Summary
La unión a trifosfato de guanosina (GTP) es uno de los primeros eventos en la activación de receptores acoplados a proteína G (GPCR). Este protocolo describe cómo caracterizar farmacológicamente las interacciones específicas de GPCR-ligando mediante la monitorización de la unión del análogo de GTP marcado con radio, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), en Respuesta a un ligando de interés.
Abstract
Los receptores G-Protein-Coupled (GPCRs) son una gran familia de receptores transmembrana que desempeñan papeles críticos en la fisiología celular normal y constituyen un objetivo farmacológico principal para múltiples indicaciones, incluyendo la analgesia, la regulación de la presión arterial y el tratamiento de la enfermedad psiquiátrica. Tras la unión del ligando, los GPCR catalizan la activación de las proteínas G intracelulares estimulando la incorporación de guanosina trifosfato (GTP). Las proteínas G activadas estimulan entonces las vías de señalización que provocan respuestas celulares. La señalización de GPCR puede monitorizarse midiendo la incorporación de una forma radiomarcada y no hidrolizable de GTP, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), en proteínas G. A diferencia de otros métodos que evalúan más procesos de señalización aguas abajo, la unión de [35S] GTPγS mide un evento proximal en la señalización de GPCR y, de manera importante, puede distinguir agonisSt, antagonistas y agonistas inversos. El presente protocolo describe un método sensible y específico para estudiar la señalización de GPCR usando preparaciones de membrana cruda de un GPCR arquetípico, el receptor de opioides μ (MOR1). Aunque existen enfoques alternativos para las células y tejidos fraccionados, muchos son costo-prohibitivos, tediosos y / o requieren equipo de laboratorio no estándar. El presente método proporciona un procedimiento sencillo que enriquece las membranas crudas funcionales. Después de aislar MOR1, se determinaron diversas propiedades farmacológicas de su agonista, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) y antagonista, naloxona.
Introduction
Los receptores G-Protein-Coupled (GPCRs) son una gran familia de receptores de la superficie celular responsables de una notable variedad de procesos fisiológicos, incluyendo analgesia, olfacción y comportamiento 1 . Los GPCR actúan detectando señales externas específicas y posteriormente estimulando la señalización intracelular. Por lo tanto, marcan una unión clave entre los entornos externos e internos de una célula. Debido al papel crítico que juegan los GPCR en la biología, se han convertido en objetivos principales tanto para la investigación básica como para el descubrimiento de fármacos 2 , 3 .
A diferencia de otras familias de receptores que se unen a ligandos discretos, los GPCR pueden unirse a tipos muy diferentes de moléculas. Mientras que un GPCR puede interactuar con péptidos, otro puede detectar fotones, pequeñas moléculas o iones 1 , 4 . Aunque sus ligandos son diversos, los GPCR se unifican en su arquitecto generalUre y función. Individual GPCRs se componen de siete α-helicoidal transmembrana proteínas con terminales extracelulares amino y intracelular carboxilo terminales [ 5 , 6] . GPCRs se acoplan a intracelulares G-proteínas heterotriméricas complejos de proteínas compuestas de α, β y γ subunidades-que median diversas vías de señalización [ 7] . La subunidad G $ α $ es una proteína de unión a nucleótidos de guanina que es inactiva cuando está unida a guanosina difosfato (GDP) y activa cuando está unida a guanosina trifosfato (GTP) 8,9. Cuando los GPCR se unen a sus ligandos, experimentan un cambio conformacional que permite que G $ α $ se disocie de G $ β $, permitiendo de este modo que G $ to $ cambie GDP por GTP $ TP $ . El propio receptor está fosforilado en su terminal carboxilo por varias serina / treónIne quinasas 10 , 11 e internalizadas para atenuar la señalización del receptor 12 , 13 , 14 . Mientras tanto, el monómero G α activado y el dímero G $ β $ proceden a activar vías de señalización distintas 7 . Existen varias isoformas de cada subunidad de proteína G, y cada isoforma se dirige a vías de flujo y sistemas de mensajero secundarios particulares. Las principales isoformas G $ s $ incluyen G $, $, G $ _ $, G $ _ { i } $ y G $ _ $ 12-13 . Típicamente, los GPCR individuales se asocian con una isoforma G α particular, uniendo así un estímulo externo a una respuesta celular específica 1 .
