de roedor. Ver Tabela 1 para instruções sobre comprimentos das diferentes partes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| lenda | comprimento | Volume |
| 1) de agulhas Luer topo 22G | ||
| 2) PE50 - polietileno de 0,023" x 0,038" | 5 cm | 13 uL |
| 3) PE10 - polietileno de 0,011" x 0,024” | 50 centímetros | 30 uL |
| 4) Roedor giratória 20 L | ||
| 5) PE-10 | 15 cm | 9 pL |
| 6) PE-50 (conector) | 5 cm | 13 uL |
| 7) MRE025 Dica esticado microrenathane 0,025" x 0,012" | 30 cm | 27 uL |
| Soma total | 105 cm | 92 uL |
Tabela 1: Construção de Venosa Line. Esta tabela fornece uma legenda para a Figura 1.
2. Anestesia e Manipulação de pré-cirurgia
- Use de 24 semanas de idade macho C57BL 6J / (27-32 g).
NOTA: Nós usamos ratos 24 semanas de idade (adultos maduros) como esta idade corresponde melhor com a idade média dos pacientes de terapia intensiva. Nós utilizamos ratos machos apenas para evitar a influência cíclica de estrogénios. A técnica também pode ser usada em animais mais jovens (testadas em ratinhos de idade de 16 semanas) e fêmeas, se preferido. - Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos antes do uso. Limpar o cateter venoso caseira estéril com solução salina para remover quaisquer bolhas de ar e para testar a permeabilidade e potenciais fugas.
- Corte um fio de metal (0,8 mm de diâmetro) de 80 cm de comprimento, dobrá-lo por dobragem e fazer um laço. Chumbo 3 pérolas sobre o fio dobrado para o circuito. Anexar o cateter para o arame metálico de guiamento pela ponta do cateter através das pérolas 3.
NOTA: A ligação de fio de metal é necessário para a rotação da peça giratória para que o cateter está ligado. Como tal, o rato pode mover-se livremente, sem bloquear a linha venosa. - Anestesiar a mouse por uma injecção intraperitoneal (IP) de uma mistura de 0,03 ml de cetamina (100 mg / kg) e 0,02 mL de xilazina (13 mg / kg). Certifique-se de que a anestesia é adequada, verificando a ausência de reflexos. Puxe suavemente a língua mouse fora com uma pinça para evitar asfixia por ingestão da língua.
NOTA: Se após 10 min, o murganho ainda tenta retirar os seus membros dar cetamina adicional como um mL bolus 0,01. - Raspar a área cirúrgica incluindo abdómen, lado ventral do pescoço (triângulo entre queixo, esterno e clavícula), e entre as omoplatas na base da cabeça).
- Colocar o rato na posição de bruços numa almofada de aquecimento pré-aquecido, desinfectar a pele com etanol a 70% e aplicar uma pequena quantidade de lubrificante oftálmica para proteger os olhos de secar. Infiltrar nos locais cirúrgicos (abdómen, pescoço-frente e verso) com 0,2 mL de ropivacaína (0,67 mg / kg).
- Enquanto o rato ainda está em posição de pronação, fazer uma pequena incisão na base do lado dorsalda cabeça com bisturi ou tesoura. Expor os músculos cervicais posteriores, e amarrar o músculo para o laço da ligação de fio de nylon com 3,0 por conduzindo um fio de nylon 3.0 sob o músculo.
- Posicione o mouse em seu lado direito. Fazer uma pequena incisão vertical na pele do pescoço ventral com um bisturi ou tesoura. Sob orientação visual, um túnel subcutaneamente agulha de calibre 18 através desta incisão ventral para a incisão na parte traseira feita anteriormente e enfiar o cateter através da agulha para exteriorizar-lo no lado ventral.
- Posicione o mouse sobre as suas costas. Passe um fio 3.0 nylon atrás dos dentes superiores incisivos do mouse e fita-lo até a almofada de aquecimento. Proteger a cabeça em uma máscara facial para a entrega de oxigénio (2 L / min). Corrigir o rato em uma posição esticada para baixo gravando a cauda e as duas patas dianteiras.
NOTA: Se os anestesia de cetamina-xilazina por si só não é suficiente, isoflurano inalado (0,5-1,5%) pode ser administrado durante a cirurgia.
- Posicione o mouse sob o microscópio de dissecação. Na incisão feita anteriormente no pescoço ventral, gentilmente provocar tecido adiposo e glândulas afastado com uma pinça até que a veia jugular pode ser visualizado.
