Artigo de método

preparação e In Vitro Caracterização de magnetizado miR-modificado Células Endoteliais

DOI:

10.3791/55567

⸱

2 de maio de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

Neste artigo

Resumo

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Este manuscrito descreve a entrega eficiente, não-viral de miR a células endoteliais por um vector de PEI / MNP e a sua magnetização. Assim, em adição à modificação genética, esta abordagem permite a orientação celular magnética e ressonância magnética detectabilidade. A técnica pode ser usada para melhorar as características de produtos de células terapêuticas.

Resumo

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Até à data, os tratamentos cirúrgicos e farmacológicos disponíveis para doenças cardiovasculares (DCV) são limitados e frequentemente paliativo. Ao mesmo tempo, e de genes de células terapêuticas são abordagens alternativas altamente promissores para o tratamento de doenças cardiovasculares. No entanto, a vasta aplicação clínica da terapia genética é muito limitado pela falta de sistemas de distribuição de genes adequados. O desenvolvimento de vectores de entrega de genes adequados podem fornecer uma solução para os desafios actuais em terapia celular. Em particular, os inconvenientes existentes, tais como a eficiência limitada e retenção celular baixo no órgão lesionado, pode ser superado por engenharia celular apropriada (isto é, genética) antes do transplante. O protocolo apresentado descreve a modificação transiente eficiente e segura de células endoteliais utilizando uma nanopartícula magnética superparamagnético polietilenoimina (PEI / MNP) -based vector de entrega. Além disso, o algoritmo e métodos para a caracterização de células são definidas. O intracellu sucessoentrega lar de microARN (MIR) em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foi alcançado sem afectar a viabilidade celular, a funcionalidade, ou comunicação intercelular. Além disso, esta abordagem foi comprovada a causar um efeito funcional forte em exógeno introduzido miR. Importante, a aplicação deste vector baseia-MNP assegura magnetização célula, com acompanhamento de possibilidades de direccionamento magnético e não-invasiva rastreio MRI. Isto pode fornecer uma base para magneticamente guiados terapêutica de células geneticamente modificadas, que podem ser monitorados de forma não invasiva com a RM.

Introdução

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Terapia genética e celular são ferramentas poderosas que têm o potencial para resolver os desafios atuais no tratamento de doenças cardiovasculares. Apesar do fato de que ambas as abordagens estão sendo testadas em ensaios clínicos, eles ainda não estão prontos para a ampla aplicação clínica 1. Notavelmente, uma abordagem comum para enfrentar os desafios de terapia genética e celular é desenvolver vectores de entrega de genes multifuncionais adequadas para aplicação clínica. A falta de sistemas de entrega de genes seguros e eficazes é a preocupação principal da terapia génica. Ao mesmo tempo, a engenharia genética de produtos celulares antes do transplante poderia superar os graves problemas de terapia celular, tais como a baixa eficiência (transplante de células pós-tronco, por exemplo, no campo cardíaca, apenas ~ 5% de melhoria funcional é conseguido um ) e a fraca retenção / enxerto no local da lesão (isto é, a retenção de célula cai abaixo de 5-10% dentro de minutos a horas por-aplicação, independentemente da via de administração 2, 3, 4).

Até à data, os vectores virais exceder grandemente os sistemas n virais em termos de eficácia, o que resultou na sua mais ampla aplicação em ensaios clínicos (~ 67%) 5. No entanto, os veículos virais trazem riscos sérios, tais como a imunogenicidade (e a subsequente resposta inflamatória, com complicações graves), oncogenicidade, e limitações no tamanho do material genético transportado 6. Devido a estas preocupações de segurança e os elevados custos de produo do vector viral, o uso de sistemas não-virais é preferível em certos casos, 7, 8. É particularmente adequado para desordens que requerem correcção genética transiente, tal como a expressão de factores de crescimento controlam a angiogese (por exemplo, para o tratamento de doenças cardiovasculares) ou a DELIVEry de vacinas.

No nosso grupo, um sistema de entrega foi concebido por combinação de polietilenoimina ramificada 25-kDa (PEI) e nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (MNP) ligadas entre si por interacção biotina-estreptavidina 9. Este vector é uma potencial ferramenta para a engenharia genética de células, permitindo a sua magnetização simultânea antes do transplante. Este último proporciona uma base para a orientação magnética / retenção, o que é particularmente promissora hoje em dia, como técnicas de segmentação magnéticas avançadas estão a ser desenvolvidas com êxito 10. Além disso, as células magneticamente responsivas resultantes têm o potencial de ser de forma não invasiva monitorizada por imagiologia por ressonância magnética (MRI) ou imagiologia de partículas magnéticas 11, 12.

