A<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum Ensaio de Ligação ao que prevê a penetração da droga na tuberculose Lesões

Resumo

Aqui descrevemos um método de diálise de equilíbrio rápido (RED) para medir a ligação do fármaco ao caseu de lesões e cavidades de tuberculose pulmonar. O protocolo também é usado com uma matriz espumosa derivada de macrófagos que é um substituto efetivo do caseu.

Resumo

A erradicação da tuberculose requer regimes medicamentosos que possam penetrar as múltiplas camadas de lesões pulmonares complexas. A distribuição de fármacos nos núcleos caseosos de cavidades e lesões é especialmente crucial porque abrigam subpopulações de bactérias tolerantes a fármacos também vulgarmente referidas como persisters. Os métodos existentes para a medição da penetração de fármaco em lesões de tuberculose envolvem costosos e demorados estudos farmacocinéticos in vivo acoplados a técnicas bioanalíticas ou de imagem. A medida in vitro da ligação do fármaco às macromoléculas de caseu foi proposta como uma alternativa a essas técnicas, uma vez que esta ligação dificulta a difusão passiva de moléculas de fármaco através do caseu. A diálise de equilíbrio rápido é um sistema rápido e confiável para realizar estudos de ligação a proteínas plasmáticas e tecidos. Neste protocolo, usamos um dispositivo de diálise de equilíbrio rápido (RED) para medir a ligação do fármaco a homogenatos de caseu que é excised das lesões e as cavidades de coelhos infectados com tuberculose. O protocolo também descreve como gerar uma matriz de substituição de lípido carregado THP-1 macrófagos para usar em lugar de caseum. Este ensaio de ligação caseum / substituto é uma ferramenta importante na descoberta de drogas tuberculose e pode ser adaptado para ajudar o estudo da distribuição de drogas em lesões ou abcessos causados ​​por outras doenças.

Introdução

O tratamento da doença pulmonar tuberculosa requer distribuição eficaz de fármacos em diferentes tipos de lesões. As lesões necróticas e as cavidades contêm centros caseosos que abrigam subpopulações de bactérias tolerantes a drogas ou "persistentes". ^{1 , 2} A doença cavitária está associada a taxas de cura inferiores e mau prognóstico. ^{3 , 4} Estudos anteriores mostraram, usando técnicas quantitativas e de imagem, que a capacidade de penetrar o caseu varia significativamente de uma classe de droga para outra. ^{5 , 6} Estes métodos, no entanto, exigem o uso de modelos de infecção animal que são lentos e tediosos. Foi concebido um ensaio in vitro que mede a ligação do fármaco ao caseu ex vivo . Verificou-se que esta ligação estava inversamente correlacionada com a penetração do fármaco em granulomas caseosos e, por conseguinte, éusado como uma ferramenta de previsão. ⁷

Diálise de equilíbrio é considerado como o método padrão de ouro para estudos de ligação de proteína de plasma. O dispositivo rápido equilíbrio de diálise (VERMELHO) proporciona um sistema rápido, fácil de usar e fiáveis ​​para a realização de tais ensaios. ⁸ O dispositivo é constituído por dois componentes: de utilização única, descartáveis que consistem inserções de 2 câmaras separadas por um cilindro vertical de membrana semi-permeável; e placas de base reutilizáveis ​​que pode armazenar até 48 inserções de cada vez. A membrana de diise tem um 8 kDa de peso molecular de corte (MWCO) que é ideal para estudos de ligação a drogas macromolécula. A razão de área para volume elevada superfície do compartimento da membrana de diálise permite uma rápida e equilibração. Ambos os insertos e a placa de base foram validados para o mínimo de ligação não específica. A combinação do dispositivo VERMELHO com técnicas bioanalíticas fornece estimativas precisas sobre as fracções não ligadas de medicamentos em pLasma ^{8 , 9}

Embora originalmente concebido para medir a ligação às proteínas plasmáticas, o dispositivo RED foi utilizado em vários estudos de ligação de tecidos utilizando homogeneizados. ^{10 , 11} Neste protocolo, medimos a ligação do fármaco ao caseu, os detritos necróticos excisados ​​das lesões necróticas e cavidades de coelhos infectados com tuberculose. A natureza acelular e não vascular do material caseoso facilita a homogeneização numa suspensão homogénea que é compatível com o ensaio.

