Summary
En este artículo se describe un método de diálisis de equilibrio rápido (RED) para medir la unión de fármacos a caseum de lesiones y cavidades de tuberculosis pulmonar. El protocolo también se utiliza con una matriz espumosa derivada de macrófagos que es un sustituto efectivo del caseo.
Abstract
La erradicación de la enfermedad de la tuberculosis requiere regímenes farmacológicos que pueden penetrar las múltiples capas de lesiones pulmonares complejas. La distribución de fármacos en los núcleos caseosos de cavidades y lesiones es especialmente crucial porque albergan subpoblaciones de bacterias tolerantes a fármacos también comúnmente denominadas persisters. Los métodos existentes para la medición de la penetración del fármaco en lesiones de tuberculosis implican costosos y largos estudios farmacocinéticos in vivo acoplados a técnicas bioanalíticas o de formación de imágenes. La medida in vitro de la unión de fármacos a macromoléculas de caseo se propuso como una alternativa a tales técnicas ya que esta unión dificulta la difusión pasiva de moléculas de fármaco a través de caseo. La diálisis de equilibrio rápido es un sistema rápido y fiable para realizar estudios de unión a proteínas plasmáticas y tejidos. En este protocolo, se utilizó un dispositivo de diálisis de equilibrio rápido (RED) para medir la unión de fármacos a homogenados de caseo que es excised de las lesiones y de las cavidades de los conejos de tuberculosis infectados. El protocolo también se describe cómo generar una matriz sustituta de lípido cargado macrófagos THP-1 para utilizar en lugar de caseosa. Este / ensayo de unión sustituto caseosa es una herramienta importante en el descubrimiento de fármacos tuberculosis y se puede adaptar para ayudar a estudiar la distribución del fármaco en las lesiones o abscesos causados por otras enfermedades.
Introduction
El tratamiento de la tuberculosis pulmonar requiere una distribución eficaz de fármacos en diferentes tipos de lesiones. Las lesiones necróticas y las cavidades contienen centros caseosos que albergan subpoblaciones de bacterias tolerantes a los fármacos o "persistentes". 1 , 2 La enfermedad cavitaria se asocia con tasas de curación inferiores y mal pronóstico. 3 , 4 Estudios previos han demostrado, usando técnicas cuantitativas y de imágenes, que la capacidad de penetrar el caseo varía significativamente de una clase de fármaco a otra. 5 , 6 Estos métodos, sin embargo, requieren el uso de modelos de infección animal que son lentos y tediosos. Se diseñó un ensayo in vitro que mide la unión del fármaco al caseo ex vivo . Se encontró que esta unión se correlacionaba inversamente con la penetración del fármaco en granulomas caseosos y, por lo tanto, esUtilizado como herramienta predictiva. 7
La diálisis de equilibrio se considera como el método estándar de oro para los estudios de unión a proteínas plasmáticas. El dispositivo de diálisis de equilibrio rápido (RED) proporciona un sistema rápido, fácil de usar y fiable para realizar tales ensayos. 8 El dispositivo se compone de dos componentes: insertos de un solo uso y desechables compuestos de 2 cámaras separadas por un cilindro vertical de membrana semipermeable; Y placas de base reutilizables que pueden contener hasta 48 insertos a la vez. La membrana de diálisis tiene un corte de peso molecular de 8 kDa (MWCO) que es ideal para estudios de unión de fármacos-macromoléculas. La alta relación superficie / volumen del compartimento de membrana permite una diálisis rápida y equilibrio. Tanto los insertos como la placa de base han sido validados para una unión no específica específica. La combinación del dispositivo RED con técnicas bioanalíticas proporciona estimaciones precisas de las fracciones no unidas de fármacos en pLasma 8 , 9
Aunque originalmente se diseñó para medir la unión a proteínas plasmáticas, el dispositivo RED se ha utilizado en varios estudios de unión de tejidos utilizando homogenados. 10 , 11 En este protocolo, medimos la unión del fármaco al caseo, los residuos necróticos escindidos de las lesiones necróticas y cavidades de los conejos infectados con tuberculosis. La naturaleza acelular y no vascular del material caseoso hace que sea fácil de homogeneizar en una suspensión homogénea que sea compatible con el ensayo.