No caso do vector de PEI / MNP, poliamina assegura condensação de ácido nucleico e, assim, a protecção do factor degradantes s, internalização vector em células, e endossomal escapar 5. O MNPs complementar as propriedades de PEI, não só em termos de orientação magnética, mas também pela redução da toxicidade conhecida PEI 7, 13, 14. Anteriormente, as propriedades vector PEI / MNP foram ajustadas em termos de eficiência de transferência (isto é, ADNp e miARN) e segurança usando fibroblastos mesenquimais humanas e células estaminais 15, 16.

Neste texto, um protocolo detalhado no pedido de PEI / MNPs para a geração de células modificada-miARN é descrito 17. Para este fim, HUVECs são utilizados e representam um modelo estabelecido para a angiogênese in vitro. Eles são difíceis de transfectar e são susceptíveis a influência tóxico 18, 19,ass = "xref"> 20. Além disso, nós fornecemos um algoritmo para avaliar tais células in vitro, incluindo a sua segmentação, a comunicação intercelular, e detecção de ressonância magnética.

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Protocolo

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Cordões umbilicais humanos para isolamento de células foram obtidas pós-parto de informadas as mulheres saudáveis que deram o seu consentimento por escrito para o uso deste material para pesquisa de acordo com a Declaração de Helsinki. O comitê de ética da Universidade de Rostock aprovou o estudo apresentado (reg. Não. A 2011 06, prolongada 23 de setembro de 2013).

1. Preparação de Complexos de transfecção

  1. A biotinilação de polietilenoimina (PEI).
    1. Dissolve ramificada PEI em água ultrapura com agitação magnética a 300-400 rpm durante 24 h à temperatura ambiente (TA) e protegida da luz para obter uma solução de 0,18 mM. Guardar a solução a 4 ° C.
    2. Medir a concentração de grupos amino primários na solução obtida 21, 22.
      1. Use solução reagente ninidrina 2% como o reagente de detecção amina 23 por mistura de 100 uL de prediluted amostra (1: 200 com água ultrapura) e 75 uL de reagente de ninidrina. Incubar durante 30 min a 80 ° C. Esfriá-la e adicionar 100 mL de 50% de etanol para a estabilização. Medir a absorvância a 550 nm no espectrofotómetro de absorção.
      2. Criar uma curva padrão utilizando glicina.
        1. Preparar amino-N solução de estoque 0,1 M (0,75 g de glicina em 100 mL de água desionizada) e suas diluições, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1: 100, 1: 200, e 1: 400, 1: 600. Medir estas soluções como no passo 1.1.2.1 e criar uma trama com a concentração e a absorvcia nos eixos.
        2. Com base na trama obtido e a absorvância medida da solução de PEI, definem a concentração dos grupos a-amino em PEI.
          NOTA: Cuidado. solução reagente ninidrina deve ser utilizada exclusivamente sob o capô e deve ser armazenado sob uma atmosfera de azoto. Ele não é utilizável quando a cor da solução muda devido à oxidação.
    3. Dissolve-se 100 mg de ligando de biotina em água ultrapura imediatamente antes da utilização para se obter uma solução de 0,01 mM. Calcular a quantidade necessária de biotina para adicionar a PEI multiplicando a concentração de grupos a-amino em PEI (medido no passo 1.1.2) por 20 para obter a quantidade necessária (em mol) de reagente de biotinilação.
      1. Adicionar a solução de biotina à solução de PEI a pH 8-9 e incuba-se durante 16 h, sob agitação magnética à temperatura ambiente.
    4. Remover a biotina que não reagiu por cromatografia de exclusão de tamanho 23. Use colunas disponíveis comercialmente que contêm um meio apropriado de filtração em gel para a purificação da 25-kDa PEI e seguir as instruções do fabricante. Tomar aluotas após purificação para medir a concentração de amina utilizando um reagente de detecção amina (passo 1.1.2) e para determinar a eficiência biotina conjugação (passo 1.2.2). Armazenar o PEI biotinilado obtido a 4 ° C.
  2. Personagemização de PEI biotinilado.
    1. Determinar a concentração de grupos a-amino em PEI após a biotinilação, conforme descrito no passo 1.1.2.
    2. Determinar o grau de PEI biotinilação para verificar o procedimento de conjugação. Para a quantificação, utilizar um kit disponível comercialmente, o qual é baseado na aplicação de corante HABA (ácido 4'-hydroxyazobenzene-2-carboxílico), para assegurar a correcta determinação colorimétrica dos níveis de biotinilação 24, 25. Siga as instruções fornecidas pelo fabricante.
  3. Filtração de MNPs e sua caracterização.
    1. Filtre disponível comercialmente MNP revestida com estreptavidina através de um filtro accionado-seringa de 0,45 16, a fim de excluir maiores agregados tóxicos. Medir a concentração final de ferro usando um ensaio fotométrico padrão 26.
    2. Examinar a qualidade dos MNPs filtrados por gravaçãoa curva de magnetização e por imagem TEM, em conformidade com protocolos convencionais 27, 28.
      1. Dilui-se a suspensão MNP com água destilada e colocar 3 mL da suspensão obtida sobre uma malha-300 grelha de cobre Formvar revestida a carbono para análise de TEM. Posteriormente, colocar essa grade sobre uma lâmina de vidro em uma placa de aquecimento e deixe secar.
      2. Analisar a amostra com um microscópio electrónico de transmissão a 120 kV e verificar o teor elementar utilizando um detector de raios X 27.
  4. rotulagem 3-cor de complexos de transfecção para microscopia de super-resolução.
    1. Rotular 0,5% dos grupos amino primários medidos em PEI com NHS-Ester Atto 488 corante seguindo as instruções do fabricante. Remover o excesso de corante n ligado por meio de cromatografia de exclusão de tamanho, como descrito acima (passo 1.1.4). Medir a concentração resultante de grupos amino usando um assa ninidrinay (passo 1.1.2).
    2. Rotular disponível comercialmente mexidos miR (SCR-miR) com Cyanine5 corante utilizando um kit de marcação adequado 15 (indicado na Lista de Materiais). Medir a concentração de fluoróforo-miR resultante espectrofotometricamente.
    3. Recentemente rotular o MNP cada vez com corante de biotina-conjugado (por exemplo, ATTO 565-biotina) a uma diluição 1: 1000 w / w proporção. Aplicar directamente o corante depois de adicionar o MNP para o miR / PEI durante a formação dos complexos de transfecção, por os detalhes em Delyangina et al. 16.