Dado que o caseu é tedioso para produzir e difícil de encontrar, o protocolo também foi validado para uso com uma matriz substituta que é preparada a partir de macrófagos espumosos. Os macrófagos derivados de monócitos THP-1 são induzidos com ácido oleico para acumular múltiplos corpos lipídicos que lhes conferem a sua aparência "espumosa". Estas células carregadas de lípidos são colhidas eProcessado para produzir uma matriz que usamos como um substituto de caseu. Este estudo mostrou que a ligação do fármaco a esta matriz substituta se correlaciona bem com a ligação ao caseu, imitando eficazmente o processo in vivo que impede a penetração do fármaco no núcleo caseoso de granulomas e cavidades.

Protocolo

Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde com a aprovação do Comitê Institucional animal Cuidado e Uso do NIAID (NIH), Bethesda, MD. Todos os estudos envolvendo o M. tuberculosis foram realizados num laboratório com nível de segurança biológica de contenção 3 (BSL-3).

Modelo Infecção 1. Coelho e Coleção caseum

1. Infect de coelhos Nova Zelândia brancos com M. tuberculosis usando um sistema de exposição de aerossóis só de nariz, como descrito anteriormente. ^{12, 13} permitir que a infecção progride para 12-16 semanas. Sedar os coelhos com 35 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina por via intramuscular, sacrificar os coelhos, com 0,22 ml / kg de pentobarbital de sódio por via intravenosa e a fenitoína de sódio e prosseguir com as necropsias.
2. Usando pinças e um bisturi, remove pulmões do ca peitoVidade. A partir de cada lobo pulmonar, dissecar cavidades individuais e grandes granulomas necróticos usando um bisturi. Cuidadosamente raspar fora caseu da cavidade e granuloma paredes. Pesar, gravar e armazenar amostras em tubos de 2 mL com tampa roscada a -20 ° C até que esteja pronto para uso.
3. Irradia-se as amostras de caseu infecciosas a 3 MegaRad em gelo seco para torná-las não infecciosas e seguras para utilização num laboratório BSL-2.

2. Geração In Vitro de Substituto Caseum de células THP-1

1. Crescer monócitos THP-1 em meio RPMI 1640 (L-glutamina 2 mM e soro fetal bovino a 10%) em frascos de cultura de células T175 (80 mL / balão). Incubar os frascos numa atmosfera de CO2 a 5% a 37 ° C durante 3-4 dias.
2. Centrifugar a cultura de um balão T175 em dois tubos cônicos de 50 mL a 150 xg por 5 min. Descartar o sobrenadante e suspender o sedimento em 10 mL de meio RPMI 1640.
3. Pipetar 5 μL desta cultura em um tubo de 1,5 mL contendo 45 μL de tazul rypan. Mistura-se cuidadosamente por pipetagem. Transferir 10 uL para um hemocitómetro e contar o número de monócitos THP-1 viáveis ​​(sem corante), utilizando um microscópio óptico (ampliação de 10X). Calcular o número de células viáveis ​​por ml de cultura. Diluir com meio RPMI para a densidade final de 1,25 x 10 ⁶ culas / mL.
4. Carregar 40 ml da cultura em uma placa de cultura de células grandes (50 x 10 ⁶ culas / placa). Adicionar 40 uL de 100 uM de PMA (forbol 12-myristate13-etilo preparado em etanol) e permitir que as células a aderir durante a noite na incubadora.
   NOTA: A concentração final de PMA é de 100 nm.
5. Dilui-se o ácido puro oleico (OA) (0,89 g / mL) em etanol para a concentração de 0,1 M (ou seja 31,7 mL de OA em 968,3 mL de etanol). Dilui-se esta solução em meio fresco RPMI pré-aquecido a uma concentração de 10 mM. Dilui-se esta suspensão de OA a 0,4 mM (concentração final de trabalho), em meio RPMI pré-aquecido a 37 ° C.
6. Remova a mídia e não existentesDas células de cultura de células e adicionar suavemente 40 mL de OA 0,4 mM aos macrófagos THP-1 (THP-M). Incubar a 37 ° C na incubadora durante a noite.
7. Use um microscópio de luz com uma ampliação de 40x para confirmar visualmente a presença de numerosas inclusões de corpo lipídico em cada THP-M. Remover todo o meio RPMI das placas de cultura de células e lavar cuidadosamente as células aderentes duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma pipeta serológica de 50 mL.
   NOTA: Os corpos lipídicos aparecem como estruturas esféricas pequenas e claras no citoplasma do THP-M.
8. Adicionar 40 mL de ácido etilenodiaminotetraacético 5 mM (EDTA) em PBS a cada placa. Incubar durante 15 min a 37 ° C.
9. Desmonte os macrófagos espumosos (FM) pipetando repetidamente para cima e para baixo sobre a superfície da placa inteira usando uma pipeta serológica de 10 mL. Transferir a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL e girar para baixo a 150 xg por 5 min.
10. Ressuspender o sedimento celular em 10 mL de PBS (terceira lavagem com PBS) aNd de transferência para um pré-pesados ​​15 mL mL tubos cônicos. Girar novamente para 150 xg durante 5 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta serológica e descartar.
11. Submeter as pastilhas de FM a 3 ciclos de congelamento-descongelamento para lisar as células e incubá-las a 75 ° C durante 20-30 min para desnaturar as proteínas na matriz. Armazenar os grânulos a -20 ° C até estar pronto para uso.