La caracterización de una interacción GPCR-ligando es crítica para entender la biología del receptor. Dado que el intercambio PIB / GTP es uno de los primerosNts que sigue la unión de ligando, el seguimiento de la unión a GTP puede medir la activación o inhibición de GPCR. Ensayar más eventos descendentes en la señalización de GPCR a menudo no es tan cuantitativa o estequiométrica, puede no distinguir agonistas completos de los parciales, y puede requerir reactivos costosos. Además, el aumento de la unión a GTP a las proteínas G α es un evento casi universal tras la activación de GPCR, lo que significa que la medición de la unión a GTP es un ensayo ampliamente aplicable para monitorizar la actividad de la mayoría de los GPCR. La medición de la unión a GTP es un método simple y rápido para monitorizar la señalización de GPCR en células que sobreexpresan el receptor de interés o en tejido nativo. El presente protocolo detalla un ensayo funcional de unión a GTP usando un GPCR arquetípico, el receptor opioide μ (MOR1), para determinar cuantitativamente la actividad de un agonista y antagonista en la señalización de GPCR.
Este protocolo describe primero cómo aislar las membranas crudas de las células que sobreexpresan MOR1. Tenga en cuenta queEste protocolo no se limita a sistemas de sobreexpresión y puede aplicarse a muchas fuentes de membrana, incluyendo tejido nativo o preparaciones que expresan múltiples receptores y proteínas G 15 . El protocolo entonces detalla cómo medir la unión de un análogo de GTP radiactivo a estas membranas en respuesta a concentraciones variables de [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) o naloxona, un agonista y antagonista de MOR1, respectivamente. El análogo de GTP, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), no es hidrolizable. Esta propiedad es crítica porque las subunidades G α exhiben actividad GTPasa intrínseca 7 y eliminaría el gamma fosfato marcado sobre un radioquímico GTP hidrolizable. Las membranas son entonces atrapadas sobre filtros de fibra de vidrio y lavadas, después de lo cual el GTP radiomarcado se cuantifica por recuento de centelleo líquido. Se pueden derivar múltiples parámetros farmacológicos para caracterizarE la interacción receptor-ligando, incluyendo la respuesta semimáxima (EC50) y el coeficiente de Hill (nH) para los agonistas y la concentración inhibitoria medio-máxima (IC50) y la constante de disociación de equilibrio (Kb) para los antagonistas 16 , 17 , 18 .
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Protocol
1. Expresión de HA-MOR1 recombinante en células cultivadas
NOTA: Siga todos los protocolos de cultivo celular en una campana estéril de flujo laminar.
- Esterilizar la capa de flujo laminar de cultivo celular con etanol al 70% y mantener la técnica estéril en todo el cultivo celular.
- Se prepararon células de riñón embrionarias humanas 293 (HEK293) medio de cultivo celular, medio de Eagle modificado completo de Dulbecco (DMEM): DMEM, pH 7,4, suplementado con 2 mM de L-glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina y 10% de suero bovino fetal ).
- Placa 2,5 x 10 6 células HEK293 sobre una placa de cultivo de tejidos de 10 cm en 10 ml de DMEM completo e incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta alcanzar una confluencia del 70-80% (O / N).
NOTA: Para recolectar suficiente proteína para un experimento de unión a GTP completo, plancha por lo menos 3 placas de 10 cm de células. - Transfectar las células con HA-MOR1 utilizando un reactivo de transfección de elección y siguiendo las instrucciones del fabricante,; S directrices. Incubar durante 36-48 h.
NOTA: El ADNc de MOR-1 humana (NCBI Reference Sequence: NM_000914.4) era un don generoso de Gavril Pasternak y se clonó en pCMV-HA.
2. Fraccionamiento celular y recolección de membranas
- Preparar los siguientes tampones de lisis:
- Tampón 1: ácido 4- (2 - hidroxietil) - 1 - piperazinoetanosulfónico 10 mM (HEPES), pH 7,4; 1 mM de ácido etilenglicol-bis (β-aminoetil éter) -N, N, N ', N'-tetraacético (EGTA); Sacarosa al 10%; Cóctel inhibidor de proteasa; Y ditiotreitol 1 mM (DTT). Agregue el DTT fresco el día del aislamiento de la membrana.