2. Preparação de células

  1. isolamento HUVEC.
    1. Isolar células a partir dos cordões umbilicais imediatamente após a obtenção dos cabos utilizando digestão com colagenase a partir do interior da veia do cordão; seguir um protocolo previamente desenvolvido 29.
      1. Incubar cada cabo com ~ 60 unidades / mL de colagenase tipo IV solução em tampão de - carregado em tele veia umbilical - a 37 ° C durante 13 min.
    2. Para todas as experiências, reunir a HUVECs de um mínimo de 5 pacientes.
      NOTA: O cultivo não deve exceder 4-5 passagens. Não utilizar células contaminadas com micoplasma, como isto provoca uma diminuição na eficiência de transfecção. contaminação por micoplasma devem ser testados para antes de iniciar o protocolo usando um estojo de PCR para detecção altamente sensível de micoplasmas.
      1. Teste para a presença de micoplasma.
        1. Centrifugar 1 mL de sobrenadante de cultura de células durante 10 min (13000 x g). Suspende-se o sedimento em 17 uL de dH2O e ferver (93 ° C) durante 3 min. Use 2 uL da suspensão para amplificar a região de ADN que codifica para os ARN ribossomais 16S altamente conservados (-rRNA) de diversas espécies de micoplasmas.
        2. Executar a PCR utilizando 10 pmol de cada iniciador (iniciador directo: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 '; iniciador inverso: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') no penteinação com um estojo de PCR comercial sob as seguintes condições: 94 ° C durante 3 min; 45 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 50 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 30 s; e uma extens final a 72 ° C durante 10 min.
        3. Analisar o produto de PCR (292 pb), utilizando electroforese em gel de agarose.
    3. De qualquer armazenar as células obtidas a longo prazo em azoto líquido ou a cultura deles em meio de crescimento endotelial suplementado com 100 U / mL de penicilina e 100 ug / mL de estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidi fi cado contendo 5% de CO 2.
  2. caracterização de HUVEC.
    1. Caracterizar HUVEC isolado em termos da sua capacidade funcional para construir tubos na matriz da membrana basal (por exemplo, matrigel) e a sua expressão de CD31 o marcador endotelial (plaquetas endoteliais molécula de adesão celular, PECAM-1) seguindo os protocolos padrão de 30, 31.