Dado que el caseum es tedioso para producir y difícil de conseguir, el protocolo también ha sido validado para su uso con una matriz sustituta que se prepara a partir de macrófagos espumosos. Los macrófagos derivados de monocitos THP-1 son inducidos con ácido oleico para acumular múltiples cuerpos lipídicos que les dan su aspecto "espumoso". Estas células cargadas de lípidos se cosechan yprocesada para producir una matriz que usamos como un sustituto para caseosa. Este estudio ha demostrado la unión a esta matriz sustituta se correlaciona bien con la unión a caseosa, imitando eficazmente el proceso in vivo que impide la penetración del fármaco en el núcleo caseosa de granulomas y cavidades que de drogas.
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Protocol
Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, con la aprobación del Comité Institucional Animal Cuidado y Uso del NIAID (NIH), Bethesda, MD. Se realizaron todos los estudios con M. tuberculosis en un laboratorio con nivel de bioseguridad de contención 3 (BSL-3).
1. Conejo Modelo de infección y caseosa Colección
- Infect Nueva Zelanda conejos blancos con M. tuberculosis usando un sistema de exposición a aerosol sólo para la nariz como se describió anteriormente. 12, 13 permitir que la infección progrese durante 12-16 semanas. Sedate los conejos con 35 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina por vía intramuscular, la eutanasia a los conejos con 0,22 ml / kg de pentobarbital de sodio de sodio y fenitoína por vía intravenosa y proceder con la necropsias.
- El uso de pinzas y bisturí, retire los pulmones de la ca pechoVidad De cada lóbulo pulmonar, diseccionar cavidades individuales y grandes granulomas necróticos con un bisturí. Raspe con cuidado el caseum de las paredes de la cavidad y del granuloma. Pesar, registrar y almacenar las muestras en tubos tapados con tornillos de 2 mL a -20 ° C hasta que estén listos para su uso.
- Irradiar gamma las muestras de caseo infeccioso a 3 MegaRad en hielo seco para hacerlas no infecciosas y seguras para su uso en un laboratorio BSL-2.
2. Generación in vitro de sustituto de caseo a partir de células THP-1
- Cultivo de monocitos THP-1 en medio RPMI 1640 (L-glutamina 2 mM y suero fetal bovino al 10%) en matraces de cultivo celular T175 (80 ml / matraz). Incubar los matraces en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 ° C durante 3-4 días.
- Centrifugar el cultivo de un matraz T175 en dos tubos cónicos de 50 ml a 150 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y suspender el sedimento en 10 ml de medio RPMI 1640.
- Pipetear 5 μL de este cultivo en un tubo de 1,5 ml que contenga 45 μl de tRypan azul Mezcle bien pipeteando. Transferir 10 μL a un hemocitómetro y contar el número de monocitos THP-1 viables (sin tinción) utilizando un microscopio óptico (aumento de 10X). Calcular el número de células viables por ml del cultivo. Diluir con medio RPMI hasta la densidad final de 1,25 x 106 células / ml.
- Cargar 40 mL del cultivo en una placa de cultivo celular grande (50 x 106 células / placa). Añadir 40 μL de 100 μM de PMA (forbol 12-miristato13-acetato preparado en etanol) y permitir que las células se adhieran durante la noche en la incubadora.
NOTA: La concentración final de PMA es 100 nM. - Diluir ácido oleico puro (OA) (0,89 g / ml) en etanol hasta la concentración de 0,1 M ( es decir, 31,7 μl de OA en 968,3 μl de etanol). Diluir esta solución en medio RMPI precalentado fresco a una concentración de 10 mM. Diluir esta suspensión de OA a 0,4 mM (concentración final de trabajo) en medio RPMI precalentado a 37ºC.
- Eliminar los medios existentes y losDe las placas de cultivo celular y añadir suavemente 40 ml de OA 0,4 mM a los macrófagos THP-1 (THP-M). Incubar a 37 ° C en la incubadora durante la noche.