3. Ensaio de Diálise de Equilíbrio Rápido (RED)

1. Preparar soluções-mãe 10 mM de todos os compostos de teste em dimetilsulfóxido (DMSO). Diluir a soluções de trabalho de 500 μM em DMSO antes de cada ensaio.
2. Pesar o tubo contendo a pastilha substituta de caseu. Subtrair o peso do tubo vazio para derivar o peso do grânulo sozinho. Adicionar 2-3 esferas metálicas por tubo e, utilizando um homogeneizador de tecidos a 1200 golpes / minuto durante 1 minuto, interromper o caseu ou a matriz substituta em PBS (1: 9 p / v) para se obter a suspensão diluída 10x de cada matriz.
3. Spike 6,5 μL dos 500ΜM do composto de teste em 643,5 μL de homogeneizado para se obter a concentração final de 5 μM (≤ 1% de DMSO) e vórtex.
4. Coloque as inserções VERMELHAS na placa de base. Adicionar 200 μL da matriz droga-cravada na câmara doadora (anel vermelho) de cada inserto VERMELHO e 350 μL de PBS em cada câmara receptora. Preparar 3 insertos para cada composto de teste (amostras em triplicado). Selar a placa com um vedante de placa adesiva e incubar a 37 ° C no termomixador a 200 rpm (1 xg) durante 4 h.
5. Após a incubação, misturar suavemente o conteúdo das câmaras doador e receptor por pipetagem para cima e para baixo 2-3 vezes. Pipetar para fora alíquotas de 20 μL de homogeneizado das câmaras de dador e adicionar 20 μL de PBS limpo num tubo de 1,5 mL (1: 1). Do mesmo modo, pipetar para fora alíquotas de 20 μL de amostras de PBS das câmaras receptoras e adicionar 20 μL de homogeneizado limpo (correspondência de matriz). ⁸
   NOTA: A correspondência de matriz elimina aEd para 2 curvas de calibração separadas (em homogeneizado e PBS) a serem feitas para análise quantitativa. O conteúdo da câmara doadora pode sedimentar ao longo do tempo. Misture suavemente o conteúdo por pipetagem antes de remover as alíquotas.