3. Transfecção

  1. Tripsinizar a cultura da HUVEC (ver o passo 4.1.2.) E contar manualmente as células utilizando um hemocitómetro. Semear a HUVEC em placas de cultura de células bem plástico de tamanho adequado, com uma densidade de células inicial de cerca de 13000 células / cm2 de superfície de crescimento, 48 horas antes da transfecção, até 70-80% de confluência é atingido.
  2. Prepare fresco miR / PEI / MNP complexos cada vez.
    NOTA: Em primeiro lugar, os complexos de miR / PEI deve ser obtidas (passos 3.2.1 - 3.2.3); subsequentemente, MNPs deve ser adicionada à solução de miR / PEI (passo 3.2.4) a fim de obter a formulação final miR / PEI / MNP utilizado para a transfecção (passo 3.3).
    1. Calcular a quantidade de miR apropriado disponível comercialmente (mexidos, com etiquetas ou funcional, ver passo 4) utilizando a concentração do estoque fornecida pelo fabricante. Use 2,5 pmol de miR / cm2 de superfície de crescimento celular. Dilui-se o miR em solução de glucose a 5% para obtain uma concentração final de 0,125 pmol de miR / mL.
    2. Com base na quantidade de miR a partir do passo 3.2.1 e a proporção óptima de NP 25, 32, calcular a quantidade necessária de PEI usando a sua concentração medidos (passo 1.1.2). Dilui-se a PEI (pelo volume requerido calculado) em um volume igual de solução de glucose a 5%. Adicionar o obtido PEI pré-diluído à solução miR (a partir do passo 3.2.1) e agitar com vortex a mistura obtida durante 30 s.
    3. Incubar a mistura miR / PEI obtida durante 30 minutos à temperatura ambiente.
    4. Sonicar a MNPs a 35 kHz para menos de 20 min no banho de água de sonicação (ver a Lista de Materiais), à TA, adicionar a quantidade apropriada de solução MNP para o miR / PEI (5 - 25 ug de ferro / mL de preparado de miR / PEI / mistura MNP 16), vortex durante 30 s, e incubar durante 30 min à temperatura ambiente até que esteja pronto.
  3. Adicionar gota a gota, a mistura de miR / PEI / MNP preparados directamente ao meio de cultura nas células. Utilizar a mistura resultante de cul célulameio tura com miR / PEI / MNP diluída em glucose como a solução de transfecção. Substituir esta mistura com meio de cultura de 6 horas pós-transfecção fresco.