- Bruscamente dissecar para libertar a veia jugular do tecido conjuntivo subcutâneo e de cima e em torno do vaso através da colocação da ponta do fórceps entre a veia e tecido conjuntivo e a abertura das pinças repetidamente em paralelo com a veia. Como tal, os danos à veia serão evitados.
- Isolar a veia jugular, colocando uma pinça sem corte sob a veia. Alimentar três pedaços de fio de seda 3.0 sob a veia, a posição de uma parte proximal à bifurcação da veia jugular (ligadura craniana) e uma parte perto da esternocleidomastoideu (caudal ligadura). Apertar a ligadura craniana e a ligadura caudal para alongar a veia e evitar hemorragia excessiva durante a colocação do cateter. Tou seja, uma ligadura solta com o fio do meio para assegurar a fácil fixação do cateter mais tarde.
- Utilizando micro-tesoura, fazer uma incisão ao longo da nervura entre as ligaduras cranianos e caudal e grande o suficiente para passar o cateter. Agarre o cateter com uma pinça, e inserir o cateter 11 mm na veia. Folgadamente fixar o cateter por amarrar a ligadura meio e confirmar o posicionamento correcto por lavagem suavemente com solução salina estéril.
- Fixar o cateter por firmemente amarrar a ligadura meio e caudal em torno do vaso e o cateter. Laço termina de ligadura caudal e meio em conjunto para prender firmemente o cateter. Garantir que os nós não obstruir a veia, através de lavagem do cateter após cada nó feito. Finalmente, amarrar o caudal e ligaduras cranianos. Fechar a incisão com suturas 5.0 de seda.
4. Cecal Clipagem e Puncture
- Fazer uma incisão mediana de 1 cm através da pele da metade inferior do abdómen com bisturi ou tesoura;ter cuidado para não penetrar na cavidade peritoneal.
- Identificar a linha alba da musculatura abdominal e fazer uma incisão intermuscular para ganhar a entrada para a cavidade peritoneal. Localizar o ceco, e utilizar uma pinça anatómicas rombas para isolar o ceco e exteriorização.
- Ligadura o ceco em 50% do seu comprimento com suturas de seda 3,0. Certifique-se de não ligar a válvula ileocecal para que a continuidade intestinal é mantido.
- Perfurar a ceco com uma agulha de calibre 18 por um único através de-e-a meio caminho através do furo entre a ligação e a ponta do ceco. Depois de retirar a agulha, extrudir uma pequena quantidade de fezes a partir do furo para assegurar a desobstrução.
- Reposicionar o intestino na cavidade abdominal, e fechar o peritônio e pele com suturas 5.0 de seda.
NOTA: Em média, um novo estagiário requer de 10 a 15 animais para ser capaz de colocar sem problemas do cateter venoso e executar CLP dentro de 45 min. Após o período de treinamento, uma anestesia / cirurgia related mortalidade de 10% pode ser esperado.
Tratamento 5. Pós-cirúrgico e Reanimação com Fluidos
- Colocar o rato na posição supina e fixar o cateter no fio de fixação com fita adesiva. Mover o rato para uma gaiola individual. Utilize uma base com um grampo ajustável para manter o dispositivo giratório 25 cm acima do rato e firmemente tape a parte livre do fio de ligação de metal para o ponto de rotação da peça giratória.
- Anexar uma seringa que contém a mistura de colóides equilibradas e cristalóides (1: 4) para a linha venosa para iniciar a reanimação fluido.
- Coloque a gaiola num ambiente de temperatura controlada (27 ° C) do armário de animais com 12 horas de luz e os ciclos de escuro e iniciar a reanimação de fluidos por via intravenosa (10 mL / kg / h) através de uma bomba de infusão, accionado por seringa precisas. Fornecer enriquecimento gaiola, tais como material de assentamento e um bloco de madeira.
6. Cuidados Intensivos
- Às 6 h pós-operação, por via subcutânea injectar dor medication e antibióticos (0,3 mL buprenorfina (0,15 mg / kg) e 0,2 mL de imipenem (16.67mg / kg)). NOTA: Após a prática padrão de medicina de animais de laboratório, a primeira dose de analgésicos é dada antes da incisão cirúrgica inicial e, em seguida, como dirigido por políticas veterinários da instituição. As injecções subcutâneas deve ser cuidadosamente injectada no espaço subcutâneo.