- Tampón 2: HEPES 10 mM, pH 7,4; 1 mM de EGTA; 1 mM de MgCl $ ₂ $ ; Y 1 mM de DTT. Agregue el DTT fresco el día del aislamiento de la membrana.
- Quitar las células transfectadas de la incubadora (paso 1.4), aspirar el medio y enjuagar las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada con hielo. Aspirar el PBS y el exceso de líquido deel plato.
- Añadir 600 μl de Tampón 1 a las células. Usando un raspador de células, desalojar las células de la superficie de la placa y pipetear la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga de 1,6 ml.
- Inmediatamente engaje el tubo de microcentrífuga en nitrógeno líquido. Una vez que las muestras son congeladas, descongelar los lisados en hielo o colocarlos a -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
- Repita los pasos 2.3 y 2.4 con todas las placas de las células.
- Una vez que los lisados se han descongelado, utilice un homogeneizador de micro-tubo de un solo pulso para abrir las celdas. Pulse el homogeneizador 3-5 veces durante 10 s, colocando el tubo de nuevo en el hielo durante 30 s entre pulsos.
- Recoger 20 μL como fracción de células enteras.
- Centrifugar la muestra restante durante 10 min a 1.000 xg y 4 ° C. Recoger el sobrenadante y colocarlo en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,6 ml sobre hielo.
- Resuspender el sedimento en 100 μl de Tampón 1 y volver a homogeneizar con un mazo. Pulse el homoGenizer 3-5 veces durante 5 s, colocando el tubo de nuevo en el hielo durante 30 s entre pulsos.
- Centrifugar la muestra una segunda vez durante 10 min a 1.000 xg y 4 ° C. Combinar el sobrenadante con el sobrenadante del paso 2.7.
NOTA: El gránulo restante contiene proteínas nucleares y de membrana.
- Centrifugar la muestra una segunda vez durante 10 min a 1.000 xg y 4 ° C. Combinar el sobrenadante con el sobrenadante del paso 2.7.
- Centrifugar los sobrenadantes combinados durante 20 min a 11.000 xg y 4ºC. Separar el sobrenadante (la fracción citosólica) en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,6 ml.
- Resuspender el sedimento en 200 μl de tampón 2. Homogeneizar el sedimento triturándolo 3-5 veces. Centrifugar la muestra durante 20 minutos a 21.100 xg y 4 ° C. Aspirar el sobrenadante. Resuspender el sedimento que contiene la fracción de membrana cruda en 50 μl de Tampón 2.
- Inmediatamente proceder a los experimentos de unión a GTPγS (sección 3) o congelación rápida en nitrógeno líquido y almacenar a -80 ° C.
3. Unión [35S] GTPγS
NOTA: Utilice el protocolo de seguridad radioquímica estándar cuando se manipula [35S] GTPγS y cuando se realizan experimentos de unión a [35S] GTPγS. Use guantes protectores y una bata de laboratorio en todo momento. Compruebe que el material de embalaje no tenga fugas ni grietas. Deseche los residuos y el exceso de reactivos de acuerdo con los protocolos institucionales.- Preparar el tampón de unión incompleto (IBB) mezclando HEPES 50 mM, pH 7,4; MgCl _ {2} 5 mM; NaCl 100 mM; Y ácido etilendiaminotetraacético 1 mM (EDTA) en agua destilada.
- Diluir el stock [35S] GTPγS a 50 nM en Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 y DTT 10 mM. Hacer 500 μL de alícuotas y almacenarlas a -80 ° C. Utilice sólo una alícuota recién descongelada inmediatamente antes de iniciar el experimento. Descongele las partes alícuotas en hielo.
- Preparar GTPγS no marcado con radiación disolviendo 1 mg de polvo de GTPγS en 177,62 μl de agua pura para una concentración de stock de 10 mM. Haga alícuotas de 10 μL y guárdelas en-20 ° C.
- Preparar el tampón de unión completo (CBB) mediante la adición de IBB para incluir una concentración final de DTT 1 mM, albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1% (p / v), 10 μM de GDP y [35S] GTPγS 0,1 nM.
NOTA: El CBB ahora contiene GTP radiomarcado. Tome las precauciones de seguridad apropiadas mientras trabaja con soluciones radiactivas. - Descongele la fracción de membrana de la etapa 2.11 sobre hielo.