4. Análise de Segurança Vector

  1. Exame da viabilidade celular.
    1. Transfectar as células HUVEC semeadas numa placa de cultura de 24 poços (passos 3.1 e 3.2); usar Cy3 miR como as sondas de teste e mexidos miR (SCR-miR) como as sondas de propagação de controlo para a citometria de fluxo. Incubar a 37 ° C numa atmosfera humidi fi cado contendo 5% de CO 2 durante 24 h.
    2. Recolhe-se o sobrenadante e as células transfectadas por tripsinização utilizando 1x tripsina-EDTA diluída em PBS adicionados às células durante 4 min a 37 ° C. Centrifugar a 300 xg durante 10 min e usar-se para a análise.
    3. Examinar a viabilidade celular e miR eficiência de absorção 24 h após a transfecção utilizando a citometria de fluxo através da aplicação de um corante disponível comercialmente de distinguir entre células vivas / mortas; utilizam protocolos padrão 15 . Aplicar as células não transf ectadas como um controlo positivo para a viabilidade.
  2. Examinar a segurança dos complexos miR / PEI / MNP para células em ensaios funcionais.
    1. Avaliar a actividade de proliferao de culas transfectadas.
      1. Transfectar células HUVEC semeadas numa placa de cultura de 12 poços (passos 3.1 e 3.2) com anti-sentido funcional miR (por exemplo, anti-miR92a para HUVECs 31) e incubar a 37 ° C numa atmosfera humidi fi cado contendo 5% de CO 2 durante 24 h.
      2. Usar um kit disponível comercialmente para definir o número de células em proliferação por coloração com EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) e varrimento com microscopia confocal a laser. Utilize as seguintes definições de microscopia: objetiva de 40X com imersão em óleo; laser de excitação 633 nm (para um corante 647 nm); 5 campos aleatórios para ser gravada em cada amostra. Calcular a taxa de células em proliferação por divisão do número de núcleos corados EdU ao número total de núcleos (Hoechr-manchado).
    2. Avaliar a capacidade das culas transfectadas para formar estruturas semelhantes a tubo, como anteriormente descrito 17, 31.
      1. Transfectar as células HUVEC semeadas numa placa de cultura de 24 poços (passos 3.1 e 3.2) com scr-miR e incubar durante 48 horas a 37 ° C numa atmosfera humidi fi cado contendo 5% de CO 2. Recolher as células transfectadas (tal como no passo 4.1.1).
      2. Semente de 3,5 x 10 4 de HUVECs modificados em placas de 24 poços revestidas com 140? L de matriz de membrana basal. Incubar durante 18 h a 37 ° C numa atmosfera humidi fi cado contendo 5% de CO 2.
      3. gravar imagens de 10 campos aleatórios em cada microscopia confocal bem usando varredura a laser (diferencial contraste de interferência) e analisar usando software ImageJ com o plugin "Angiogenesis Analyzer". Incluem parâmetros tais como o comprimento total de ramos, o número de ramos, e o número de junctions na avaliação. Compare isso com o controle sem tratamento.
  3. Examinar a possível influência tóxicos de complexos de transfecção sobre junções de hiato (GJ) mediada comunicação intercelular (CIJH) por meio de testes de recuperação de fluorescência após a fotodegradação 3D (FRAP) 33 em 3D.
    1. Semear as células sobre lâminas de vidro revestidas com gelatina com um fundo fino adequado para processamento de imagem de células vivas (imersão em óleo). Transfectar as células como descrito acima na etapa 3.2, com não-rotulado, miR não-funcional (SCR-MIR) e incuba-se durante 24 h.
    2. Preparar as células para imagiologia, carregando-os com calceína directamente antes da microscopia. Em particular, substituir o meio de cultura com meio fresco contendo 5? M de calceina, incubar durante 20 minutos, lava-se com PBS, e adicionar meio de cultura fresco. Pré-aquecer a incubadora do microscópio a 37 ° C, e ajustar a concentração de CO 2 a 5%.
      NOTA: Todos os reagentes devem ser quente para evitar contrac celularção antes da medição.
    3. Utilizar um laser de excitação 561 nm para a visualização de células e do experimento FRAP. Em primeiro lugar, seleccionar manualmente células para a medição como regiões de interesse (ROI); células de teste deve ter pelo menos 3 células vizinhas. Definir uma célula de referência com fluorescência brilhante, estável que não irá ser branqueada. Definir os limites de um z-pilha. Gravar a fluorescência a partir do topo das células para a parte inferior para incluir 10 - 15 camadas.
    4. Branquear as células de ensaio, utilizando 100% de potência de laser e gravar a recuperação de fluorescência subsequente (devido à transferência de corantes específico GJ-a partir de células vizinhas) durante os 15 min seguintes. Registam-se os dados em bruto na z-pilhas a cada 60 s. No total, executar as medições FRAP com não menos do que 5-10 células de ensaio por cada experiência. Comparar os resultados com as células não transfectadas.

5. Teste de eficiência de transfecção

  1. Exame de captação miR.
    1. Preparar as sondas como se descreveu no step 4.1 e usá-los simultaneamente para definir a absorção de miR com citometria de fluxo.
  2. Confirmar e descrever a localização intracelular de complexos de transfecção por confocal e SuperResolution iluminação estruturada microscopia (SIM).
    1. Semear a HUVEC em lamelas de vidro revestidas com gelatina colocadas nos poços de placas de cultura de 24 poços, como descrito antes (passo 3.1). Transfectar as células com 3 cores marcado miR / PEI / MNP (passo 1.4) e incuba-se durante 24 h a 37 ° C numa atmosfera humidi fi cado contendo 5% de CO 2.
    2. Lavam-se as lamelas de cobertura em primeiro lugar com albumina de soro bovino a 2% (BSA) em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e depois com apenas PBS. Fixar as células por incubação em paraformaldeído a 4% (PFA) a 37 ° C durante 15 min e mancha núcleos com DAPI seguintes protocolos padrão 16. Lavar 3 vezes no agitador (15 min cada) para remover o excesso de corante.
      NOTA: PFA é cancerígeno e deve ser manuseado com cuidado.
    3. Coloque o prlamelas epared em lâminas de microscópio utilizando meio de montagem adequado, deixar secar pelo menos durante 1 h, e usá-los para microscopia, como descrito abaixo.
    4. Adquirir imagens utilizando uma objectiva de imersão em óleo de 63X e as seguintes definições: SIM 405-, 488, 561-, e linhas de laser 633 nm de excitação; Modo z-pilha com uma profundidade de 32 bits em 5 ângulos, 5 fases, com a média de 4; grade G2 com uma linha de 405 laser, G3 com um 488, G4 com um 561, e G5 com 633.
  3. Avaliar a funcionalidade do miR entregue por RT-qPCR em miR / PEI / MNP-HUVECs contra não tratada.
    1. Transfectar as células HUVEC cultivadas numa passos de 12 poços de cultura de placas (3.1 e 3.2), com anti-sentido funcional miR (por exemplo, anti-miR92a para HUVECs 31) e incuba-se durante 48 h a 37 ° C numa atmosfera humidi fi cado contendo 5% de CO 2.
    2. Avaliar a entrega anti-miR92a e processamento com RT-qPCR utilizando kits disponíveis comercialmente (ver materiais); siga tele as instruções do fabricante, conforme descrito na literatura 17, 31. Em paralelo, analisar a expressão do gene-alvo (por exemplo, 31 ITGA5).
      NOTA: entrega antagomir contra miR endógeno é preferido em relação imita uma vez que assegura a medição do resultado real do miR e não apenas a sua acumulação intracelular.