- Utilice un microscopio óptico con una ampliación de 40x para confirmar visualmente la presencia de numerosas inclusiones de cuerpo lipídico en cada THP-M. Eliminar todo el medio RPMI de las placas de cultivo celular y lavar suavemente las células adherentes dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando una pipeta serológica de 50 ml.
NOTA: Los cuerpos lipídicos aparecen como estructuras pequeñas, claras y esféricas en el citoplasma del THP-M. - Añadir 40 mL de ácido etilendiaminotetraacético 5 mM (EDTA) en PBS a cada placa. Incubar durante 15 minutos a 37 ° C.
- Desmonte los macrófagos espumosos (FM) pipeteando repetidamente hacia arriba y hacia abajo sobre la superficie de la placa entera usando una pipeta serológica de 10 ml. Transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 150 xg durante 5 min.
- Resuspender el sedimento celular en 10 ml de PBS (tercer lavado con PBS) aNd a un tubo cónico de 15 mL previamente pesado. Girar de nuevo a 150 xg durante 5 min. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta serológica y desecharla.
- Sujeción de los gránulos de FM a 3 ciclos de congelación-descongelación para lisar las células e incubar a 75 ° C durante 20-30 min para desnaturalizar las proteínas en la matriz. Guarde los gránulos a -20 ° C hasta que estén listos para su uso.
3. Ensayo de Diálisis de Equilibrio Rápido (RED)
- Preparar soluciones madre 10 mM de todos los compuestos de ensayo en dimetilsulfóxido (DMSO). Diluir a 500 μM de soluciones de trabajo en DMSO antes de cada ensayo.
- Pesar el tubo que contiene la pastilla de caseo sustituto. Reste el peso del tubo vacío para obtener el peso del gránulo solo. Añadir 2-3 perlas de metal por tubo y, utilizando un homogeneizador de tejidos a 1200 golpes / minuto durante 1 minuto, romper el caseo o la matriz sustituta en PBS (1: 9 w / v) para conseguir 10x de suspensión diluida de cada matriz.
- Spike 6.5 μL de los 500ΜM del compuesto de ensayo en 643,5 μl del homogeneizado para alcanzar la concentración final de 5 μM (≤1% de DMSO) y vórtice.
- Coloque los insertos ROJOS en la placa base. Añadir 200 μl de la matriz de droga en la cámara del donante (anillo rojo) de cada inserto ROJO y 350 μl de PBS en cada cámara receptora. Prepare 3 insertos para cada compuesto de ensayo (muestras triplicadas). Sellar la placa con un sello de placa adhesiva e incubar a 37 ° C en el termomixer a 200 rpm (1 xg) durante 4 h.
- Después de la incubación, mezcle suavemente el contenido de las cámaras del donante y del receptor pipeteando arriba y abajo 2-3 veces. Pipetear 20 μL de alícuotas de homogeneizado de las cámaras donadoras y añadir 20 μL de PBS limpio en un tubo de 1,5 ml (1: 1). De forma similar, se pipetean alícuotas de 20 μl de muestras de PBS de las cámaras receptoras y se añaden a 20 μl de homogeneizado limpio (combinación de matriz). 8
NOTA: La concordancia de matriz elimina la need para 2 curvas de calibración separadas (en homogeneizado y PBS) que se hizo para el análisis cuantitativo. El contenido de la cámara donante pueden sedimentar con el tiempo. Mezclar suavemente el contenido pipeteando antes de retirar alícuotas.
4. CL-EM Cuantificación y Análisis de Datos
- Añadir 160! L de 1: 1 de metanol: acetonitrilo que contiene 500 ng / ml de diclofenaco o 10 ng / ml de verapamil (patrón interno) a cada tubo y vórtice para precipitar las proteínas. Centrifugar a 10.000 xg durante 5 min para sedimentar el precipitado sobrenadantes y transferencia en placas de 96 pocillos de pocillos profundos para el análisis de líquido espectrometría de masas-cromatografía (LCMS). 7
- Construir curvas de calibración de 1-1.000 nM para cada compuesto de ensayo mientras se mantiene la misma composición de la matriz que las muestras anteriormente. Cuantificar la concentración de compuesto de ensayo en las muestras de las cámaras donante y receptora utilizando un método LC-MS.