- Cuantificar la concentración de proteína de la fracción de membrana a través de un ensayo de proteína Bradford utilizando un espectrofotómetro a 595 nm.
- Preparar una serie de diluciones de patrones de proteína BSA con tampón 2, a concentraciones finales de 0, 250, 500, 750, 1.500, 2.500 y 5.000 μg / mL.
- Añadir 2 μl de cada estándar o membrana a 1 mL de reactivo Bradford en una cubeta. Mezclar completamente vortexing.
- Ajustar el espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm y en blanco utilizando la cubeta con 0 μg / ml de proteína.
- Esperar 5 min y rCada una de las normas y cada una de las muestras a una longitud de onda de 595 nm.
- Trazar la absorbancia de las normas frente a la concentración. Utilizando la Ley de Beer-Lambert (A = εcl, donde ε = coeficiente de extinción, l = longitud de la cubeta, yc = concentración), calcule la concentración de las muestras de membrana.
- Diluir las fracciones de membrana a una concentración de 100 μg de proteína / ml en IBB.
NOTA: Un plato de 10 cm de células HEK293 típicamente produce entre 1 y 3 mg de proteína / ml. - Preparar las siguientes condiciones experimentales en tubos individuales de microcentrífuga de 1,6 ml: una serie de dilución de ligando, una condición de actividad basal para medir la unión basal de GTP y una condición de unión no específica para medir la unión no específica de GTP.
- Para la serie de dilución de ligando, preparar una serie de dilución del ligando de interés en un volumen final de 100 μl de CBB. Preparar la serie de ligandos a 2x la concentración final deseadaOns Espaciar las concentraciones de ligando para cubrir adecuadamente un rango de respuestas.
- Para ensayar el efecto de DAMGO sobre la unión a GTP a través de MOR1, se prepararon diluciones DAMGO de 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM y 2 pM en CBB (final Volumen: 100 mu l).
NOTA: Por ejemplo, si el ligando de interés tiene un valor EC50 esperado de 10 μM, prepara diluciones de ligando de 200 nM, 2 μM, 20 μM, 200 μM y 2 mM. Estas cinco condiciones cubren una amplia gama de concentraciones y son 2x la concentración deseada para el ensayo.
- Para ensayar el efecto de DAMGO sobre la unión a GTP a través de MOR1, se prepararon diluciones DAMGO de 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM y 2 pM en CBB (final Volumen: 100 mu l).
- Para la unión basal, prepare un tubo con 100 μl de CBB solamente.
- Para la unión no específica, preparar un tubo con 99 μL de CBB suplementado con 1 μl de GTPγS no marcado con 2 mM.
- Para la serie de dilución de ligando, preparar una serie de dilución del ligando de interés en un volumen final de 100 μl de CBB. Preparar la serie de ligandos a 2x la concentración final deseadaOns Espaciar las concentraciones de ligando para cubrir adecuadamente un rango de respuestas.
- Añadir 100 μl de la solución de membrana diluida (paso 3.7) a cada condición experimental.
- Incubar las membranas con los diversos experimEn tubos de microcentrífuga de 1,6 ml durante 30 min a 25 ° C en un termomixador o en un agitador orbital.
4. Filtración de Membrana
- Preparar el tampón de lavado combinando Tris-HCl 50 mM, pH 7,4; 5 mM de MgCl $ ₂ $ ; Y 50 mM de NaCl en agua destilada.
- Presoak los filtros de fibra de vidrio en agua durante 10 min.
NOTA: Los filtros tienen un tamaño de poro de 1 μm, un diámetro de 2,1 cm y un espesor de 675 μm. - Retire las muestras del termomixer o agitador orbital (paso 3.10). Hacer girar brevemente las muestras durante 5 s para recoger cada muestra en la parte inferior del tubo.
- Retire la tapa del aparato de filtración al vacío. Coloque los filtros previamente calcinados en los orificios de vacío del aparato. Vuelva a asegurar la tapa del aparato para formar un sello de vacío. Encienda el aspirador.
- Pipetear 195 μL de cada 200 μL de condición experimental en filtros para minimizar el error de la adsorción a las paredes del tubo y / o de la pipetaTing
- Lavar los filtros tres veces con 1 mL de tampón de lavado helado.