6. celular Segmentação Avaliação e separação celular magnética

  1. Direccionamento celular em condições estáticas in vitro.
    1. Transfectar as células HUVEC em uma placa de 24 poços (2,5 pmol / cm 2 scr-miR, NP 25, e 15-25 pg / mL MNP), incubar durante 24 h, lavar, e recolher como descrito acima (passo 4).
    2. Mistura-se o sedimento de células obtido a partir de um bem com 1 mL de meio de cultura fresco e colocá-lo nas cavidades de uma placa de 12 poços. Fixar um pequeno íman localmente (sobre o lado) na parte inferior da placa utilizando uma fita.
    3. Incubar a suspensão de células durante 24 h e observar a ligação de células e crescimento, na área sobre o íman e na área sem um íman. Para uma avaliação qualitativa, usar um microscópio invertido convencional.
  2. Direccionamento celular em condições dinâmicas simuladas in vitro.
    1. Transfectar as células HUVEC em uma placa de 24 poços por passos 3.1 e 3.2 (2.5 pmol / cm 2 Cy3 miR, NP 25, e 15-25 pg / mL MNP), incubar durante 24 h, lavar, e recolher por tripsinização utilizando 1x tripsina-EDTA diluída em PBS adicionados às células durante 4 min a 37 ° C. Centrifugar a 300 xg durante 10 min.
    2. Mistura-se o sedimento de células obtido a partir de um bem com 1 mL de meio de cultura fresco e colocá-lo dentro do poço de uma placa de 12 poços. Corrigir um pequeno ímã localmente (no lado de um poço) usando fita. Colocar a placa de cultura no agitador e incubar a suspensão de células durante 12 h a 150 rpm, para simular as condições dinâmicas 34.
    3. Lavam-se as células e fixar-los usando 4% de PFA. Manchar os núcleos com DAPI 16. Grave a fixação celular usando microscopia confocal de varrimento a laser com um laser de excitação 514 nm, o modo de z-pilha (5 - 12 fatias) para obter dados em bruto, e o processamento de imagem máximo de projecção intensa para criar as imagens para análise.
  3. A análise quantitativa de células magneticamente responsivas e não-responsivos.
    1. Transfectar as células HUVEC em uma placa de 24 poços (2,5 pmol / cm 2 scr-miR, NP 25, e 15-25 pg / mL MNP), incubar durante 24 h, lavar, e recolher, conforme descrito antes (passo 6.2.1) . PBS e célula tampão triagem pré-quente (esterilizado por filtração, ver a Lista de Materiais) a 37 ° C. Re-suspender o sedimento de células obtido a partir de cada cavidade com 500 uL de tampão de separação de células.
    2. Aplicar esta suspensão de células para um colunas de triagem magnéticos fixos pelo íman fornecido, lavar as colunas sobre o íman 3 vezes com tampão fresco de células de triagem, e recolher o fluxo de passagem como o magneticamente fracção insensível (mag-).
    3. Retirar as colunas do íman e recolher imediatamente a fracção de células de resposta magnética (MAG +) empurrando tampão de separação de células fresco através da coluna usando um êmbolo.
    4. Centrífuga tanto mag- e MAG + a 300 xg durante 10 min. Re-suspender o sedimento celular em PBS, contar as células e avaliar a viabilidade celular com um ensaio de exclusão com azul de Tripano 35. Usar o sedimento celular obtido quer por análise de longo prazo (isto é, re-semente e avaliar após 24, 48, e 72 h em cultura 17) ou directamente para a citometria de fluxo (passo 4.1.).
  4. Definir a carga de ferro das células transfectadas.
    Nota: Durante a preparação, qualquer contacto das sondas de células com materiais e instrumentos de óxido de ferro deve ser evitada.
    1. Recolher as células HUVEC transfectadas e de controlo não transfectadas (como no passo 4.1.1). Lavam-se as células recolhidas duas vezes em BSA a 2% em PBS 36 b y cuidadosamente mistura das células com 1 ml deste tampão de lavagem e, em seguida, centrifugação a 300 xg durante 10 min. Re-suspender o sedimento celular obtido em 250 ul de PBS, adiciona-se 100 mL de PFA a 4%, e incuba-se durante 20 minutos para fixar as células. Lavar 3 vezes com PBS, como descrito acima.
    2. Re-suspender o sedimento de células resultante fixado em 110 ul de PBS e transferi-lo para 100-pL tubos PCR.
      1. Tomar alíquotas de 10 uL para contagem de células e usar a amostra remanescente para a espectroscopia de partículas magnéticas (MPS).
    3. Realizar a medição em um dispositivo MPS disponível comercialmente. Durante a medição, aplicam-se as seguintes definições: campo magnético unidade B = 25 mT e freqüência f 0 = 25 kHz. Para a quantificação de ferro das amostras, normalizar a terceira harmónica A 3 do MPS-espectro para o correspondente A 3, Ref de uma amostra de referência MNP com uma quantidade conhecida de ferro de 2,1 ugxref "> 37. Use células não tratadas como controle.