- Calcular la fracción no unida (f u) oF el fármaco en matriz diluida utilizando la ecuación 1. Calcular el f u en matriz sin diluir usando la ecuación 2 ( D = factor de dilución de 10). 14
- Compruebe la recuperación (balance de masa) de cada compuesto usando la ecuación 3 para identificar compuestos con estabilidad / metabolismo / problemas de unión no específicos.
NOTA: La recuperación típicamente cae entre 70% y 130%. 15
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Representative Results
Usando este protocolo, hemos probado cientos de compuestos de desarrollo de fármacos para la tuberculosis para su eficacia pronosticada en el caso de penetración. La figura 1 visualiza los conceptos básicos del ensayo RED. La membrana de diálisis de los insertos ROJO permite que pequeñas moléculas no unidas se difundan desde el pozo del donante hasta el pozo receptor, logrando finalmente un equilibrio entre ambos compartimentos. Las moléculas pequeñas que están unidas a macromoléculas tales como proteínas o lípidos están atrapadas en el pocillo donante. El análisis cuantitativo de las muestras de ambos compartimientos permite el cálculo de la fracción no unida ( f u ) de cada pequeña molécula en el casoum o matriz sustituta. Se ha demostrado que esta fracción se correlaciona directamente con la penetración del fármaco en caseo in vivo . 7 Como muestra la Figura 2, se utiliza el espectro de masas MALDI (desorción / ionización láser asistida por matriz)imágenes metría, mayor será la f u, la más ampliamente el fármaco se difunde en caseosa. Por lo tanto, esto concuerda con la hipótesis de que a medida que las moléculas de fármaco se difunden en el borde exterior de caseosa desde su interfaz con las capas celulares de la lesión, la unión a macromoléculas caseosos secuestra el fármaco, evitando que se difunda más en el núcleo caseosa. Un panel de muestra de 18 fármacos antituberculosos aparece en la Tabla 1 junto con su u f tanto en caseosa y la madre sustituta. Como muestra la Figura 3 ilustra, la matriz preparada a partir de macrófagos espumosos derivados de THP-1 es un sustituto eficaz para cierto caseosa. Encuadernación en ambas matrices fuertemente se correlaciona con la otra.
Figura 1: Ilustración del ensayo RED. Durante la incubación, las moléculas de fármaco que permanecen sin unir a macromoléculas enla difusa matriz a través de la membrana de diálisis. Con el tiempo, se establece un equilibrio entre la concentración de moléculas de fármaco sin unir, tanto en los pozos de donantes y receptores. Todas las macromoléculas (proteínas, lípidos, etc.) y moléculas de fármaco unido están atrapados dentro de la cámara donante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: la penetración del fármaco in vivo. Relación entre la fracción no unida (f u) y difusión en caseosa in vivo como se determina por MALDI (láser asistida por matriz de desorción / ionización) de imágenes espectrometría de masas para seis fármacos antituberculosos. mapas de iones son de las lesiones pulmonares representativas y la intensidad de la señal se indica mediante la barra de escala a la izquierda. MARIDO ematoxylin y eosina (H & E) tinción de secciones adyacentes se muestra por debajo de los mapas de iones. líneas de contorno negro / blanco resaltan el centro caseosa de cada lesión. Reproducido (adaptado) con permiso de Sarathy et al. 7 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Correlación entre las fracciones no unidas (f u) de 18 fármacos anti-tuberculosis en caseosa y la matriz sustituta. La línea de mejor ajuste se determinó usando regresión lineal. La bondad de ajuste se expresa como el valor de R 2. Reproducido (adaptado) con permiso de Sarathy et al. 7k "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Caseosa f u (%) | F Surrogate u (%) | |