5. Cuenta de centelleo líquido
- Coloque los viales de cuentaje de 5 ml en un bastidor de recuento. Añadir 5 ml de líquido de centelleo a cada vial.
- Apague el vacío (paso 4.4). Retire la tapa del aparato de filtración al vacío. Usando pinzas, tome los filtros de los orificios de vacío del aparato de filtración y deje caer cada filtro en un vial de centelleo individual de 5 ml.
- Prepare un vial con 195 μL de CBB para determinar la señal máxima.
- Cubra cada vial de forma segura. Incubar los viales en un agitador orbital a 25 ° C durante 10 min.
- Encienda el contador de centelleo. Programar el contador de centelleo para medir la emisión de isótopos 35 S durante 5 min por muestra usando el programa de centelleo asociado estándar.
- Presione "Inicio" para tomar una cuenta.
- Cuando finalice el conteo, deseche el vial contadoS como residuos peligrosos.
6. Análisis de datos
- Introduzca los datos en el software de estadísticas y análisis.
- Restar la unión no específica de cada una de las otras mediciones para determinar la unión específica.
NOTA: El grado de unión no específica se determina por la muestra incubada con GTPγS no radiomarcado (etapa 3.8.3). - Abra el software de estadísticas y análisis y seleccione una entrada de conjunto de datos XY.
- Introduzca los datos de unión específica de los experimentos de unión de [35S] GTPγS a una tabla de datos en el software de estadística y análisis. Introduzca las concentraciones agonistas, en forma de concentraciones molares, en la columna "X". Introduzca los 35 S contables asociados como valores "Y".
- Restar la unión no específica de cada una de las otras mediciones para determinar la unión específica.
- Transforma los datos.
- Convierta los valores de X a su logaritmo respectivo haciendo clic en "Analizar". Seleccione "Transformar" desde el built-iN análisis.
- En el cuadro de diálogo "Transformar", seleccione "Transformar valores X usando" y seleccione la función "X = log (X)". Elija crear un nuevo gráfico de los resultados.
- Haga clic en Aceptar."
- Normalizar los valores Y.
- Con los resultados transformados mostrados, haga clic en "Analizar". Seleccione "Normalizar" de los análisis integrados.
- En el cuadro de diálogo "Normalizar", seleccione el botón de opción para definir 0% como el "valor más pequeño en cada conjunto de datos" y el 100% como "el valor más grande en cada conjunto de datos". Seleccione el cuadro para presentar los resultados como porcentajes. Seleccione el cuadro para crear un nuevo gráfico de los resultados.
- Haga clic en Aceptar."
- Ajustar una curva de regresión no lineal a los datos trazados. Realizar un análisis de regresión no lineal.
- Con los resultados normalizados mostrados, haga clic en "Analizar". De los análisis incorporados, Seleccione "Regresión no lineal (ajuste de curva)".
- Si investiga un agonista, seleccione "registro (agonista) frente a respuesta normalizada - pendiente variable" en el cuadro de diálogo.
- Si se investiga un antagonista, "seleccione log (antagonista) frente a la respuesta normalizada - pendiente variable" del cuadro de diálogo.
- Haga clic en Aceptar."
- Revise el gráfico y los resultados para asegurarse de que el ajuste y los datos estén en un acuerdo razonable. Asegúrese de que la regresión coincida con el patrón general de los datos trazados y de que los residuos no sean tan grandes que hagan plana la curva dosis-respuesta.
NOTA: El software resume los resultados de la regresión no lineal y detalla la concentración que provoca la respuesta semimáxima (EC50), el coeficiente de Hill (n H ) y la concentración inhibitoria semimaxal (IC50). - Derivar la potencia del parámetro agonista / antagonista.
- Derivar el agonista equConstantes de disociación de ilibrio (K $ _ { b } $) de cualquiera de los siguientes experimentos 16 , 17 , 18
- Evaluar el cambio en la dosis-respuesta de un agonista en competencia con una concentración fija de antagonista. En este caso, CE50 '= CE50 (1 + [antagonista] / antagonista Kb ), donde EC50' es la EC50 desplazada a la derecha.