- Depois de 20 - 24 h de reanimação fluido, substituir os cristalóides / colóides de nutrição parentérica total (6,67 mL / kg / h).
NOTA: A nutrição parentérica total administrado (5,8 kcal / 24 h), cobre cerca de 40% das necessidades calóricas diárias de ratinhos, semelhante à da ingestão calórica precoce de pacientes na unidade de cuidados intensivos. - Subcutaneamente administrar medicação para a dor e antibióticos (0,6 mL de buprenorfina (0,3 mg / kg) e 0,2 mL de imipenem (16,67 mg / kg) a cada 12 h durante a totalidade do período de doença grave.
- Confira os animais pelo menos a cada 3 h durante o dia. Avaliar o sofrimento, dando uma dorpontuação baseada no mouse escala careta validado 11. Intensificar monitorização para animais com uma pontuação elevada dor.
7. final do experimento
NOTA: Aprovação e recomendações sobre o nível de gravidade do modelo e diretrizes e políticas para endpoints humanos deve ser procurado a partir do Institutional Review Board Ética local para Pesquisa Animal.
Nota: Em caso de uma linha venosa não funcionais, tais como cateter bloqueado, deslocalização do cateter, problemas com a bomba de seringa, o animal é excluído do estudo e eutanasiados.
- No final do período experimental, anestesiar profundamente o rato usando uma mistura de 0,03 ml de cetamina (100 mg / kg) e 0,02 mL (13 mg / kg), xilazina. Euthanize o mouse por retirada de sangue por punção cardíaca. Loja encaixe amostras de tecidos congelados de interesse a -80 ° C.
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Resultados
Ratinhos C57BL / 6 foram feitas criticamente doentes como descrito acima. Foram realizadas duas experiências para avaliar a sobrevivência pós-CLP até dois pontos de tempo: de sobrevivência até 5 dias (n = 15) e sobrevivência até ao dia 7 (n = 22) pós-CRE. As curvas de sobrevivência das duas experiências não foram significativamente diferentes (em comparação até o dia 5), indicando a reprodutibilidade da configuração experimental. animais não sobreviventes foram encontrados morte ou sac...
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Discussão
Foi desenvolvido um modelo de ratinho mais clinicamente relevante da doença crítica, combinando o método de ligadura e puno do ceco para induzir sépsia com a utilização de um cateter venoso central para fluidos, drogas e nutrientes administrados. Esta configuração experimental é reprodutível, permite estudar a fase prolongada da doença crítica e resulta numa taxa de mortalidade estável, por este meio simulando a situação clínica humana 1.
Ligadura e perfuração cecal t...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
GVdB, através da Universidade de Leuven (KU Leuven), recebe apoio de pesquisa estrutural de longo prazo do Programa Matusalém financiado pelo Governo Flamengo (METH08/07) e possui uma Bolsa Avançada do Conselho Europeu de Pesquisa AdvG-2012-321670 do Programa de Ideias do sétimo programa-quadro da União Europeia. A SET recebeu uma bolsa de estudos para assistente de investigação da Fundação de Investigação-Flandres (FWO).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Buprenorfina | Ecuphar | Vetergesic 0,3 mg/mL | |
| C57BL/6 | Colóides Janvier labs | C57BL/6JRj | |
| Fresenius Kabi | Volulyte 6% | ||
| crystalloids | Baxter | Plasmalyte a viaflo | |
| Ethilon 3.0 | Ethicon | F3211 | |
| Imipenem | MSD | Tienam 500 mg de pó para fluido de injeção | |
| Isoflurano | Eurovet | Iso-vet | |
| Cetamina | Eurovet | Nimatek 100 mg/mL | |
| LocTite Super cola3 todos os plásticos | Rectavit | 119818 | |
| Mersilk 3.0 | Ethicon | L192 | |
| Mersilk 5.0 | Ethicon | F682 | |
| Microrenathane .025" O.D. x .012" I.D. | Bioseb | MRE-025 | |
| olimel N7E | Baxter | ||
| PE10 - Polietileno .011" x .024" | Tubulação Instech Solomon | BTPE-10 | |
| PE-50 .023" x.038" | Instech Solomon | BTPE-50 | |
| Roedores Giratório 20 G | Bioseb | RS-20G | |
| Ropivacaï ne | Astrazenica | Naropin 2 mg/mL | |
| de xilazina | VMD | Cloridrato de xilazina 2% |
Referências
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Reimpressões e permissões