| etambutol | 35,2 ± 4,4 | 38,8 ± 5,6 |
| isoniazida | > 99,9 | > 99,9 |
| Acetil-isoniazida | > 99,9 | > 99,9 |
| ácido p-aminosalicílico | 54,7 ± 1,4 | 51,1 ± 11,2 |
| rifampicina | 5,13 ± 0,2 | 7,3 ± 0,6 |
| rifapentina | 0,5 ± 0,1 | 1,1 ± 0,1 |
| moxifloxacina | 13,5 ± 3,7 | 16,8 ± 1,8 |
| Levofloxacina | 8,34 ± 0,4 | 16,3 ± 3,1 |
| Gatifloxacina | 16,3 pm 4,2 | 18,8 pm 2,9 |
| Linezolid | 29,3 ± 3,6 | 27,9 ± 2,2 |
| Posizolid | 10,7 ± 1,7 | 17,6 ± 4,5 |
| Sutezolid | 30,1 ± 8,7 | 21,7 ± 1,7 |
| Radezolid | 5,2 pm 0,8 | 7,6 ± 1,9 |
| Tedizolid | 8,8 ± 1,8 | 13,7 ± 2,7 |
| Clofazimina | <0,01 | <0,01 |
| Bedaquiline | <0,01 | <0,01 |
| PA-824 | 7,31 pm 2,2 | 3,6 ± 0,2 |
| OPC67683 | 0,04 pm 0,02 | 0,02 pm 0,002 |
Tabla 1: Fracción no unida ( f u ) de los fármacos de 18 TB probados en el caso y en el ensayo de unión sustitutiva. Todos los resultados se expresan como la media ± desviación estándar. Reimpreso (adaptado) con permiso de Sarathy et al . 7
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Discussion
lesiones necróticas pulmonares y cavidades en los pacientes de tuberculosis infectados contienen subpoblaciones de bacterias que son recalcitrantes al tratamiento farmacológico. Los núcleos caseosos de estas estructuras son particularmente responsable de albergar estos persisters en un entorno extracelular. 16 distribución favorable de agentes antibacterianos en estos lugares remotos se cree que es un determinante importante de la eficacia del fármaco tuberculosis. Antes de la validación de este protocolo, no había disponible en técnicas in vitro que podrían predecir la distribución de los compuestos de descubrimiento de fármacos en las lesiones caseosas. Como resultado, la evaluación de la distribución de medicamentos en estos focos críticos dependía en gran medida de modelos de infección en animales, estudios farmacocinéticos lesión centrada y técnicas de imagen espectrometría de masas MALDI. 5, 17
El ensayo in vitro descrito élRe es una forma rápida y eficaz de predecir la penetración de fármacos en las lesiones de tuberculosis sin el tedio y el coste de los estudios farmacocinéticos in vivo . El protocolo es una modificación del ensayo de unión a proteínas plasmáticas que originalmente era el uso pretendido del dispositivo RED. La homogeneización de muestras de tejido a una consistencia capaz de pipetear permite medir la unión de proteína tisular usando el mismo dispositivo. Este protocolo puede realizarse con caseu si está disponible a partir de modelos de infección animal. Como se ilustra en la Figura 1 , las moléculas de fármaco se unen a macromoléculas en caseo / homogenato sustituto, manteniéndolo en la cámara donadora, mientras que las moléculas de fármaco no unidas son libres de difundirse a través de la membrana semipermeable dentro de la cámara receptora. La fracción no unida ( f u ) se equilibra entre ambos compartimentos durante el período de incubación. Como muestra la Figura 2 , los compuestos muy ligados ( f u ≤ 1%) que son almost atrapado totalmente dentro de la cámara donante no son eficaces en la que impregna caseosa. Por otro lado, los compuestos (1% <f u <100%) son capaces de difundirse en el núcleo caseosa en diversos grados menos unida; cuanto mayor sea la T f, más ampliamente que impregna el área necrótica.