- Evaluar la unión de [35S] GTPγS con concentraciones variables de antagonista en competencia con una concentración fija de agonista. En este caso, Kb = IC50 / (2 + (agonista / agonista EC50) n ) 1 / n - 1, donde n es el coeficiente de Hill del agonista.
- Derivar el agonista equConstantes de disociación de ilibrio (K $ _ { b } $) de cualquiera de los siguientes experimentos 16 , 17 , 18
- Dependiendo de la variabilidad de los datos, repetir el experimento (pasos 3.8-5.6) para cada ligando aproximadamente 3-5 veces y el promedio de los resultados utilizando un software de estadística y análisisson.
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Representative Results
El fraccionamiento celular puede usarse para aislar y enriquecer proteínas asociadas a membranas a partir de proteínas citosólicas y nucleares. La Figura 1 es una transferencia de Western que demuestra el contenido de las tres fracciones primarias que se pueden recoger durante el proceso de fraccionamiento subcelular. Específicamente, la Figura 1 muestra que el fraccionamiento separa de forma limpia las proteínas de membrana ( es decir Na + / K + ATPasa, proteína disulfuro isomerasa (PDI) y HA-MOR1) de histona H2B y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), proteínas nucleares y proteínas citosólicas, respectivamente. Adicionalmente, la Figura 1 demuestra el enriquecimiento de proteínas (carril 1 comparado con el carril 4) en sus respectivas fracciones subcelulares como resultado del fraccionamiento. Una mancha representativa de Ponceau demuestra una carga de proteína igual en cada fracción. Es importante señalar que estaProtocolo de onación no distingue entre diferentes membranas celulares. PDI generalmente se localiza en el retículo endoplásmico (ER), mientras que Na + / K + ATPasa se encuentra predominantemente en la membrana plasmática. Sin embargo, ambas proteínas están presentes en la fracción final de membrana cruda ( Figura 1 , carril 4). Además, aunque este protocolo separa fuertemente las proteínas nucleares de la fracción de membrana citosólica y final ( Figura 1 , carriles 2-4), la fracción enriquecida para proteínas nucleares contiene algunas proteínas de membrana ( Figura 1 , carril 2), posiblemente de ER.
Pueden derivarse múltiples parámetros farmacológicos para caracterizar una interacción GPCR-ligando a través de experimentos de unión a GTP ( Tabla 1 ). Por ejemplo, la respuesta semimáxima (EC50) y el coeficiente de Hill (n H ) de un agonista se pueden derivar mediante el seguimiento de la unión de GTP enRespuesta a dosis variables del agonista. La Figura 3A muestra la unión GTP sensible a la dosis a MOR1 después del tratamiento con DAMGO. Cuando los datos se ajustan a una regresión no lineal de cuatro parámetros, el ajuste describe una interacción receptor-ligando con una EC50 de 185 ± 23 nM y un coeficiente de Hill de 0,46 ± 0,06. La curva de unión a GTP poco profunda observada después del tratamiento DAMGO sugiere una cooperatividad negativa entre DAMGO y MOR1. Este método también puede identificar y describir la farmacología de un antagonista. Como ilustra la Figura 3A y B , la naloxona es un antagonista de MOR1. La potencia agonista (K $ _ { b } $) de naloxona, 97 ± 20 nM, se determinó variando la concentración de naloxona en competencia con una concentración fija de DAMGO ( Figura 3A ). La naloxona mostró un coeficiente de Hill de 0,88 ± 0,06, lo que sugiere unión independiente entre naloxona y MOR1. Si el acDe un ligando es desconocido, este ensayo puede discriminar entre un agonista, un antagonista y un agonista inverso. Si el ligando es un agonista, habría un aumento en la unión a GTP, como en la Figura 3A , después de la aplicación de DAMGO. Si el ligando es un agonista inverso, habría una unión disminuida de GTP con respecto a la unión basal. Si el ligando es un antagonista, no habría ningún efecto sobre el tratamiento con ligando solo. Si se aplica concomitantemente con un agonista, un antagonista inhibirıa la capacidad del agonista para estimular la unión a GTP. La Figura 3A ilustra la actividad antagonista de la naloxona frente al agonista DAMGO.