4. Quantificação de LC-MS e Análise de Dados

1. Adicionar 160 μL de metanol: acetonitrilo 1: 1 contendo diclofenac 500 ng / mL ou verapamil 10 ng / mL (padrão interno) a cada tubo e vortex para precipitar as proteínas. Centrifugar a 10 000 xg durante 5 min para sedimentar o precipitado e transferir os sobrenadantes para placas de poço profundo de 96 poços para análise de cromatografia líquida-espectrometria de massa (LCMS). ⁷
2. Construir curvas de calibração de 1-1000 nM para cada composto de teste, mantendo a mesma composição de matriz que as amostras acima. Quantificar a concentração do composto de teste em amostras das câmaras doadora e receptora utilizando um método LC-MS.
3. Calcular a fracção não ligada ( f _u ) oF o fármaco em matriz diluída usando a equação 1. Calcule o f _u em matriz não diluída usando a equação 2 ( D = fator de diluição de 10). ¹⁴
   
   
4. Verificar a recuperação (balanço de massa) de cada composto utilizando a equação 3 para identificar compostos com estabilidade / metabolismo / questões de ligação não específicas.
   NOTA: Recuperação normalmente cai entre 70% e 130%. ¹⁵
   

Resultados

Usando este protocolo, testámos centenas de compostos de desenvolvimento de tuberculose para a sua eficiência previsto no penetrante caseum. A Figura 1 visualiza os conceitos básicos do ensaio VERMELHO. A membrana de diálise das inserções VERMELHOS permite para pequenas moléculas não ligadas a difundir a partir do dador bem ao receptor bem como, finalmente, atingir um equilíbrio entre os dois compartimentos. As pequenas moléculas que são ligadas a macromoléculas, tais co...

Discussão

Lesões necróticas pulmonares e cavidades em pacientes infectados com tuberculose contêm subpopulações de bactérias que são recalcitrantes ao tratamento medicamentoso. Os núcleos caseosos destas estruturas são particularmente responsáveis ​​por abrigar estes persisters em um ambiente extracelular. Acredita-se que uma distribuição favorável de agentes anti-bacterianos nestes locais remotos seja um determinante importante da eficácia do fármaco contra a tuberculose. Antes da validação deste protocolo, não havia técnicas

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coelhos brancos da Nova Zelândia
Mycobacterium tuberculosis	BEI Resources	NR-13647
Cetatesia (Cetamina) 100 mg/mL C3N	Henry Schein Saúde Animal	56344
Anased (Xilazina) 100 mg/mL	Henry Schein Saúde Animal	33198
Euthasol (pentobarbital sódico e fenitoína sódica) Solução	Virbac	710101
linha celular monocítica THP-1	ATCC ATCC	TIB-202
175 cm² Cantil Tratado com TC (T175)	Fisher Scientific	T-3400-175
RPMI 1640 mídia sem glutamina	Fisher Scientific	MT-15-040-CV
Hyclone Fetal Bovine Serum, Irradiado por Gama	Fisher Scientific	SH3091003IR
Hyclone L-glutamina, 200 mM	Fisher Scientific	SH3003401
prato Cellstar TC, 145 mm x 20 mm, ventilado	Fisher Scientific	T-2881-1
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Fisher Scientific	BP685-1
Ácido etilenodiaminotetracético	Sigma	E6758
Ácido oleico	Placa	do Dispositivo Fisher Scientific ICN15178101
Pierce RED	Fisher Scientific	PI-89811
Insertos de Dispositivo Pierce RED, 50/caixa	Fisher Scientific	PI-89809
Pierce RED	Fisher Scientific	89812
Vedação de placa adesiva	Fisher Scientific	08-408-240
PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)	Tecnologias de Vida	10010-049
DMSO	Sigma	472301
Acetonitrila	Sigma	34998
Metanol	Sigma	34860
Cloridrato de Verapamil	Sigma	V4629
Sal de diclofenaco de sódio	Sigma	93484
Solução de azul de tripano, 0,4%	Fisher Scientific	15-250-061
Etanol, 200 provas	Fisher Scientific	04-355-451
2010 Geno/Grinder	SPEX SamplePrep	2010
Acessório de Homogeneizador de Moinho de Contas, Contas de Metal a Granel	Fisher Scientific	15-340-158
484R Cobalto 60 Irradiador	JL Shepard	7810-484-1
INCYTO  Hemacitômetros descartáveis C-Chip	Fisher Scientific	22-600-100
Microscópio de luz vertical	Leica	DM1000
Sistema de cromatografia líquida binária	Agilent	1260
Espectrômetro de massa	AB Sciex	4000

Covance-HN878 Base Reutilizável Ferramenta de remoção de inserto multicompenente