El protocolo también se puede utilizar con una matriz sustituta derivado de macrófagos THP-1 cargados de lípidos que han sido inducidos con ácido oleico. Varias condiciones para la inducción de la acumulación cuerpo lípido fueron probados en THP-1. Estos incluyen la hipoxia, la exposición a irradiada M. tuberculosis y la exposición a trehalosa 6,6'-dimicolato (TMD) derivado de la pared celular micobacteriana. La concentración de incubación ácido oleico final de 400? M se probó para inducir la formación de cuerpos de lípidos pico sin comprometer la viabilidad celular y la adhesión. 7 La dilución de ácido oleico en los medios de pre-calentado es crítica para asegurar maximaL disolución del ácido graso. La matriz sustitutiva resultante tiene un contenido de colesterol comparable al caseum verdadero, pero mayores y menores contenidos de triglicéridos y proteínas, respectivamente. 7 Como ilustra la Figura 3 , la unión de 18 compuestos antituberculosos a la matriz sustituta se correlaciona fuertemente con su unión al caseo. El estudio reciente que también incluyó compuestos no comerciales con actividad bactericida indefinida demostró que la matriz derivada de FM es un sustituto efectivo del caseo. Al eliminar la necesidad de modelos de infección animal, la matriz sustituta aumenta exitosamente el rendimiento de este ensayo mientras que lo hace más rentable.
Este versátil protocolo también puede usarse para probar múltiples compuestos simultáneamente (prueba de casete). Hemos demostrado previamente que la prueba de 5 combinaciones de fármacos, todos a 5 μ M, en cada inserto utilizando este protocolo puede clasificar eficazmente el compuestoS basándose en sus afinidades de unión de caseo, ahorrando tiempo y materiales. Un sexto compuesto de control tal como moxifloxacina puede añadirse al casete como un control interno para asegurar la consistencia entre los ensayos y los lotes de caseo / sustituto. Es importante destacar que el protocolo se puede ejecutar con tan sólo 20 μl de un stock compuesto 10 mM (<< 1 mg de un compuesto). Esta es una gran ventaja desde el principio en el proceso de descubrimiento de fármacos cuando los químicos sintetizan cantidades limitadas de cada compuesto con fines de cribado. El aparato del dispositivo ROJO es automatizado amistoso; La huella de microplaca de la placa de base lo hace compatible con sistemas automatizados diseñados para manejar placas estándar de 96 pocillos.
Aunque se ha demostrado que la matriz sustituta imita con éxito las propiedades de unión del caseo ex vivo ( Figura 3 ), reconocemos que puede perfilar incorrectamente ciertos compuestos. Los macrófagos THP-1 se usan comúnmente en El ensayo de unión sustituto caseo es una herramienta útil en el descubrimiento de fármacos para la tuberculosis y se utiliza en múltiples programas de optimización de plomo. También puede ayudar a diseñar másLos regímenes de combinación fectiva basados en la capacidad de los fármacos individuales para dividirse en las diversas capas de múltiples tipos de lesión. El protocolo también podría adaptarse para facilitar el descubrimiento de fármacos para otras enfermedades que se caracterizan por la formación de lesiones o abscesos en los que la penetración del fármaco es limitada pero crítica para el éxito del tratamiento.
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Disclosures
No hay intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Deseamos agradecer a Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X y Trius Therapeutics por proporcionar bedaquiline, PA-824 (pretomanida), AZD5847, radezolid y tedizolid, respectivamente. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li y Danielle Weiner apoyaron el análisis MALDI, los métodos bioanalíticos, la preparación del sustituto del caseo, la síntesis química y el aislamiento del caseo de conejo. Este trabajo se llevó a cabo con fondos de la Fundación Bill y Melinda Gates, el premio # OPP1044966 y OPP1024050 a V. Dartois, la Subvención de Instrumentación Compartida NIH S10OD018072, así como el financiamiento conjunto de la Fundación Bill y Melinda Gates y Wellcome Trust for A Centre of Excellence Para la optimización del plomo para las enfermedades del mundo en vías de desarrollo a P. Wyatt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand White Rabbits | Covance | - | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175 cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-glutamine, 200 mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
| Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
| Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
| Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
References
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