Figura 1: El fraccionamiento celular separa proteínas asociadas a la membrana, nucleares y citosólicas. ( Superior ) El carril 1 representa elProteína presente en la célula entera. El carril 2 contiene proteínas nucleares y asociadas a la membrana separadas durante las primeras etapas de centrifugación. El carril 3 es la fracción citosólica separada después de 20 minutos de centrifugación a 11.000 x g. El carril 4 contiene una fracción de membrana cruda adecuada para experimentos de unión a [35S] GTPγS. ( Parte inferior ) La tinción de Ponceau de una membrana occidental demuestra la carga de proteína para cada fracción celular. Se usaron los siguientes anticuerpos para inmunotransferencia: anti-Na + / K + -ATPasa de ratón (1: 1.000), anti-GAPDH de ratón (1: 5.000), anti-H2B de ratón (1: 2.500), anti-PDI de conejo : 1.000), y anti - HA de rata (1: 2.000). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema de flujo que resume el fraccionamiento y el procedimiento de unión de [35S] GTPγS. En primer lugar, transfectar las células para expresar el GPCR de interés. Después de 48 h, cosecha y fracciona las células para aislar el receptor (rojo) y las proteínas G asociadas (verde = G α , morado = G β y naranja = G γ ). Para realizar experimentos de unión a GTP, a~nadir [35S] GTPγS e incubar las membranas con el ligando de interés. Para medir la actividad de la proteına G, se unen las membranas a un filtro para eliminar cualquier radioquımico no unido y luego cuantificar el [35S] GTPγS unido por conteo de centelleo lıquido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Agonismo aNd Antagonismo en receptores opioides μ definidos por la unión de [35S] GTPγS. ( A ) curva de dosis-respuesta de [35S] GTPγS a DAMGO solo (azul) o naloxona en competencia con DAMGO 2,5 μM (verde). La unión de [35S] GTPγS se normalizó a la estimulación máxima en cada experimento y se expresó como un porcentaje. Los puntos mostrados son la media de las determinaciones triplicadas y se expresan como la media ± SEM ( B ) Antagonismo de DAMGO estimulado [35S] GTPγS Unión por naloxona. [35S] GTPγS La unión se cuantificó después de la adición de naloxona sola (100 μM), DAMGO solo (10 μM) o DAMGO (10 μM) en competencia con naloxona (100 μM). Los resultados se expresan como la media ± SEM de tres experimentos independientes. Por favor, haga clic en élPara ver una versión más grande de esta figura.
| Ligando | EC50 o IC50 (nM) | N | K $ _ { b } $ (nM) |
| DAMGO | 185 ± 23 | 0,46 pm 0,06 | |
| Naloxona | 420 ± 87 | 0,88 pm 0,06 | 97 ± 20 |
Tabla 1: Parámetros Farmacológicos de la Actividad DAMGO y Naloxona en los Receptores μ-opioides. La respuesta semimáxima (EC50) y el coeficiente de Hill (n H ) para DAMGO se derivaron de la unión de [35S] GTPγS en respuesta a dosis variables de DAMGO. La concentración inhibitoria medio-máxima(CI50) y la constante de disociación de equilibrio (Kb) para la naloxona se determinaron a partir del efecto de la competencia entre la naloxona y DAMGO 2,5 μM en la unión de [35S] GTPγS. Los resultados se expresan como la media ± SEM de tres experimentos independientes.
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Discussion
El presente protocolo describe dos métodos separados pero complementarios: un enfoque sencillo para fraccionar células y tejidos en compartimentos amplios pero distintos y un medio para investigar la señalización de GPCR midiendo la unión de [35S] GTPγS.
El fraccionamiento celular eficiente tiene una amplia gama de aplicaciones, que van desde la extracción y enriquecimiento de proteínas, hasta la evaluación de la localización subcelular de proteínas, hasta el estudio de la farmacología de receptores. Aunque existen enfoques alternativos para las células y tejidos fraccionados, el protocolo presentado aquí es comparativamente más barato, más rápido y más sencillo. Sin embargo, a diferencia de métodos más establecidos, este método no puede separar separadamente las proteínas asociadas a la membrana plasmática de otros compartimentos membranosos, como los endosomas o la ER. También debe observarse que mientras que el protocolo anterior utiliza un sistema de sobreexpresión transitoria para generar membranas celulares que contienen el GPCR de, Este protocolo es compatible con sistemas de sobreexpresión estable, así como con tejido animal o humano 19 .