7. Limites Definição de detecção MRI

  1. preparação celular.
    1. HUVECs sementes em uma placa de 6 poços e transfectar (2,5 pmol / cm 2 scr-miR, NP 25, e 15-25 pg / mL MNP) em duplicados ou triplicados de acordo com a quantidade necessária de células (para a preparação fantasma). Incubar as células durante 24 h e lavagem, recolher, e fixá-los com PFA a 4%, como descrito antes (passo 4).
    2. Contar as células obtidas, preparar alíquotas com números de células adequados (por exemplo, 10 3, 10 4, 10 5, etc), e ajustar o volume para 50 mL.
  2. preparação fantasma agarose
    1. Preparar várias camadas de 2% de agarose em tubos de 50 ml com quantidades diferentes de células transfectadas incorporados entre as camadas 38. Durante a preparação, sonicado e centrifugar a agarose quente para 38destruir as bolhas de ar que causam artefatos.
      NOTA: É importante, geles virtuais que continham 5.5 x 10 5 células HUVEC tratadas com complexos de miR / PEI não magnéticos devem ser preparado da mesma forma para servir como controlos.
  3. Digitalizar o obtido em fantasmas in vitro com um sistema de ressonância magnética de 7,1 T de animais após a colocação do fantasma centralmente na bobina, paralelo ao eixo z do campo magnético.
    1. Aplicar os seguintes parâmetros de sequência para uma aquisição de sequência de gradiente-eco: TR = 66 ms; TE 1 / TE 2 / TE 3 / TE 4 / TE 5 / TE 6 = 1,44 / 2,88 / 4,51 / 6,11 / 7,60 / 9,01 ms; aleta ângulo = 3 °; matriz = 128 × 128, interpolados para 256 x 256; campo de visão = 42 mm; 100%; médias = 1, comprimento do comboio echo = 1; espessura de corte = 1,5 mm; e 16 fatias.
    2. Avaliar o decaimento do sinal de todos os quatro tempos de eco e calcular mapas R2 * (R2 * = 1 / T2 *) utilizando software apropriado, tal como descrito noutro local 39.

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Resultados

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O principal objectivo do protocolo proposto é produzir células miR-modificados magneticamente responsivas e para realizar a sua caracterização exacta (Figura 1). Como resultado, as células transfectadas de forma eficiente, que respondem à selecção e orientação magnética e detectáveis ​​com MRI, deve ser obtida.

Em primeiro lugar, as identidades de HUVECs isolados foram confirmadas por coloração típica com o CD...

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Discussão

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A produção de células geneticamente modificadas carregados com nanopartículas superparamagnéticas para a sua orientação mais magneticamente controlada é apresentado no protocolo corrente. A aplicação bem sucedida desta estratégia permite a resolução de algumas dificuldades de terapia celular, como uma baixa retenção e pobre enxerto no local da lesão 2, 3, 4, através do fornecimento de um produto celular segmentado para transpla...