La preparación de la muestra es crítica para maximizar el rendimiento y la pureza de la fracción. Es particularmente importante asegurar una homogeneización completa y minimizar los tiempos de transición entre las etapas de centrifugación. El uso de un granulador homogenizador / mazo para interrumpir completamente la membrana celular aumenta significativamente el rendimiento de la membrana cruda en la fracción celular final. Si el rendimiento de la membrana es demasiado bajo, las dos soluciones más sencillas serían escalar el cultivo celular inicial y / o homogeneizar el gránulo celular unas pocas veces más. Si las fracciones individuales muestran un alto grado de impureza, reduzca los tiempos de transición entre la centrifugación y la separación. No permita que las muestras se sienten después de la centrifugación, ya que las proteínas pueden difundirse en la muestra y reducir la pureza de la fracción.
El [35S] GTPγ basado en la filtraciónS es un método rápido y cuantitativo para medir la activación de las proteínas G usando el receptor asociado. Medir el enlace de GTP permite una medición más cuantitativa de la actividad de GPCR que generalmente es posible cuando se monitorean procesos descendentes. Sin embargo, hay dos limitaciones críticas para el método descrito aquí. Lo que es más importante, la cuantificación basada en la filtración [ 35 S] GTPγS no es igualmente factible con todas las isoformas G α 20 , 21 . En general, este método está restringido a GCR de acoplamiento G i / o como MOR1 [ 22] . Los receptores acoplados G s - y G q tienden a ser menos sensibles. Esto es probablemente debido a la combinación de la menor abundancia de G s / G q y su relativamente menor tasa de cambio de nucleótidos, lo que hace difícil distinguir real [ 35 S] GTP γ vinculante por encima del fondo. Esta limitación ha sido abordada Utilizando las técnicas de captura de anticuerpos de proteína G 20 . Algunos grupos han descubierto que la eliminación del PIB de la reacción mejora la relación señal / ruido de los receptores acoplados a G s - o G q [ 23] . La segunda limitación es la sensibilidad de la membrana a los agonistas o surfactantes lipófilos. Los ensayos de [35S] GTPγS requieren complejos funcionales de receptor-proteína G, y la adición de moléculas lipófilas al sistema de reacción puede alterar la estructura de las membranas o de estos complejos. Si esto es una preocupación potencial, puede ser ventajoso probar si el reactivo de interés interrumpe la unión de [35S] GTPγS en un sistema ya bien caracterizado, tal como en la estimulación MOR1 mediada por DAMGO. Otras condiciones a considerar para optimizar incluyen el pH del tampón de unión, las concentraciones de Mg2 + y NaCl, la concentración de proteína y el tiempo de incubación 23 ,Ef "> 24.
Este protocolo se centró en un bien caracterizado GPCR, el MOR1, y bien caracterizado los fármacos, DAMGO (agonista) y naloxona (antagonista), que actúan en MOR1. Sin embargo, una de las ventajas de esta técnica es que puede usarse para caracterizar ligandos desconocidos como agonistas, antagonistas o agonistas inversos, dependiendo de cómo el ligando module la unión a GTP. Al diseñar experimentos, es crítico usar una gama de concentraciones del ligando de interés y tener en cuenta la gama de resultados: los agonistas causarán un aumento en la unión de GTP sobre la línea base, los agonistas inversos causarán una disminución en el enlace de GTP en comparación con Basal, y los antagonistas tendrán poco o ningún efecto cuando se añaden aisladamente sobre la unión basal de GTP.
En resumen, este protocolo describe una técnica para realizar el fraccionamiento subcelular, la recolección de preparaciones de membrana cruda, e investigar la activación de GPCR mediante la medición de [ 35 S] GTPyS. Estas técnicas pueden adaptarse fácilmente a una variedad de modelos de cultivo celular y tejido para estudiar la farmacología de una de las familias más importantes de receptores.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la concesión nacional de los institutos de la salud DA-000266 y la concesión del programa de entrenamiento del científico médico C32 (CV, NWZ, y PCS). Los autores también quieren reconocer somersault18: 24 (somersault1824.com) para la Biblioteca de Ciencias y Ilustraciones Médicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in a 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Cell culture 10 cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), New York, NY. 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), New York, NY. 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5'-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin - Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), New York, NY. 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), New York, NY. 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , Springer. 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