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Divulgações

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Nós não têm interesses financeiros concorrentes para divulgar.

Agradecimentos

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Nós gostaríamos de agradecer G. Fulda (Electron Microscopy Center, Universidade de Rostock, Alemanha) para o suporte técnico em adquirir imagens TEM de nanopartículas superparamagnéticas filtrados e na realização de sua análise de raios-X. O trabalho realizado no RTC Rostock foi apoiado pelo Ministério Federal da Educação e Pesquisa da Alemanha (FKZ 0312138A, FKZ 316159 e VIP + 03VP00241) eo Estado Mecklemburgo-Pomerânia Ocidental, com fundos estruturais da UE (FSE / IV-WM-B34- 0030/10 e FSE / IV-BM-B35-0010 / 12) e pela DFG (dA 1296-1), a Humidade-fundação, e a fundação do coração alemão (F / 01/12). Frank Wiekhorst foi apoiado pelo programa de investigação FP7 UE "NanoMag" FP7-NMP-2013-GRANDE-7.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PEI 25 kDaSigma Aldrich408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinaThermo Scientific21335
Colunas de dessalinização PD-10GE Healthcare17085101contendo Sephadex G-25 Solução de
reagente de ninidrina média 2%Sigma Aldrich7285
GlicinaSigma Aldrich410225
Kit de Quantificação de Biotina PierceThermo Scientific28005
Leitor de microplacas Modelo 680Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Partículas ParamagnéticasPromegaZ5481
Filtro Millex-HV PVDFMerckSLHV013SL0.45 µ m
Microscópio eletrônico de transmissão Libra 120ZeissAceleração de Tensão 120  kV
Detector de raios-X de safiraEDAX-Amatek
Plástico de cultura de célulasTPP
NHS-Esther Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-31
NHS-Esther Atto 488 ATTO-TEC GmbHAD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kitMirus BioMIR 9650
Biotina Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-71
Collagense Tipo IV GibcoThermo Scientific17104019
Meio de crescimento endotelial, EGM-2LonzaCC-3156 & CC-4176
Penicilina/EstreptomicinaThermo Scientific15140122100 U/mL, 100 µ g/mL
MatrigelBD Biosciences356234
anticorpo anti-PECAM-1Santa Cruzsc-1506
MS MACS colunasMiltenyi Biotec 130-042-201
Kit de Coloração de Células Vivas/Mortas Near-IRThermo ScientificL10119
Cy3 Controle Negativo Pré-miR Marcado com CoranteThermo ScientificAM17120"Cy3-miR" ou "Cyanine-miR3" no manuscrito
Moléculas Precursoras de miRNA Pre-miR - Controle Negativo Thermo ScientificAM17110"scr-miR" no manuscrito
Anti-has-miR92a-3p inibidor sintético Thermo ScientificAM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 sistemaZeiss
ParaformaldeídoSigma Aldrich158127solução a 4% em coloração nuclear PBS
DAPIThermo ScientificD1306
NucleoSpinMachery-Nagel740955
mirVanaThermo ScientificAM1560
TaqMan MicroRNA Kit de Transcrição ReversaThermo Scientific4366596
StepOnePlus Sistema de PCR em Tempo Realda Thermo Biosystems
Ensaio
has-miR-92aThermo Scientific000431Sequência de miRNA maduro: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready MixNippon GeneticsLS27
ITGA5 Ensaio TaqManThermo ScientificHs01547673_m1
RNU6B Ensaio TaqManThermo Scientific001093
18S rRNA Controle EndógenoThermo Scientific4333760F
GelatinaSigma AldrichG7041
CellTrace Calcein Red-OrangeThermo ScientificC34851
PBSPan BiotechP04-53500
BSASigma Aldrich
MACS bufferMiltenyi Biotec 130-091-221
AgaroseSigma AldrichA9539
7.1 Tesla sistema de ressonância magnética animalBruker CorporationA7906
ImageJ softwareNational Institutes of Healthatualizado com um dispositivo AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPSBruker Biospin
Matlab softwareMathworks
Anel Neodym Magnet magnets4you GmbHRM-10x04x05-Gø 10 mm; remanescência é ~ 1.3  T, coercividade ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging KitThermo ScientificC10340
FluorSave ReagenteMerck345789
banho ultrassônicoBandelin eletrônicoTipo: RK 100 SH
Kit de isolamento de RNA Kit de isolamento de miRNA Kit de Transcrição Reversa de cDNA de alta capacidade TaqMan 4368814

Referências

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